Este protocolo permitirá ao pesquisador dissecar artérias de interesse e isolar células vasculares para realizar uma ampla gama de testes funcionais. O pesquisador pode investigar diferentes leitos vasculares e tipo de célula para expandir o conhecimento da biologia celular vascular e do mecanismo da disfunção vascular. Este método é mais aplicável a pesquisadores que investigam a biologia celular vascular básica, bem como a disfunção celular vascular em modelos animais de doença.
Cuidados especiais devem ser tomados para otimizar o protocolo de digestão, especialmente quando os leitos vasculares de interesse diferem dos aqui apresentados. Para começar, prenda o mouse usando pinos de dissecção e pulverize a superfície ventral com etanol a 70%. Use fórceps para levantar a pele logo acima dos órgãos genitais e faça uma pequena incisão de aproximadamente dois milímetros na pele.
Insira a ponta da tesoura no local da incisão e faça uma incisão de quatro a cinco centímetros de comprimento na linha média, começando na incisão inicial e dissecando cranialmente até a base do esterno. Faça uma incisão de um centímetro que se estenda lateralmente a partir da linha média imediatamente abaixo do membro dianteiro. Faça uma incisão diagonal de um centímetro entre o membro posterior e os genitais.
Faça pequenos cortes ao longo das incisões da pele da linha média para descascar o tecido conjuntivo associado e expor o depósito adiposo subcutâneo. Identifique o tecido adiposo subcutâneo em forma de C e a artéria ou veia que corre perpendicularmente à cavidade abdominal. Comece a partir da parte inferior da forma de C perto dos órgãos genitais e segure suavemente o tecido adiposo para expor os tecidos conjuntivos.
Faça pequenos cortes no tecido conjuntivo para separar a gordura da pele e evite perturbar a vasculatura exposta. Continue dissecando o tecido conjuntivo até que o tecido adiposo subcutâneo possa ser removido intacto. Separe cuidadosamente a artéria exposta do tecido conjuntivo circundante.
Armazenar o adiposo subcutâneo isolado no tampão HEPES no gelo. Repita a dissecção para o depósito adiposo subcutâneo posterior restante. Para isolar o depósito adiposo mesentérico, use Graefe Forceps para levantar a fina parede da cavidade peritoneal acima da bexiga urinária e faça uma pequena incisão usando uma tesoura reta.
Levante lentamente a parede da cavidade peritoneal e insira a tesoura reta da íris no local da incisão. Faça uma incisão de quatro a cinco centímetros da bexiga urinária até o esterno. Em seguida, faça duas incisões horizontais de um centímetro com a tesoura reta da íris estendendo-se lateralmente da linha média até imediatamente acima do membro posterior e abaixo do membro dianteiro.
Use a pinça Graefe para descascar a musculatura abdominal e expor as vísceras peritoneais. Use um par de pinças número cinco para levantar os intestinos para fora da cavidade visceral para revelar o tecido adiposo mesentérico. Use a tesoura curva e a pinça número cinco para separar o tecido adiposo ao longo do cólon, começando do ceco até onde o cólon desce da vista.
Em seguida, separe o tecido adiposo ao longo do intestino delgado para o pâncreas. Remova uma pequena parte do pâncreas para isolar completamente o tecido adiposo mesentérico. Armazenar o adiposo mesentérico isolado no tampão HEPES no gelo.
Para isolar as artérias, primeiro transfira o tecido adiposo para um prato dissecante contendo 10 mililitros de tampão HEPES frio. Sob um microscópio estéreo, posicione o tecido adiposo subcutâneo para expor o par de veias arteriais. Posicione o tecido adiposo visceral para expor a forma da couve-flor e o respectivo par de veias arteriais.
Use o número 55 fórceps para remover cuidadosamente o tecido adiposo parenquimatoso da artéria. Remova pequenos pedaços de tecido adiposo de cada vez sem danificar a vasculatura de interesse. Continue até que as artérias estejam completamente vazias de tecido adiposo parenquimatoso.
Use a pinça número cinco para transferir as artérias limpas para um novo tubo com tampão HEPES fresco e mantenha-se no gelo até que esteja pronto para a digestão. Primeiro, adicione um miligrama cada de dispase e elastase a um tubo de microcentrífuga de dois mililitros. Adicione dois mililitros de solução de dissociação, vórtice, e incube a 37 graus Celsius até dissolver completamente.
Use a pinça número cinco para transferir as artérias limpas para os respectivos tubos de amostra. Incubar os tubos a 37 graus Celsius durante uma hora com agitação suave por inversão a cada 10 a 15 minutos. Enquanto isso, adicione um miligrama de colagenase tipo um por amostra a novos tubos.
Após a incubação, deixe as artérias se instalarem na parte inferior do tubo e transfira 500 microlitros do tampão do topo para os tubos contendo colagenase. Vórtice e devolver esta solução aos respectivos tubos de amostragem. Incubar as amostras a 37 graus Celsius por 15 minutos.
Certifique-se de que as artérias se separam em pedaços ao agitar o tubo de amostra. Usando uma pipeta de vidro, triturar vigorosamente o tecido digerido 10 a 15 vezes para dissociar mecanicamente as células. Passar as amostras digeridas através de um filtro de células de 70 mícrons ou de um filtro de tubo de citometria de fluxo para obter suspensões de célula única.
Centrifugar a suspensão de célula única e remover o sobrenadante. Ressuspeite o pellet celular em um mililitro de PBS com 5% BSA por 30 minutos. Adicione um microlitro de mancha de viabilidade celular e incube no escuro por 30 minutos.
Centrifugar a suspensão celular e ressuspender o pellet celular em 200 microlitros de PBS com 1%BSA. Adicione anticorpos primários conjugados a CD31 e CD45 e incube em um balancim na geladeira por 15 minutos. Lave as células adicionando um mililitro de PBS com 1% de BSA diretamente à suspensão celular.
Centrifugar a suspensão celular e ressuspender o pellet em 200 microlitros de formaldeído a 1% com BSA a 0,1%. Cubra os tubos com papel alumínio e guarde no frigorífico até estar pronto para a citometria de fluxo. Preparações celulares obtidas de artérias adiposas subcutâneas digeridas foram utilizadas para identificar as populações de células endoteliais por citometria de fluxo.
Células CD31 CD31 positivas CD45 negativas foram identificadas como células endoteliais. A coloração de viabilidade celular permitiu a identificação apenas das células viáveis que sobreviveram ao protocolo de isolamento e digestão antes da fixação. Para identificar as diferenças na expressão de proteínas de membrana e células endoteliais de vasculatura distinta de depósito adiposo, as células isoladas foram sondadas para translocase de ácidos graxos CD36.
Células endoteliais CD36 positivas foram identificadas no tecido adiposo subcutâneo e mesentérico. A quantificação da expressão de CD36 e das células endoteliais subcutâneas e mesentéricas revelou que tanto a porcentagem de células endoteliais expressando CD36 quanto a intensidade de expressão de CD36 foram maiores nas células endoteliais subcutâneas. É crucial dissecar, identificar e limpar cuidadosamente as artérias.
Mais importante ainda, o protocolo de digestão deve produzir um rendimento suficiente de células viáveis para aplicações a jusante. Após este procedimento, a população de células isoladas pode ser usada para aplicações, incluindo, mas não se limitando a, eletrofisiologia, perfil molecular e geração de linhagem celular primária para triagem de drogas in vitro.
