O besouro da batata Colorado é uma das pragas mais sérias da batata na zona temperada. Estudos da imunidade e patogênese desta praga são realizados principalmente na fase ativa. No entanto, na zona temperada, esta praga passa a maior parte do seu ciclo de vida em estado de hibernação.
Neste estudo, apresentamos um método para hibernação de besouro de batata Colorado e uma técnica para coleta de besouros no inverno. A principal vantagem deste método é que ele permite obter qualquer número de indivíduos durante o inverno para análise do vírus em qualquer período de hibernação. Use gaiolas feitas de uma estrutura rígida de madeira com um tamanho de 25 por 25 por 40 centímetros.
Para construir uma armação para a gaiola, use ripas de madeira com pelo menos dois centímetros de espessura e quatro centímetros de largura. Cubra o interior da gaiola com uma malha de aço inoxidável com um tamanho não superior a cinco por três milímetros. Fixe a malha com um grampeador de madeira.
Forre o interior da gaiola com um geotêxtil sintético preto com uma densidade de 60 gramas por metro quadrado. Fixe firmemente um tubo de tecido sintético translúcido respirável, com aproximadamente 60 centímetros de altura no topo da gaiola. Atravesse e fixe duas cordas fortes no fundo da gaiola para retirá-la do solo quando necessário.
Cavar um buraco no solo a 40 centímetros de profundidade. Coloque grama seca ou feno no buraco. Coloque a gaiola dentro de modo que o feno ou grama seca fique entre as paredes da gaiola e o solo.
Encha as gaiolas com terra do mesmo campo de batata onde os insetos são coletados. Instale registradores de dados de temperatura e umidade à prova d'água nas gaiolas nas profundidades necessárias. Plantar mudas de batata dentro da gaiola três a quatro semanas antes da introdução do besouro e regá-las moderadamente.
Fixe um tubo de tecido sintético verticalmente a um bastão de qualquer material instalado na parte externa da gaiola. Coletar manualmente besouros adultos nos campos de batata livres de pesticidas no final da vegetação de batata. Mantenha os besouros coletados em baldes plásticos de 20 litros contendo tampos de batata para alimentar os insetos antes de colocar nas gaiolas.
Cubra os baldes com um tecido respirável. Coloque no máximo 200 indivíduos dos besouros sobre as plantas de batata cobertas pela malha de tecido sintético. Quando as tampas de batata forem consumidas, adicione as frescas colocadas em um pote plástico contendo água e troque as tampas de batata diariamente depois.
Uma vez que todos os besouros escavados no solo para passar o inverno, desamarre o tubo de tecido sintético do bastão e deite o tecido para baixo. Remova a neve acima da superfície da gaiola. Solte a gaiola de cada lado com uma pá forte.
Puxe a gaiola para fora do solo usando cordas. Traga a gaiola para o laboratório. Retire o solo da gaiola em pequenas porções, quebre cuidadosamente grandes pedaços de terra e isole besouros usando pinças.
Separe besouros vivos de cadáveres. Os besouros vivos e saudáveis compactam o solo ao seu redor formando uma cavidade de ar, o chamado berço, e, portanto, são facilmente separados do solo. Os besouros mortos por fungos são mumificados ou têm micélio visível na superfície.
Os insetos em decomposição bacteriana são escuros. Peneire o solo através de uma peneira para garantir que todos os besouros estejam isolados e não danificados. Coloque cadáveres com sintomas de infecção fúngica ou decomposição bacteriana em um tubo Falcon estéril individual para identificação futura.
Armazene besouros vivos em uma geladeira a uma temperatura de 2 graus Celsius até a análise em recipientes ventilados fechados contendo uma bola de algodão úmida. Para coletar hemolinfa, faça uma punção na parte lateral do abdome sob a aorta com uma agulha de insulina. Para isolar o intestino, corte a cápsula da cabeça, esprema todo o conteúdo em uma placa de Petri com tampão fosfato.
Separe o intestino e limpe-o da gordura e dos vasos de Malpighi. Separe uma seção desejada do intestino, como o intestino anterior, médio ou posterior. Para isolar o corpo gorduroso, separe-o dos outros tecidos após o isolamento do intestino.
Para isolar fungos entomopatogênicos dos cadáveres, coloque os cadáveres mumificados em uma câmara de umidade estéril. Use conídios aéreos ou escleródios do conteúdo interno dos besouros para plaquear em ágar Sabouraud dextrose com ácido láctico a 0,4%. Isolar bactérias dos cadáveres com sintomas de decaimento bacteriano.
Corte a cabeça de um besouro, esprema o conteúdo interno e colete em tubos para posterior revestimento em meios para bactérias. Temperaturas abaixo de zero nas gaiolas, a uma profundidade de 30 centímetros, foram registradas do final de novembro ao início de abril. A temperatura média nesse período foi de 3,3 a 0,1 graus Celsius.
A menor temperatura registrada foi de 7,9 graus Celsius em meados de fevereiro. A mortalidade dos insetos aumentou durante a hibernação e atingiu um máximo na primavera antes da emergência. O número inicial de besouros foi de 2.000, dos quais 1.470 indivíduos sobreviveram.
Assim, a taxa de sobrevivência dos besouros durante a hibernação foi de 61%Uma análise de 530 cadáveres mostrou que durante o período de hibernação 53% deles foram caracterizados por sintomas de decomposição bacteriana e 25% foram caracterizados por sintomas de infecção fúngica. Beauveria dominou entre as culturas isoladas de fungos entomopatogênicos. Metarhizium, Cordyceps e Lecanicillium foram muito menos comuns.
Dentre as bactérias isoladas dos cadáveres com sintomas de decomposição bacteriana, foram identificadas espécies pertencentes aos gêneros Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, Serratia, Rahnella e Glutamicibacter. Usando este método pode resolver o problema de obter besouros de batata Colorado do campo no inverno. Ele permite obter tantos indivíduos quanto você precisa com a baixa taxa de mortalidade dos insetos.
O estudo de vários aspectos da hibernação dos besouros é importante tanto do ponto de vista fundamental quanto aplicado para melhorar a abordagem no controle desta praga. E, claro, essa técnica pode ser adaptada para outras espécies de insetos que passam o inverno no solo.
