Este protocolo oferece um método para mapear as forças moleculares geradas pelas células e, particularmente, pelas células imunes. O protocolo é fundamental para laboratórios interessados em estudar mecanotransdução em mecanobiologia. A principal vantagem desta técnica é que é super fácil e permite usar microscopia de fluorescência convencional para quantificar a transmissão de força em células imortalizadas e primárias.
Para começar, coloque as lamínulas de 25 milímetros em um rack de politetrafluoretileno em um copo de 50 mililitros e enxágue as lamínulas três vezes, submergindo-as em água. Misture volumes iguais de etanol e água e adicione 40 mililitros desta solução ao copo que contém a cremalheira e as lamínulas. Em seguida, sele o copo usando fita parafilm.
Limpe as tampas sonicando o copo por 15 minutos em um limpador ultrassônico e descarte o líquido após a sonicação. Em seguida, enxágue o copo que contém a cremalheira e as lamínulas com água pelo menos seis vezes para remover qualquer solvente orgânico restante. Para preparar uma solução fresca de piranha, adicione 30 mililitros de ácido sulfúrico a um copo de 50 mililitros e adicione lentamente 10 mililitros de peróxido de hidrogênio.
Misture suavemente a solução de piranha usando a extremidade de uma pipeta de vidro. Para iniciar o condicionamento, transfira o rack que contém as lamínulas para o copo contendo solução de piranha e incube por 30 minutos à temperatura ambiente para limpar e hidroxilar as lamínulas. Em seguida, transfira o rack usando pinças de aço ou politetrafluoretileno para um copo limpo de 50 mililitros e enxágue com água seis vezes.
Para remover completamente a água, mergulhe o rack que prende as tampas em um copo de 50 mililitros com 40 mililitros de etanol. Em seguida, descarte o etanol. Em seguida, imergir o rack em 40 mililitros de etanol contendo 3% de aminopropiltrietoxisilano por uma hora à temperatura ambiente para iniciar a reação com o grupo hidroxila nas lamínulas.
Enxágue a superfície das tampas seis vezes, submergindo-as em 40 mililitros de etanol e seque-as em forno a 80 graus Celsius por 20 minutos. Cubra o fundo interno da placa de Petri com uma fita parafilm para evitar que as tampas deslizem para dentro da placa de Petri. Em seguida, coloque as tampas cobertas de amina com o lado a ser funcionalizado com sondas de tensão de DNA voltadas para cima.
Cubra as lamínulas a 20 graus Celsius para uso futuro. Para modificar os grupos de amina nas lamínulas, adicione ácido lipóico PEG NHS e mPEG NHS e incube a placa de Petri à temperatura ambiente por uma hora. Ao final da incubação, enxaguar a superfície três vezes com água.
Depois disso, adicione 100 microlitros de bicarbonato de sódio 0,1 molar contendo um miligrama por mililitro de Sulfo-NHS-Acetato a um conjunto de lamínulas de sanduíche e incube por 30 minutos para que ocorra a passivação. Adicione 0,5 mililitros de nanopartículas de ouro a cada lamínula e incube por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, enxágue as lamínulas com água três vezes.
Depois de adicionar a fita Black Hole Quencher 2 à sonda de tensão de DNA recozido em uma proporção de dez para um, adicione 100 microlitros da mistura por duas lamínulas para fazer o sanduíche. Coloque cuidadosamente uma bola de tecido de laboratório molhada na placa de Petri longe das lamínulas e sele a placa com fita parafilm para evitar que a solução seque. Depois disso, cubra o prato com um papel alumínio e incube-o a quatro graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, monte a câmara de imagem, tomando cuidado para evitar rachaduras na superfície enquanto aperta a câmara. Em seguida, adicione 0,5 a um mililitro de Hank's Balanced Salt Solution à câmara de imagem. Use o canal Cy3B com uma objetiva de 100X para capturar sinais fluorescentes de células plaqueadas nas sondas de tensão hairpin de DNA quando elas começam a se espalhar.
Depois de preparar 100 microMolares não fluorescentes de fita de bloqueio, no ponto de tempo desejado, adicione-o às células em uma concentração final de um micromolar na câmara de imagem para armazenar o sinal de tensão e misturá-lo com as células por pipetagem. Após cerca de 10 minutos de bloqueio, adquira filmes de lapso de tempo ou imagens de ponto final em epifluorescência para mapeamento qualitativo de tensão e análise quantitativa. Uma superfície bem-sucedida tinha uma cor rosa pálido.
A alta qualidade da superfície foi demonstrada com um fundo limpo e a microscopia de contraste de interferência de reflexão ou canal RICM e intensidade de fluorescência uniforme no canal Cy3B. Imagens de lapso de tempo do bloqueio de tensão indicaram que os sinais de tensão TCR anti-CD3 epsilon e TCR-peptide-MHC foram amplificados devido ao bloqueio do hairpin e acúmulo de sinal. A fita de bloqueio registrou eventos de tração mecânica de curta duração do peptídeo TCR MHCN4 a partir de zero minutos, o que facilitou a análise quantitativa e revelou o padrão distinto da força MHC do peptídeo TCR que se assemelhava ao padrão bullseye das sinapses imunes.
A cada passo, sua intenção de preparação do substrato da sonda precisa de atenção aos detalhes e manuseio cuidadoso dos materiais. Essa tecnologia permite a visualização de forças moleculares transitórias que ocorrem na superfície celular quando ela interage com o ambiente, especialmente nas células imunes em busca de antígenos.
