Somos gratos ao Tissue Procurement Core e à Dra. Kristen Coleman da Universidade de Iowa por fornecer amostras de tumores de pacientes e à Dra. Sofia Gabrilovich no Departamento de Obstetrícia e Ginecologia por ajudar na geração do modelo DOP. Agradecemos também à Dra. Valerie Salvatico (Agilent, EUA) pela análise crítica do manuscrito. Reconhecemos as seguintes fontes de financiamento: NIH/NCI CA263783 e DOD CDMRP CA220729P1 para KWT; Cancer Research UK, Prostate Cancer UK, Prostate Cancer Foundation e Medical Research Council para JSdB. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho ou análise de experimentos ou decisão de publicar.

Imagem cinética automatizada para avaliação de medicamentos em organoides tumorais derivados de pacientes

<ol>
	<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Lohmussaar, K., Boretto, M., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-derived+model+systems+in+gynecological+cancer+research.">Human-derived model systems in gynecological cancer research.</a> Trends Cancer. 6 (12), 1031-1043 (2020).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity.">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>de Witte, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+ovarian+cancer+organoids+mimic+clinical+response+and+exhibit+heterogeneous+inter-+and+intrapatient+drug+responses.">Patient-derived ovarian cancer organoids mimic clinical response and exhibit heterogeneous inter- and intrapatient drug responses.</a> Cell Rep. 31 (11), 107762 (2020).</li><li>Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+and+cytotoxicity+assays.">Cell proliferation and cytotoxicity assays.</a> Curr Pharm Biotechnol. 17 (14), 1213-1221 (2016).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nat Protoc. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li><li>Alzeeb, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastric+cancer+cell+death+analyzed+by+live+cell+imaging+of+spheroids.">Gastric cancer cell death analyzed by live cell imaging of spheroids.</a> Sci Rep. 12 (1), 1488 (2022).</li><li>Deben, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrBITS:+label-free+and+time-lapse+monitoring+of+patient+derived+organoids+for+advanced+drug+screening.">OrBITS: label-free and time-lapse monitoring of patient derived organoids for advanced drug screening.</a> Cell Oncol (Dordr). 46 (2), 299-314 (2023).</li><li>Tamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+anticancer+agents+using+patient-derived+tumor+organoids+characteristically+similar+to+source+tissues).">Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues).</a> Oncol Rep. 40 (2), 635-646 (2018).</li><li>Le Compte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+tumor+organoid+drug+screening+using+widefield+live-cell+imaging+for+bulk+and+single-organoid+analysis.">Multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis.</a> J Vis Exp. 190, 64434 (2022).</li><li>Hanson, K. M., Finkelstein, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+accessible+and+high-throughput+strategy+of+continuously+monitoring+apoptosis+by+fluorescent+detection+of+caspase+activation.">An accessible and high-throughput strategy of continuously monitoring apoptosis by fluorescent detection of caspase activation.</a> Anal Biochem. 564-565, 96-101 (2019).</li><li>Isherwood, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+in+vitro+and+in+vivo+imaging+applications:+accelerating+drug+discovery.">Live cell in vitro and in vivo imaging applications: accelerating drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3 (2), 141-170 (2011).</li><li>Bi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+patient-derived+organoid+culture+of+gynecologic+cancers+for+disease+modeling+and+drug+sensitivity+testing.">Successful patient-derived organoid culture of gynecologic cancers for disease modeling and drug sensitivity testing.</a> Cancers (Basel). 13 (12), 2901 (2021).</li><li>Binaschi, M., Zunino, F., Capranico, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+action+of+DNA+topoisomerase+inhibitors.">Mechanism of action of DNA topoisomerase inhibitors.</a> Stem Cells. 13 (4), 369-379 (1995).</li><li>Park, Y. Y., Ahn, J. H., Cho, M. G., Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+depletion+during+mitotic+arrest+induces+mitotic+slippage+and+APC/C(Cdh1)-dependent+cyclin+B1+degradation.">ATP depletion during mitotic arrest induces mitotic slippage and APC/C(Cdh1)-dependent cyclin B1 degradation.</a> Exp Mol Med. 50 (4), 1-14 (2018).</li><li>Lukonin, I., Zinner, M., Liberali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+image-based+phenotypic+chemical+screens.">Organoids in image-based phenotypic chemical screens.</a> Exp Mol Med. 53 (10), 1495-1502 (2021).</li><li>Herpers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+patient-derived+organoid+screenings+identify+MCLA-158+as+a+therapeutic+EGFR+x+LGR5+bispecific+antibody+with+efficacy+in+epithelial+tumors.">Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors.</a> Nat Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).</li><li>Ramm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+live+and+fixed+cell+imaging+method+to+screen+matrigel-embedded+organoids.">High-throughput live and fixed cell imaging method to screen matrigel-embedded organoids.</a> Organoids. 2 (1), 1-19 (2023).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nat Protoc. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>Van Hemelryk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+analysis+and+high-content+live-cell+imaging+for+drug+testing+in+prostate+cancer+xenograft-derived+organoids.">Viability analysis and high-content live-cell imaging for drug testing in prostate cancer xenograft-derived organoids.</a> Cells. 12 (10), 1377 (2023).</li><li>Bi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+tyrosine+kinase+anti-angiogenic+cediranib+over+bevacizumab:+Cell+cycle+abrogation+and+synergy+with+chemotherapy.">Advantages of tyrosine kinase anti-angiogenic cediranib over bevacizumab: Cell cycle abrogation and synergy with chemotherapy.</a> Pharmaceuticals (Basel). 14 (7), 682 (2021).</li><li>Bi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+autophagy+overcomes+resistance+to+dual+histone+deacetylase+and+proteasome+inhibition+in+gynecologic+cancer).">Blocking autophagy overcomes resistance to dual histone deacetylase and proteasome inhibition in gynecologic cancer).</a> Cell Death Dis. 13 (1), 59 (2022).</li><li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B7-H3+as+a+Therapeutic+target+in+advanced+prostate+cancer.">B7-H3 as a Therapeutic target in advanced prostate cancer.</a> Eur Urol. 83 (3), 224-238 (2023).</li><li>Gil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER3+is+an+actionable+target+in+advanced+prostate+cancer.">HER3 is an actionable target in advanced prostate cancer.</a> Cancer Res. 81 (24), 6207-6218 (2021).</li></ol>

A KWT é coproprietária da Immortagen Inc., CJD é funcionária da Agilent. JSdB atuou em conselhos consultivos e recebeu honorários da Amgen, Astra Zeneca, Astellas, Bayer, Bioxcel Therapeutics, Boehringer Ingelheim, Cellcentric, Daiichi, Eisai, Genentech/Roche, Genmab, GSK, Harpoon, ImCheck Therapeutics, Janssen, Merck Serono, Merck Sharp & Dohme, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Pfizer, Qiagen, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Terumo e Vertex Pharmaceuticals; é um funcionário do Instituto de Pesquisa do Câncer (ICR), que recebeu financiamento ou outro apoio para seu trabalho de pesquisa da AZ, Astellas, Bayer, Cellcentric, Daiichi, Genentech, Genmab, GSK, Janssen, Merck Serono, MSD, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Pfizer e Vertex, e que tem um interesse comercial em abiraterona, inibição PARP em cânceres defeituosos de reparo de DNA, e inibidores da via PI3K/AKT (sem renda pessoal); foi nomeado como inventor, sem juros financeiros, da patente 8 822 438, apresentada pela Janssen, que abrange o uso de acetato de abiraterona com corticosteroides; tem sido o IC/PI de muitos ensaios clínicos patrocinados pela indústria; e é Investigador Sênior do National Institute for Health Research (NIHR). Nenhum outro autor tem qualquer potencial conflito de interesses a declarar.

As culturas de DOP estão se tornando um sistema modelo in vitro cada vez mais popular devido à sua capacidade de refletir respostas e comportamentos celulares2. Avanços significativos foram feitos nas técnicas de geração, cultura e expansão de DOP, mas os métodos para analisar as respostas terapêuticas ficaram para trás. Os kits de viabilidade 3D disponíveis comercialmente são ensaios de desfecho lítico, perdendo dados de resposta cinética potencialmente valiosos e limitando análise...

Organoides tumorais derivados de pacientes (DOPs) estão emergindo rapidamente como um sistema modelo robusto para estudar o desenvolvimento de câncer e respostas terapêuticas. As DOPs são sistemas tridimensionais (3D) de cultura celular que recapitulam o complexo perfil genômico e a arquiteturado tumor primário1,2. Ao contrário das culturas bidimensionais (2D) tradicionais de linhagens celulares de câncer imortalizadas, as DOPs capturam e mantêm a heterogeneidade intratumoral 3,4, tornando-as uma ferramenta valiosa para pesquisas mecanicistas e translacionais. Embora as DOPs estejam se tornando um sistema modelo cada vez mais popular, os reagentes comercialmente disponíveis e os métodos de análise para efeitos celulares compatíveis com culturas de DOP são limitados.
A falta de métodos robustos para analisar mudanças sutis na resposta ao tratamento dificulta a tradução clínica. O reagente de saúde celular padrão-ouro em culturas 3D, CellTiter-Glo 3D, utiliza os níveis de ATP como determinante da viabilidade celular 5,6. Embora esse reagente seja útil para ensaios de desfecho, há várias ressalvas, principalmente a incapacidade de usar amostras para outros fins após a conclusão do ensaio.
A imagem de células vivas é uma forma sofisticada de microscopia cinética que, quando combinada com reagentes fluorescentes, tem a capacidade de quantificar uma variedade de leituras de saúde celular dentro de modelos de DOP, incluindo apoptose 7,8,9 e citotoxicidade10. De fato, imagens de células vivas têm sido parte integrante da triagem de compostos em plataformas 2D com alto rendimento11,12. Sistemas como o Incucyte tornaram a tecnologia acessível e, portanto, acessível a grupos de pesquisa em uma variedade de cenários. No entanto, a aplicação desses sistemas para analisar culturas 3D ainda está engatinhando.
Neste artigo, descrevemos um método para avaliar a resposta a drogas em modelos de câncer com DOP usando imagens multiplexadas de células vivas (Figura 1). Através da análise de imagens de campo claro, mudanças no tamanho e morfologia da DOP podem ser monitoradas cineticamente. Além disso, os processos celulares podem ser quantificados simultaneamente ao longo do tempo usando reagentes fluorescentes, como o corante vermelho Anexina V para apoptose e o corante verde Cytotox para citotoxicidade. Os métodos apresentados são otimizados para o sistema de imagem de células vivas Cytation 5, mas este protocolo pode ser adaptado em diferentes plataformas de imagem de células vivas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrfuge tube</td>
			<td>Dot Scientific Inc</td>
			<td>1008113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>554 NM LED Cube</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1225012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3596</td>
			<td>Prewarmed to 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>204626-100</td>
			<td>Prewarmed to 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>component of organoid culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Final concentration is 1x (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek BioSpa 8 Automated Incubator</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>BIOSPAG-SN</td>
			<td>Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>CYT5PW-SN</td>
			<td>Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BME001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daunorubicin HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3035</td>
			<td>Reconstituted in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1099</td>
			<td>Final concentration is 10 &#181;M (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Final concentration is 1x (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>AF-100-15-1MG</td>
			<td>Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-10 Recombinant Protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>100-26-1MG</td>
			<td>Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human R-Spondin 1 Recombinant Protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>120-38-5UG</td>
			<td>Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone Stock Solution</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7926</td>
			<td>Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Filter Cube- GFP</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1225101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Filter Cube- TRITC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1225125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging LED GFP/CFP</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1225001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Annexin V Red Dye</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4641</td>
			<td>Reconstituted in organoid culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Cytotox Green Dye</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4633</td>
			<td>DMSO solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td>Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>13366169</td>
			<td>Add 1:50 volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6057-NG</td>
			<td>Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-05</td>
			<td>Final concentration is 100 &#181;g/mL (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Heregulin&#946;-1</td>
			<td>Pepro Tech</td>
			<td>100-03</td>
			<td>Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine solution from Streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632, CAS 331752-47-7</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>688000</td>
			<td>Final concentration is 5 &#181;M (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Estradiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2758</td>
			<td>Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed live-cell imaging for drug responses in patient-derived organoid models of cancer

Modelos organoides derivados do paciente (DOP) de câncer são um sistema de pesquisa multifuncional que recapitula melhor a doença humana em comparação com linhagens de células cancerosas. Modelos de DOP podem ser gerados pela cultura de células tumorais de pacientes em extratos extracelulares da membrana basal (EMB) e plaqueando-os como cúpulas tridimensionais. No entanto, reagentes comercialmente disponíveis que foram otimizados para ensaios fenotípicos em culturas de monocamada muitas vezes não são compatíveis com EMB. Neste artigo, descrevemos um método para plaquear modelos de DOP e avaliar os efeitos de drogas usando um sistema automatizado de imagens de células vivas. Além disso, aplicamos corantes fluorescentes compatíveis com medidas cinéticas para quantificar a saúde celular e a apoptose simultaneamente. A captura de imagem pode ser personalizada para ocorrer em intervalos de tempo regulares ao longo de vários dias. Os usuários podem analisar os efeitos da droga em imagens individuais do plano Z ou uma projeção Z de imagens seriais de múltiplos planos focais. Usando mascaramento, parâmetros específicos de interesse são calculados, como número de DOP, área e intensidade de fluorescência. Fornecemos dados de prova de conceito demonstrando o efeito de agentes citotóxicos na saúde celular, apoptose e viabilidade. Esta plataforma de imagem cinética automatizada pode ser expandida para outras leituras fenotípicas para entender diversos efeitos terapêuticos em modelos de PDO de câncer.

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are rapidly emerging as a robust model system to study cancer development and therapeutic responses. PDOs are three-dimensional (3D) cell culture systems that recapitulate the complex genomic profile and architecture of the primary tumor1,2. Unlike traditional two-dimensional (2D) cultures of immortalized cancer cell lines, PDOs capture and maintain intratumoral heterogeneity3,4, making them a valuable tool for both mechanistic and translational research. Although PDOs are becoming an increasingly popular model system, commercially available reagents and analysis methods for cellular effects that are compatible with PDO cultures are limited.
The lack of robust methods to analyze subtle changes in treatment response hinders clinical translation. The gold standard cell health reagent in 3D cultures, CellTiter-Glo 3D, utilizes ATP levels as a determinant of cell viability5,6. While this reagent is useful for endpoint assays, there are several caveats, most notably the inability to use samples for other purposes after completion of the assay.
Live-cell imaging is a sophisticated form of kinetic microscopy that, when combined with fluorescent reagents, has the capacity to quantify a variety of cell health readouts within PDO models, including apoptosis7,8,9 and cytotoxicity10. Indeed, live-cell imaging has been integral to high throughput screening of compounds in 2D platforms11,12. Systems such as the Incucyte have made the technology affordable and thus accessible to research groups in a variety of settings. However, the application of these systems to analyze 3D cultures is still in its infancy.
Herein, we describe a method to assess drug response in PDO models of cancer using multiplexed live-cell imaging (Figure 1). Through analysis of bright field images, changes in PDO&#160;size and morphology can be kinetically monitored. Furthermore, cellular processes can be simultaneously quantified over time using fluorescent reagents, such as Annexin V Red Dye for apoptosis and Cytotox Green Dye for cytotoxicity. The methods presented are optimized for the Cytation 5 live-cell imaging system, but this protocol may be adapted across different live-cell imaging platforms.

Autor em destaque: Desenvolvimento de ensaios cinéticos multiplexados para análise de resposta a medicamentos baseada em organoides

Imagem Multiplexada de Células Vivas para Respostas a Drogas em Modelos de Câncer Organoides Derivados de Pacientes

We apply patient derived organoid models, which are created from actual patient tumor specimens to examine how the tumors respond to drugs. We can also define the molecular characteristics that correlate with response. These results are then used to prioritize the best new therapies to advance in the clinical trials in the future.One of the main challenges in using patient derived organoid models is that they are a finite resource. In addition, there are very few off the shelf kits to assess drug response in organoid models that preserve the sample in a format that allows for other downstream analyses, such as transcriptomic profiling. We developed a multiplexed approach to kinetically monitor therapeutic response in organoid models.We use fluorescent dyes that are specific to different cellular processes, which provides insight into the mechanism of drug activity in each organoid model. In a single experiment we collect both functional and time course data and the samples are available for other assays. This method can be applied to assess response to a broad range of therapeutic modalities beyond small molecule inhibitors, including radiation sensitivity.We are also continuing to innovate by developing tools for other cellular phenotypes that can be kinetically measured, such as senescence.

Nosso objetivo foi demonstrar a viabilidade do uso de imagens multiplexadas de células vivas para avaliar a resposta terapêutica da DOP. Experimentos de prova de conceito foram realizados em dois modelos separados de DOP de câncer de endométrio: ONC-10817 e ONC-10811 (veja a Figura Suplementar 1 e a Figura Suplementar 2 para dados do ONC-10811). A apoptose (coloração da anexina V) e a citotoxicidade (captação do Cytotox Green) foram monitoradas cineticamente em resposta ao agente...

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Organoides tumorais derivados de pacientes são um sofisticado sistema modelo para pesquisa básica e translacional. Este artigo de métodos detalha o uso de imagens de células vivas fluorescentes multiplexadas para avaliação cinética simultânea de diferentes fenótipos organoides.

Patient-derived organoid (PDO) models of cancer are a multifunctional research system that better recapitulates human disease as compared to cancer cell ...

Aplicamos modelos organoides derivados de pacientes, que são criados a partir de espécimes tumorais reais de pacientes para examinar como os tumores respondem a drogas. Podemos também definir as características moleculares que se correlacionam com a resposta. Esses resultados são usados para priorizar as melhores novas terapias para avançar nos ensaios clínicos no futuro.Um dos principais desafios no uso de modelos organoides derivados de pacientes é que eles são um recurso finito. Além disso, há muito poucos kits prontos para avaliar a resposta a drogas em modelos organoides que preservam a amostra em um formato que permita outras análises a jusante, como o perfil transcriptômico. Desenvolvemos uma abordagem multiplexada para monitorar cineticamente a resposta terapêutica em modelos organoides.Utilizamos corantes fluorescentes específicos para diferentes processos celulares, o que fornece informações sobre o mecanismo de atividade da droga em cada modelo organoide. Em um único experimento, coletamos dados funcionais e de curso de tempo e as amostras estão disponíveis para outros ensaios. Este método pode ser aplicado para avaliar a resposta a uma ampla gama de modalidades terapêuticas além dos inibidores de pequenas moléculas, incluindo a sensibilidade à radiação.Também continuamos inovando desenvolvendo ferramentas para outros fenótipos celulares que podem ser medidos cineticamente, como a senescência.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer

781 visualizações.  University of Iowa. Aplicamos modelos organoides derivados de pacientes, que são criados a partir de espécimes tumorais reais de pacientes para examinar como os tumores respondem a drogas. Podemos também definir as características moleculares que se correlacionam com a resposta. Esses resultados são usados para priorizar as melhores novas terapias para avançar nos ensaios clínicos no futuro.Um dos principais desafios no uso de modelos organoides derivados de pacientes é que eles são um recurso fi...