Hasta tümör örnekleri sağladıkları için Iowa Üniversitesi'nden Doku Tedarik Çekirdeği ve Dr. Kristen Coleman'a ve PDO modeli oluşturmaya yardımcı olduğu için Kadın Hastalıkları ve Doğum Bölümü'nden Dr. Sofia Gabrilovich'e minnettarız. Ayrıca makalenin eleştirel analizi için Dr. Valerie Salvatico'ya (Agilent, ABD) teşekkür ederiz. Aşağıdaki finansman kaynaklarını kabul ediyoruz: KWT'ye CA220729P1 NIH/NCI CA263783 ve DOD CDMRP; İngiltere Kanser Araştırmaları, Prostat Kanseri İngiltere, Prostat Kanseri Vakfı ve JSdB Tıbbi Araştırma Konseyi. Fon sağlayıcıların deneylerin tasarımında veya analizinde veya yayınlama kararında hiçbir rolü yoktu.

Hasta Kaynaklı Tümör Organoidlerinde İlaç Değerlendirmesi için Otomatik Kinetik Görüntüleme

<ol>
	<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Lohmussaar, K., Boretto, M., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-derived+model+systems+in+gynecological+cancer+research.">Human-derived model systems in gynecological cancer research.</a> Trends Cancer. 6 (12), 1031-1043 (2020).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity.">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>de Witte, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+ovarian+cancer+organoids+mimic+clinical+response+and+exhibit+heterogeneous+inter-+and+intrapatient+drug+responses.">Patient-derived ovarian cancer organoids mimic clinical response and exhibit heterogeneous inter- and intrapatient drug responses.</a> Cell Rep. 31 (11), 107762 (2020).</li><li>Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+and+cytotoxicity+assays.">Cell proliferation and cytotoxicity assays.</a> Curr Pharm Biotechnol. 17 (14), 1213-1221 (2016).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nat Protoc. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li><li>Alzeeb, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastric+cancer+cell+death+analyzed+by+live+cell+imaging+of+spheroids.">Gastric cancer cell death analyzed by live cell imaging of spheroids.</a> Sci Rep. 12 (1), 1488 (2022).</li><li>Deben, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrBITS:+label-free+and+time-lapse+monitoring+of+patient+derived+organoids+for+advanced+drug+screening.">OrBITS: label-free and time-lapse monitoring of patient derived organoids for advanced drug screening.</a> Cell Oncol (Dordr). 46 (2), 299-314 (2023).</li><li>Tamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+anticancer+agents+using+patient-derived+tumor+organoids+characteristically+similar+to+source+tissues).">Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues).</a> Oncol Rep. 40 (2), 635-646 (2018).</li><li>Le Compte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+tumor+organoid+drug+screening+using+widefield+live-cell+imaging+for+bulk+and+single-organoid+analysis.">Multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis.</a> J Vis Exp. 190, 64434 (2022).</li><li>Hanson, K. M., Finkelstein, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+accessible+and+high-throughput+strategy+of+continuously+monitoring+apoptosis+by+fluorescent+detection+of+caspase+activation.">An accessible and high-throughput strategy of continuously monitoring apoptosis by fluorescent detection of caspase activation.</a> Anal Biochem. 564-565, 96-101 (2019).</li><li>Isherwood, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+in+vitro+and+in+vivo+imaging+applications:+accelerating+drug+discovery.">Live cell in vitro and in vivo imaging applications: accelerating drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3 (2), 141-170 (2011).</li><li>Bi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+patient-derived+organoid+culture+of+gynecologic+cancers+for+disease+modeling+and+drug+sensitivity+testing.">Successful patient-derived organoid culture of gynecologic cancers for disease modeling and drug sensitivity testing.</a> Cancers (Basel). 13 (12), 2901 (2021).</li><li>Binaschi, M., Zunino, F., Capranico, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+action+of+DNA+topoisomerase+inhibitors.">Mechanism of action of DNA topoisomerase inhibitors.</a> Stem Cells. 13 (4), 369-379 (1995).</li><li>Park, Y. Y., Ahn, J. H., Cho, M. G., Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+depletion+during+mitotic+arrest+induces+mitotic+slippage+and+APC/C(Cdh1)-dependent+cyclin+B1+degradation.">ATP depletion during mitotic arrest induces mitotic slippage and APC/C(Cdh1)-dependent cyclin B1 degradation.</a> Exp Mol Med. 50 (4), 1-14 (2018).</li><li>Lukonin, I., Zinner, M., Liberali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+image-based+phenotypic+chemical+screens.">Organoids in image-based phenotypic chemical screens.</a> Exp Mol Med. 53 (10), 1495-1502 (2021).</li><li>Herpers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+patient-derived+organoid+screenings+identify+MCLA-158+as+a+therapeutic+EGFR+x+LGR5+bispecific+antibody+with+efficacy+in+epithelial+tumors.">Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors.</a> Nat Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).</li><li>Ramm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+live+and+fixed+cell+imaging+method+to+screen+matrigel-embedded+organoids.">High-throughput live and fixed cell imaging method to screen matrigel-embedded organoids.</a> Organoids. 2 (1), 1-19 (2023).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nat Protoc. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>Van Hemelryk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+analysis+and+high-content+live-cell+imaging+for+drug+testing+in+prostate+cancer+xenograft-derived+organoids.">Viability analysis and high-content live-cell imaging for drug testing in prostate cancer xenograft-derived organoids.</a> Cells. 12 (10), 1377 (2023).</li><li>Bi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+tyrosine+kinase+anti-angiogenic+cediranib+over+bevacizumab:+Cell+cycle+abrogation+and+synergy+with+chemotherapy.">Advantages of tyrosine kinase anti-angiogenic cediranib over bevacizumab: Cell cycle abrogation and synergy with chemotherapy.</a> Pharmaceuticals (Basel). 14 (7), 682 (2021).</li><li>Bi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+autophagy+overcomes+resistance+to+dual+histone+deacetylase+and+proteasome+inhibition+in+gynecologic+cancer).">Blocking autophagy overcomes resistance to dual histone deacetylase and proteasome inhibition in gynecologic cancer).</a> Cell Death Dis. 13 (1), 59 (2022).</li><li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B7-H3+as+a+Therapeutic+target+in+advanced+prostate+cancer.">B7-H3 as a Therapeutic target in advanced prostate cancer.</a> Eur Urol. 83 (3), 224-238 (2023).</li><li>Gil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER3+is+an+actionable+target+in+advanced+prostate+cancer.">HER3 is an actionable target in advanced prostate cancer.</a> Cancer Res. 81 (24), 6207-6218 (2021).</li></ol>

KWT, Immortagen Inc.'in ortak sahibidir. CJD, Agilent'in bir çalışanıdır. JSdB, Amgen, Astra Zeneca, Astellas, Bayer, Bioxcel Therapeutics, Boehringer Ingelheim, Cellcentric, Daiichi, Eisai, Genentech/Roche, Genmab, GSK, Harpoon, ImCheck Therapeutics, Janssen, Merck Serono, Merck Sharp & Dohme, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Pfizer, Qiagen, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Terumo ve Vertex Pharmaceuticals'tan danışma kurullarında görev almış ve ücret almıştır; AZ, Astellas, Bayer, Cellcentric, Daiichi, Genentech, Genmab, GSK, Janssen, Merck Serono, MSD, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Pfizer ve Vertex'ten araştırma çalışmaları için fon veya başka destek almış olan ve DNA onarımı kusurlu kanserlerde abirateron, PARP inhibisyonu ile ticari ilgisi olan Kanser Araştırmaları Enstitüsü'nün (ICR) bir çalışanıdır. ve PI3K/AKT yolu inhibitörleri (kişisel gelir yok); Janssen tarafından sunulan ve abirateron asetatın kortikosteroidlerle kullanımını kapsayan 8 822 438 numaralı patent için hiçbir mali çıkarı olmayan bir mucit olarak adlandırıldı; endüstri destekli birçok klinik araştırmanın CI/PI'si olmuştur; ve Ulusal Sağlık Araştırmaları Enstitüsü (NIHR) Kıdemli Araştırmacısıdır. Başka hiçbir yazarın ifşa edilecek herhangi bir potansiyel çıkar çatışması yoktur.

PDO kültürleri, hücresel tepkileri ve davranışları yansıtma yetenekleri nedeniyle giderek daha popüler bir in vitro model sistemi haline gelmektedir2. PDO üretimi, kültürü ve genişletme tekniklerinde önemli ilerlemeler kaydedilmiştir, ancak terapötik yanıtları analiz etme yöntemleri gecikmiştir. Ticari olarak temin edilebilen 3D canlılık kitleri, potansiyel olarak değerli kinetik yanıt verilerini kaçıran ve sonraki analizleri diğer yöntemlerle sınırlayan<sup class="xr...

Hasta kaynaklı tümör organoidleri (PDO'lar), kanser gelişimini ve terapötik yanıtları incelemek için sağlam bir model sistem olarak hızla ortaya çıkmaktadır. PDO'lar, primer tümörün karmaşık genomik profilini ve mimarisini özetleyenüç boyutlu (3D) hücre kültürü sistemleridir 1,2. Ölümsüzleştirilmiş kanser hücre hatlarının geleneksel iki boyutlu (2D) kültürlerinden farklı olarak, PDO'lar intratümöral heterojenliği yakalar ve korur 3,4, bu da onları hem mekanik hem de translasyonel araştırmalar için değerli bir araç haline getirir. PDO'lar giderek daha popüler bir model sistem haline gelmesine rağmen, PDO kültürleriyle uyumlu hücresel etkiler için ticari olarak temin edilebilen reaktifler ve analiz yöntemleri sınırlıdır.
Tedavi yanıtındaki ince değişiklikleri analiz etmek için sağlam yöntemlerin olmaması klinik çeviriyi engellemektedir. 3D kültürlerde altın standart hücre sağlığı reaktifi olan CellTiter-Glo 3D, hücre canlılığının belirleyicisi olarak ATP seviyelerini kullanır 5,6. Bu reaktif, uç nokta tahlilleri için yararlı olsa da, en önemlisi, tahlilin tamamlanmasından sonra numunelerin başka amaçlar için kullanılamaması olmak üzere birkaç uyarı vardır.
Canlı hücre görüntüleme, floresan reaktiflerle birleştirildiğinde, apoptoz 7,8,9 ve sitotoksisite10 dahil olmak üzere PDO modellerinde çeşitli hücre sağlığı okumalarını ölçme kapasitesine sahip sofistike bir kinetik mikroskopi şeklidir. Gerçekten de, canlı hücre görüntüleme, 2D platformlarda bileşiklerin yüksek verimli taramasının ayrılmaz bir parçası olmuştur11,12. Incucyte gibi sistemler, teknolojiyi uygun fiyatlı hale getirdi ve böylece çeşitli ortamlarda araştırma grupları için erişilebilir hale getirdi. Bununla birlikte, bu sistemlerin 3D kültürleri analiz etmek için uygulanması henüz emekleme aşamasındadır.
Burada, çoğullanmış canlı hücre görüntüleme kullanarak kanserin PDO modellerinde ilaç yanıtını değerlendirmek için bir yöntem tanımlanmıştır (Şekil 1). Parlak alan görüntülerinin analizi yoluyla, PDO boyutu ve morfolojisindeki değişiklikler kinetik olarak izlenebilir. Ayrıca, hücresel süreçler, apoptoz için Annexin V Kırmızı Boya ve sitotoksisite için Sitotoks Yeşil Boya gibi floresan reaktifler kullanılarak zaman içinde eşzamanlı olarak ölçülebilir. Sunulan yöntemler, Cytation 5 canlı hücre görüntüleme sistemi için optimize edilmiştir, ancak bu protokol farklı canlı hücre görüntüleme platformlarına uyarlanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrfuge tube</td>
			<td>Dot Scientific Inc</td>
			<td>1008113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>554 NM LED Cube</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1225012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3596</td>
			<td>Prewarmed to 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>204626-100</td>
			<td>Prewarmed to 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>component of organoid culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Final concentration is 1x (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek BioSpa 8 Automated Incubator</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>BIOSPAG-SN</td>
			<td>Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>CYT5PW-SN</td>
			<td>Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BME001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daunorubicin HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3035</td>
			<td>Reconstituted in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1099</td>
			<td>Final concentration is 10 &#181;M (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Final concentration is 1x (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>AF-100-15-1MG</td>
			<td>Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-10 Recombinant Protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>100-26-1MG</td>
			<td>Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human R-Spondin 1 Recombinant Protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>120-38-5UG</td>
			<td>Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone Stock Solution</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7926</td>
			<td>Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Filter Cube- GFP</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1225101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Filter Cube- TRITC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1225125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging LED GFP/CFP</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1225001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Annexin V Red Dye</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4641</td>
			<td>Reconstituted in organoid culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Cytotox Green Dye</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4633</td>
			<td>DMSO solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td>Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>13366169</td>
			<td>Add 1:50 volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6057-NG</td>
			<td>Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-05</td>
			<td>Final concentration is 100 &#181;g/mL (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Heregulin&#946;-1</td>
			<td>Pepro Tech</td>
			<td>100-03</td>
			<td>Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine solution from Streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632, CAS 331752-47-7</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>688000</td>
			<td>Final concentration is 5 &#181;M (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Estradiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2758</td>
			<td>Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed live-cell imaging for drug responses in patient-derived organoid models of cancer

Hasta kaynaklı organoid (PDO) kanser modelleri, kanser hücre dizilerine kıyasla insan hastalıklarını daha iyi özetleyen çok işlevli bir araştırma sistemidir. PDO modelleri, hücre dışı bazal membran ekstraktlarında (BME) hasta tümör hücrelerinin kültürlenmesi ve üç boyutlu kubbeler olarak kaplanmasıyla oluşturulabilir. Bununla birlikte, tek katmanlı kültürlerde fenotipik testler için optimize edilmiş ticari olarak temin edilebilen reaktifler genellikle BME ile uyumlu değildir. Burada, otomatik bir canlı hücre görüntüleme sistemi kullanarak PDO modellerini plakalamak ve ilaç etkilerini değerlendirmek için bir yöntem açıklıyoruz. Ek olarak, hücre sağlığını ve apoptozu aynı anda ölçmek için kinetik ölçümlerle uyumlu floresan boyalar uyguluyoruz. Görüntü yakalama, birkaç gün boyunca düzenli zaman aralıklarında gerçekleşecek şekilde özelleştirilebilir. Kullanıcılar, tek tek Z-düzlemi görüntülerinde veya birden fazla odak düzleminden seri görüntülerin Z Projeksiyonunda ilaç etkilerini analiz edebilir. Maskeleme kullanılarak, PDO sayısı, alan ve floresan yoğunluğu gibi ilgilenilen belirli parametreler hesaplanır. Sitotoksik ajanların hücre sağlığı, apoptoz ve canlılık üzerindeki etkisini gösteren kavram kanıtı verileri sağlıyoruz. Bu otomatik kinetik görüntüleme platformu, PDO kanser modellerindeki çeşitli terapötik etkileri anlamak için diğer fenotipik okumalara genişletilebilir.

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are rapidly emerging as a robust model system to study cancer development and therapeutic responses. PDOs are three-dimensional (3D) cell culture systems that recapitulate the complex genomic profile and architecture of the primary tumor1,2. Unlike traditional two-dimensional (2D) cultures of immortalized cancer cell lines, PDOs capture and maintain intratumoral heterogeneity3,4, making them a valuable tool for both mechanistic and translational research. Although PDOs are becoming an increasingly popular model system, commercially available reagents and analysis methods for cellular effects that are compatible with PDO cultures are limited.
The lack of robust methods to analyze subtle changes in treatment response hinders clinical translation. The gold standard cell health reagent in 3D cultures, CellTiter-Glo 3D, utilizes ATP levels as a determinant of cell viability5,6. While this reagent is useful for endpoint assays, there are several caveats, most notably the inability to use samples for other purposes after completion of the assay.
Live-cell imaging is a sophisticated form of kinetic microscopy that, when combined with fluorescent reagents, has the capacity to quantify a variety of cell health readouts within PDO models, including apoptosis7,8,9 and cytotoxicity10. Indeed, live-cell imaging has been integral to high throughput screening of compounds in 2D platforms11,12. Systems such as the Incucyte have made the technology affordable and thus accessible to research groups in a variety of settings. However, the application of these systems to analyze 3D cultures is still in its infancy.
Herein, we describe a method to assess drug response in PDO models of cancer using multiplexed live-cell imaging (Figure 1). Through analysis of bright field images, changes in PDO&#160;size and morphology can be kinetically monitored. Furthermore, cellular processes can be simultaneously quantified over time using fluorescent reagents, such as Annexin V Red Dye for apoptosis and Cytotox Green Dye for cytotoxicity. The methods presented are optimized for the Cytation 5 live-cell imaging system, but this protocol may be adapted across different live-cell imaging platforms.

Yazar Spotlight: Organoid Bazlı İlaç Yanıt Analizi için Çoklanmış Kinetik Tahlillerin Geliştirilmesi

Kanserin Hasta Kaynaklı Organoid Modellerinde İlaç Yanıtları için Çoğullanmış Canlı Hücre Görüntüleme

We apply patient derived organoid models, which are created from actual patient tumor specimens to examine how the tumors respond to drugs. We can also define the molecular characteristics that correlate with response. These results are then used to prioritize the best new therapies to advance in the clinical trials in the future.One of the main challenges in using patient derived organoid models is that they are a finite resource. In addition, there are very few off the shelf kits to assess drug response in organoid models that preserve the sample in a format that allows for other downstream analyses, such as transcriptomic profiling. We developed a multiplexed approach to kinetically monitor therapeutic response in organoid models.We use fluorescent dyes that are specific to different cellular processes, which provides insight into the mechanism of drug activity in each organoid model. In a single experiment we collect both functional and time course data and the samples are available for other assays. This method can be applied to assess response to a broad range of therapeutic modalities beyond small molecule inhibitors, including radiation sensitivity.We are also continuing to innovate by developing tools for other cellular phenotypes that can be kinetically measured, such as senescence.

Amacımız, PDO terapötik yanıtını değerlendirmek için çoğullanmış canlı hücre görüntüleme kullanmanın fizibilitesini göstermekti. Kavram kanıtı deneyleri, endometriyal kanserin iki ayrı PDO modelinde gerçekleştirildi: ONC-10817 ve ONC-10811 (ONC-10811 verileri için Ek Şekil 1 ve Ek Şekil 2'ye bakınız). Apoptoz (annexin V boyama) ve sitotoksisite (Cytotox Green tutulumu), apoptozu indükleyen ajan staurosporine yanıt olarak kinetik olarak izlendi. Spesifik ola...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer at JoVE.com

Hasta kaynaklı tümör organoidleri, temel ve translasyonel araştırmalar için gelişmiş bir model sistemdir. Bu yöntem makalesi, farklı organoid fenotiplerin eşzamanlı kinetik değerlendirmesi için çoğullanmış floresan canlı hücre görüntülemenin kullanımını detaylandırmaktadır.

Patient-derived organoid (PDO) models of cancer are a multifunctional research system that better recapitulates human disease as compared to cancer cell ...

Tümörlerin ilaçlara nasıl tepki verdiğini incelemek için gerçek hasta tümör örneklerinden oluşturulan hasta kaynaklı organoid modelleri uyguluyoruz. Yanıtla ilişkili moleküler özellikleri de tanımlayabiliriz. Bu sonuçlar daha sonra gelecekte klinik çalışmalarda ilerlemek için en iyi yeni tedavilere öncelik vermek için kullanılır.Hasta kaynaklı organoid modellerin kullanılmasındaki temel zorluklardan biri, bunların sınırlı bir kaynak olmasıdır. Ek olarak, numuneyi transkriptomik profilleme gibi diğer aşağı akış analizlerine izin veren bir formatta koruyan organoid modellerde ilaç yanıtını değerlendirmek için çok az sayıda hazır kit vardır. Organoid modellerde terapötik yanıtı kinetik olarak izlemek için çoğullanmış bir yaklaşım geliştirdik.Her bir organoid modelde ilaç aktivitesinin mekanizması hakkında fikir veren farklı hücresel süreçlere özgü floresan boyalar kullanıyoruz. Tek bir deneyde hem fonksiyonel hem de zaman seyri verilerini topluyoruz ve numuneler diğer tahliller için mevcut. Bu yöntem, radyasyon duyarlılığı da dahil olmak üzere küçük moleküllü inhibitörlerin ötesinde çok çeşitli terapötik modalitelere yanıtı değerlendirmek için uygulanabilir.Ayrıca, yaşlanma gibi kinetik olarak ölçülebilen diğer hücresel fenotipler için araçlar geliştirerek yenilik yapmaya devam ediyoruz.

multiplexed-live-cell-imaging-for-drug-responses-patient-derived

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer

781 Görüntüleme.  University of Iowa. Tümörlerin ilaçlara nasıl tepki verdiğini incelemek için gerçek hasta tümör örneklerinden oluşturulan hasta kaynaklı organoid modelleri uyguluyoruz. Yanıtla ilişkili moleküler özellikleri de tanımlayabiliriz. Bu sonuçlar daha sonra gelecekte klinik çalışmalarda ilerlemek için en iyi yeni tedavilere öncelik vermek için kullanılır.Hasta kaynaklı organoid modellerin kullanılmasındaki temel zorluklardan biri, bunların sınırlı bir kaynak olmasıdır. Ek olar...