Este estudo foi apoiado pela Adelson Medical Research Foundation (AMRF), pela Melanoma Research Alliance (MRA) e U54CA224068. A Figura 1, a Figura 4 e a Figura 5 foram criadas com BioRender.com.

Este estudo cumpriu todas as diretrizes institucionais relativas à amostragem de tecido humano. O consentimento informado foi recebido dos pacientes e os dados identificáveis da amostra foram anonimizados. As amostras são coletadas na sala de cirurgia, colocadas em uma solução de RPMI, solução salina ou PBS e confirmadas como cancerígenas pelo departamento de patologia antes do uso em pesquisa. Todas as etapas, exceto quando indicadas, devem ser realizadas a 4 °C ou no gelo. Trabalhe dentro de uma capa de biossegurança ao processar tecido humano. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.
1. Obtenção da amostra
<ol><li>Obtenha uma amostra de tumor sólido em um tubo de meio e coloque-a no gelo.<ol><li>Instrua a equipe da sala de cirurgia a transportar a amostra em um tubo contendo RPMI, solução salina ou PBS suficiente para submergir completamente o tecido e evitar a desidratação da amostra. NOTA: Garantir que a amostra não esteja desidratada é importante, pois isso diminuirá a viabilidade.</li>
	</ol></li>
	<li>Arrefecer todas as centrifugadoras a 4 °C e levar o misturador térmico a 37 °C.</li>
	<li>Retire as enzimas de dissociação de tumores humanos ou de camundongos preparadas (Tabela de Materiais), descongele no misturador térmico a 37 ° C e passe para o gelo depois de descongelado.</li>
	<li>Recupere uma alíquota de 20 mL de RPMI.</li>
	<li>Registre informações relevantes da amostra (por exemplo, ID do paciente, desidentificador, tipo de amostra).</li>
	<li>Transferir a amostra para uma placa de cultura de tecidos de 60 mm (colocada sobre gelo) invertendo o tubo várias vezes e deitando o conteúdo na cápsula para garantir que todo o material da amostra é transferido. Se a amostra não foi entregue em mídia na chegada, adicione mídia RPMI fresca ao prato.<ol><li>Se a amostra estiver fragmentada, girar o tubo que contém a amostra a 450 × g, 4 °C por 5 min, descartar o sobrenadante, ressuspender a amostra em 420 μL de RPMI e passar para a seção 2.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Digestão mecânica e enzimática
<ol><li>Pipete 420 μL de meio do prato de amostra de 60 mm para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Tente incluir quaisquer fragmentos de amostra suspensos na mídia.</li>
	<li>Transferir o tecido da amostra da placa de 60 mm para o tubo de 1,5 ml contendo o meio utilizando uma pinça. Corte a amostra com uma tesoura limpa dentro do tubo para que as peças tenham no máximo 2-3 mm de diâmetro.</li>
	<li>Adicione enzimas de digestão, preparadas de acordo com as especificações do fabricante (Tabela de Materiais), à amostra nos seguintes volumes: 42 μL de Enzima H (proteases inespecíficas) para amostras humanas, Enzima D (proteases não específicas) para amostras murinas, 21 μL de enzima R (proteases inespecíficas) e 5 μL de enzima A (nuclease).</li>
	<li>Adicione mais 420 μL de meio do prato ou até a marca de 1 mL no tubo. Não exceda 420 μL de meio.</li>
	<li>Vortex o tubo por 5 s e coloque-o em um misturador térmico posicionado verticalmente de lado (Figura 1B). Incubar a 37 °C, 450 rpm, durante 15 min. NOTA: Durante a incubação, retire todos os materiais genômicos 10x necessários para a geração de GEM, pois eles requerem 30 minutos para equilibrar a temperatura ambiente</li>
</ol>3. Filtragem de amostras
<ol><li>Coloque um filtro de célula de 50 μm em cima de um novo tubo cônico de 15 mL e prepare o filtro passando 1 mL de meio RPMI fresco através dele para o tubo.</li>
	<li>Após a digestão, transfira a amostra para o tubo de 15 mL usando uma ponta de pipeta larga de baixa retenção de 1.000 μL. Lave o tubo de 1,5 mL com 1 mL de meio fresco e transfira o meio para o filtro para garantir que todo o material da amostra passe pelo filtro.</li>
	<li>Obtenha uma seringa de plástico de 1 ml e retire apenas o êmbolo (elimine o resto da seringa). Usando a parte de trás do êmbolo da seringa, triture e empurre a amostra no filtro em um movimento de torção.</li>
	<li>Lave o filtro com 5 mL de meio e qualquer meio restante do prato que continha a amostra (seção 1) para coletar quaisquer células que possam ter se desprendido do tecido.</li>
	<li>Coloque um filtro de célula de 30 μm em cima de um novo tubo cônico de 15 mL, prepare o filtro com 1 mL de meio e transfira o conteúdo do tubo contendo a amostra dissociada através do filtro. NOTA: Esta etapa removerá detritos grandes que podem entupir ou causar uma falha de umedecimento ao executar a amostra usando os chips microfluídicos 10x Genomics.</li>
</ol>4. Lise de glóbulos vermelhos
<ol><li>Centrifugar a amostra a 450 × g, 4 °C durante 5 min. Aspire a mídia, tomando cuidado para não mexer no pellet.</li>
	<li>Ressuspenda no tampão ACK Lysis para remover os glóbulos vermelhos (RBCs) e registre o volume usado. O volume dependerá do tamanho do pellet e da extensão das hemácias no pellet. NOTA: A solução de amostra ACK ressuspensa deve ser incolor quando tampão de lise ACK suficiente for adicionado, pois isso limpará os glóbulos vermelhos da amostra.</li>
	<li>Centrifugar o tubo de recolha a 450 × g, 4 °C, durante 5 min, e aspirar o sobrenadante.</li>
	<li>Repita as etapas 4.2-4.3 conforme necessário até que o pellet de amostra não tenha cor vermelha visível após a centrifugação (Figura 2). Registre todos os volumes extras do buffer de lise ACK usados nesta etapa.</li>
	<li>Ressuspenda o pellet de amostra em meio fresco em preparação para a contagem.</li>
</ol>5. Contagem de células
<ol><li>Coloque 10 μL de azul de tripano em um tubo de 1,5 mL. Misture suavemente as células dissociadas, pegue 10 μL de amostra e misture (1:1) com o azul de tripano. Carregue 10 μL em cada lado de um hemocitômetro e conte as células.</li>
	<li>Registre a concentração de células, contagem total de células vivas, porcentagem de viabilidade e volume final do meio após a contagem.</li>
	<li>Certifique-se de que a contagem de células esteja entre 700 e 1.200 células/μL (7 ×10 5- 1,2 × 106/mL) para uma execução genômica ideal de 10x.<ol><li>Se a amostra estiver muito concentrada, dilua-a com meio e reconte-a.</li>
		<li>Se a amostra estiver demasiado diluída, centrifugar a amostra a 450 × g, 4 °C durante 5 min, e ressuspender num volume menor de meios.</li>
		<li>Se a viabilidade celular estiver abaixo de 80%, execute um procedimento de mortos-vivos para remover as células mortas.</li>
		<li>Se houver menos de um milhão de células, consulte a seção 6.</li>
		<li>Se houver mais de um milhão de células e a viabilidade > 10%, consulte a seção 6.</li>
		<li>Se houver mais de um milhão de células e a viabilidade < 10%, consulte a seção 7.</li>
		<li>Se a viabilidade celular for superior a 80%, mantenha as células processadas no gelo e prossiga imediatamente para a geração de GEM de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Remoção de células mortas - Kit 1
NOTA: Trabalhe dentro de uma capa de biossegurança ao usar os reagentes de remoção de células mortas, pois eles podem ser facilmente contaminados.
<ol><li>Centrifugar a amostra a 450 × g, 4 °C durante 5 min.</li>
	<li>Prepare o meio de isolamento em um tubo cônico de 15 mL e mantenha-o em temperatura ambiente: 9.8 mL de PBS, 10 μL de CaCl2 e 200 μL de FCS inativado por calor (adicionado em uma capa de biossegurança).</li>
	<li>Após centrifugação, aspirar o meio do pellet e ressuspender em 1 ml do meio de isolamento.</li>
	<li>Centrifugar novamente o tubo a 450 × g, 4 °C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 100 μl de meios de isolamento.</li>
	<li>Transfira 100 μL de amostra em meio de isolamento para um poço de um tubo de tira de PCR de 0,2 mL.</li>
	<li>Em uma coifa de biossegurança, adicione 10 μL de coquetel de anexina V e 10 μL de coquetel de seleção de biotina ao poço contendo 100 μL da amostra em meio isolado. Pipetar misturar a solução e deixá-la repousar à temperatura ambiente durante 4 min.</li>
	<li>Após 4 min, vórtice as partículas magnéticas revestidas com dextrana por 30 s. Adicione 20 μL dos grânulos e 60 μL de meio de isolamento à amostra (um volume total de 200 μL). Se a viabilidade for inferior a 40%, dimensione a quantidade de grânulos até 40 μL enquanto ajusta o volume do meio de isolamento (até 40 μL), mantendo um volume total de 200 μL. Pipete a mistura e deixe a solução descansar em temperatura ambiente por 3 min.</li>
	<li>Coloque o tubo de tira em um separador magnético genômico 10x (na configuração alta) por 5 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfira o líquido do tubo de tira sem perturbar os grânulos para um novo tubo de microcentrífuga lo-bind de 1,5 mL. Não remova o tubo de tira do ímã.</li>
	<li>Centrifugar o tubo de 1,5 ml que contém a amostra a 450 × g, 4 °C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento num volume adequado de meios RPMI com base na dimensão do sedimento e na contagem de células, conforme descrito na secção 5. Repita o procedimento de remoção de células mortas se a viabilidade permanecer abaixo de 80% (Figura 3 e Figura 4). NOTA: Não ressuspenda as células em meios isolados para geração de GEM a jusante, pois o cloreto de cálcio interferirá no processo de encapsulamento e na etapa de transcrição reversa (RT).</li>
	<li>Mantenha as células processadas no gelo se a viabilidade celular estiver acima de 80% e prossiga imediatamente para a geração de GEM de acordo com as instruções do fabricante.</li>
</ol>7. Remoção de células mortas - Kit 2
NOTA: Trabalhe dentro de uma capa de biossegurança ao usar os reagentes do kit.
<ol><li>Coloque as microesferas e a solução de estoque 20x Binding Buffer dentro de uma capa de biossegurança.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão da amostra a 450 × g, 4 °C durante 5 min.</li>
	<li>Prepare 1x solução tampão em condições estéreis usando 1 mL da solução de estoque tampão de ligação 20x pipetada em 19 mL de água destilada livre de DNAse e RNAse.</li>
	<li>Uma vez concluída a centrifugação, aspire o sobrenadante, adicione as microesferas, misture suavemente a amostra e incube em temperatura ambiente por 15 min.<ol><li>Quando a contagem de células for 10,7 ou menos, adicione 100 μL das microesferas.</li>
		<li>Para contagens superiores a 107 células totais, ajuste as microesferas para uma concentração final de 100 μL por 107 células vivas.</li>
	</ol></li>
	<li>Durante a incubação, obtenha uma coluna de seleção positiva MACS, MACS multistand e o separador magnético correspondente. Certifique-se de que o separador esteja nivelado no suporte múltiplo e que nenhum outro objeto metálico ou magnético esteja próximo ao suporte, pois a força magnética é poderosa e pode afetar a eficiência da remoção de células mortas. Coloque a coluna confortavelmente em um suporte separador com as asas voltadas para fora.</li>
	<li>Após a incubação da amostra, se o volume total de ressuspensão for inferior a 500 μL, adicione 1x Binding Buffer até que o volume total seja de 500 μL.</li>
	<li>Coloque um tubo cônico de 15 mL abaixo da coluna e prepare a coluna com 3 mL de 1x tampão de ligação.</li>
	<li>Substitua o tubo cônico por um novo cônico de 15 mL para coleta de amostras de células e adicione a amostra à coluna, permitindo que ela flua completamente através da coluna.</li>
	<li>Lave a coluna 4 x 3 mL de 1x Binding Buffer, adicionando apenas uma lavagem de cada vez após a lavagem anterior ter fluído inteiramente pela coluna.</li>
	<li>Após a quarta lavagem, centrifugar o tubo cónico contendo as células isoladas durante 5 min a 450 × g, 4 °C. Descarte a coluna e o buffer de associação 1x restante.</li>
	<li>Ressuspenda a solução da amostra na quantidade apropriada de meio RPMI com base no tamanho do pellet e conte as células isoladas usando o método descrito na seção 5 (Figura 3 e Figura 5).<ol><li>Se a viabilidade permanecer abaixo de 80% e o número total de células for 106 ou menos, repita a seção 6.</li>
		<li>Se a viabilidade celular estiver acima de 80%, mantenha as células processadas no gelo e prossiga imediatamente para a geração de GEM de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	</ol></li>
</ol>

Protocolo de dissociação tumoral para análise de sequenciamento de RNA de célula única

<ol>
	<li>Liu, C., Yang, M., Zhang, D., Chen, M., Zhu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+cancer+immunotherapy:+Current+progress+and+prospects.">Clinical cancer immunotherapy: Current progress and prospects.</a> Front Immunol. 13, 961805 (2022).</li><li>Baghban, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+complexity+and+therapeutic+implications+at+a+glance.">Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance.</a> Cell Commun Signal. 18 (1), 59 (2020).</li><li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+in+cancer:+Applications,+advances,+and+emerging+challenges.">Single-cell RNA sequencing in cancer: Applications, advances, and emerging challenges.</a> Mol Ther Oncolytics. 21, 183-206 (2021).</li><li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+single-cell+RNA+sequencing+and+its+applications+in+cancer+research.">Advances in single-cell RNA sequencing and its applications in cancer research.</a> J Hematol Oncol. 16 (1), 98 (2023).</li><li>Ottaiano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+chaos+to+opportunity:+decoding+cancer+heterogeneity+for+enhanced+treatment+strategies.">From chaos to opportunity: decoding cancer heterogeneity for enhanced treatment strategies.</a> Biology. 12 (9), 1183 (2023).</li><li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines.">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).</li><li>Erfanian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+learning+applications+in+single-cell+genomics+and+transcriptomics+data+analysis.">Deep learning applications in single-cell genomics and transcriptomics data analysis.</a> Biomed Pharmacother. 165, 115077 (2023).</li><li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+applications:+A+brief+overview.">Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview.</a> Clin Transl Med. 12 (3), e694 (2022).</li><li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+tissue+dissociation+protocol+for+single-cell+RNA+sequencing+analysis+of+fresh+and+cultured+human+skin+biopsies.">An optimized tissue dissociation protocol for single-cell RNA sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 872688 (2022).</li><li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows.">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).</li><li>Sade-Feldman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+T+cell+states+associated+with+response+to+checkpoint+immunotherapy+in+melanoma.">Defining T cell states associated with response to checkpoint immunotherapy in melanoma.</a> Cell. 176 (1-2), 404 (2019).</li><li>Pelka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+organized+multicellular+immune+hubs+in+human+colorectal+cancer.">Spatially organized multicellular immune hubs in human colorectal cancer.</a> Cell. 184 (18), 4734-4752 (2021).</li><li>Bill, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCL9:SPP1+macrophage+polarity+identifies+a+network+of+cellular+programs+that+control+human+cancers.">CXCL9:SPP1 macrophage polarity identifies a network of cellular programs that control human cancers.</a> Science. 381 (6657), 515-524 (2023).</li><li>Al'Khafaji, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNA+isoform+sequencing+using+programmed+cDNA+concatenation.">High-throughput RNA isoform sequencing using programmed cDNA concatenation.</a> Nat Biotechnol. 42 (4), 582-586 (2024).</li><li>Xing, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cell+isolation+methods+on+the+human+transcriptome+profiling+and+microbial+transcripts+of+peripheral+blood.">The effect of cell isolation methods on the human transcriptome profiling and microbial transcripts of peripheral blood.</a> Mol Biol Rep. 48 (4), 3059-3068 (2021).</li><li>Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+to+study+vascular+diversity+and+function.">Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function.</a> Curr Opin Hematol. 28 (3), 221-229 (2021).</li><li>Fan, X. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+cold+ischemic+time+and+freeze-thaw+cycles+on+RNA,+DNA+and+protein+quality+in+colorectal+cancer+tissues+biobanking.">Impact of cold ischemic time and freeze-thaw cycles on RNA, DNA and protein quality in colorectal cancer tissues biobanking.</a> J Cancer. 10 (20), 4978-4988 (2019).</li><li>LoCoco, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+approaches+to+extract+high-integrity+RNA+from+skin+and+other+pertinent+tissues+used+in+pain+research.">Reliable approaches to extract high-integrity RNA from skin and other pertinent tissues used in pain research.</a> Pain Rep. 5 (2), e818 (2020).</li><li>Montanari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated-mechanical+procedure+compared+to+gentle+enzymatic+tissue+dissociation+in+cell+function+studies.">Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies.</a> Biomolecules. 12 (5), 701 (2022).</li><li>Yosefov-Levi, O., Tornovsky, S., Parnas, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+tissue+dissection+to+isolate+viable+single+cells.">Pancreatic tissue dissection to isolate viable single cells.</a> J Vis Exp. (195), (2023).</li><li>Janssen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+background+noise+and+its+removal+on+the+analysis+of+single-cell+expression+data.">The effect of background noise and its removal on the analysis of single-cell expression data.</a> Genome Biol. 24 (1), 140 (2023).</li><li>Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychrophilic+proteases+dramatically+reduce+single+cell+RNA-seq+artifacts:+A+molecular+atlas+of+kidney+development.">Psychrophilic proteases dramatically reduce single cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development.</a> Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).</li><li>Sutermaster, B. A., Darling, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+high-yield,+high-throughput+cell+enrichment:+fluorescence+versus+magnetic+sorting.">Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting.</a> Sci Rep. 9 (1), 227 (2019).</li></ol>

M.S-F. recebeu financiamento da Bristol Myers-Squibb, Istari Oncology e foi consultor da Galvazine Therapeutics.

Este protocolo descreve a dissociação de amostras de tumores humanos ou murinos em uma suspensão de célula única para sequenciamento de scRNA usando o sistema microfluídico 10x Genomics. No processamento de tecidos que geralmente vêm de cânceres raros ou fazem parte de ensaios clínicos em andamento ou experimentos longos para tumores murinos, a amostra deve ser preservada de maneira ideal e cuidadosa entre todas as etapas. Todas as etapas devem ser realizadas rapidamente no gelo ou a 4 °C para manter os perfis ...

Embora muitos avanços na pesquisa do câncer tenham levado ao desenvolvimento e à aprovação da FDA de agentes direcionados a receptores inibitórios expressos em células imunes e tumorais, conhecidos como inibidores de bloqueio de checkpoint, a resistência à terapia e a identificação de mecanismos que impulsionam a resposta do paciente permanecem desafiadores1. O complexo desafio de caracterizar a heterogeneidade do tumor em sua diversidade molecular e a intrincada interação entre as células tumorais e o microambiente imunológico requer novas abordagens para dissecar esse ecossistema complexo na resolução de uma única célula. Compreender as complexidades moleculares dentro dos tumores e seus microambientes é fundamental para o avanço das estratégias terapêuticas e decifrar a complexa biologia subjacente à progressão do câncer2. O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) tornou-se cada vez mais popular porque fornece análise de alta resolução de células individuais em amostras complexasde tumores 3,4.
A heterogeneidade do tumor, abrangendo diversidades genéticas, epigenéticas e fenotípicas, representa um desafio para descobrir os meandros da biologia do câncer5. Os métodos convencionais de sequenciamento de RNA em massa tendem a obscurecer os perfis de expressão únicos e fenótipos de populações de células heterogêneas presentes nos tumores, pois esses métodos calculam a média dos sinais em populações de células inteiras4. Em contraste, o scRNA-seq permite a dissecação de tipos de células individuais, revelando diversas expressões gênicas, padrões de repressão e estados celulares negligenciados 4,6. A premissa do scRNA-seq reside em sua capacidade de decodificar assinaturas genéticas e moleculares de células individuais, sendo imensamente promissora na descoberta de novas terapias contra o câncer7.
Ao decifrar os perfis de expressão gênica das células tumorais e das células estromais e imunes circundantes, os pesquisadores podem identificar novos alvos terapêuticos e desenvolver estratégias de medicina genética de precisão adaptadas a pacientes individuais6. Além disso, dissecar o repertório imunológico dentro do microambiente tumoral fornece informações cruciais sobre a interação entre células tumorais e efetores imunológicos, abrindo caminho para intervenções imunoterapêuticas3. Apesar dos avanços no uso de scRNAseq em amostras clínicas, vários desafios durante as etapas de processamento podem prejudicar a integridade, a viabilidade e a qualidade do RNA da célula dos dados gerados. Além disso, o processamento de tecido com baixa viabilidade celular pode aumentar os níveis de RNA ambiente nas gotículas geradas durante o encapsulamento de células individuais, resultando em contaminação cruzada e anotação incorreta de tipos de células, enquanto protocolos de dissociação longos realizados a 37 ° C podem levar à regulação positiva de uma assinatura gênica de resposta ao estresse em vários tipos de células 8,9, 10. Agosto
O procedimento gradual (Figura 1A) descrito neste protocolo começa com a rápida dissociação mecânica e enzimática dos tumores, seguida pela filtração e remoção de células mortas, dependendo da viabilidade de cada amostra de tumor. Atualmente, esse procedimento tem sido verificado em amostras de melanoma11, colorretal12, carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço13, tumor pancreático e pulmonar (dados não publicados). Essas técnicas garantem a geração de suspensões celulares viáveis de alta qualidade, cruciais para análises a jusante14. Notavelmente, a remoção de glóbulos vermelhos, desprovidos de RNA sintetizado, torna-se imperativa para purificar a amostra15. A avaliação subsequente da contagem de células e a eliminação de células mortas servem como pré-requisito para a geração bem-sucedida de 10x Genomics Gel bead-in Emulsion (GEM), código de barras e aumento da recuperação de transcritos e células sequenciadas sem comprometer a exclusão de populações sensíveis (por exemplo, neutrófilos e células epiteliais)16. Essas etapas são fundamentais para desbloquear o potencial da análise de resolução de célula única em amostras de tumor 9,10, descobrindo novos perfis de expressão gênica e assinaturas imunológicas necessárias para conduzir intervenções terapêuticas inovadoras e identificar novas vulnerabilidades tumorais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L low-retention pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L low-retention wide pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Magnetic Separator</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL aspirating pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L low-retention pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L low-retention pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 x 15 mm Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>3090659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>551660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2115-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger&#160;</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides for TC20 cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrics 30&#956;m sterile disposable filters</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-004-2326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrics 50&#956;m sterile disposable filters</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-004-2327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead Cell removal Kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-101</td>
			<td>Store at -20 &#176;C; kit 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps, Fine Tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySepTM Dead Cell Removal 
			(Annexin V) Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17899</td>
			<td>Store at 4 &#176;C; Kit 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge 5425R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5406000640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge 5910R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Easypet 3 Electronic Pipette controller</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP4430000018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer F1.5 Model 5384</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP5384000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, use in a Biological hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German Stainless Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14568-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Dmi1 Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>454793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro MACS Magnet</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21870-076</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube strips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-4700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit, Human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-929</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, prepare enzymes according to kit instructions: 
			Reconstitute lyophilized Enzyme H vial in 3 mL of RPMI 1640 
			Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 
			Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit, Mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, prepare enzymes according to kit instructions: 
			Reconstitute lyophilized Enzyme D vial in 3 mL of RPMI 1640 
			Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 
			Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissociation of human and mouse tumor tissue samples for single-cell rna sequencing

As amostras de tumores humanos contêm uma infinidade de informações sobre seu microambiente e repertório imunológico. A dissociação efetiva de amostras de tecido humano em suspensões de células viáveis é uma entrada necessária para o pipeline de sequenciamento de RNA de célula única (scRNAseq). Ao contrário das abordagens de sequenciamento de RNA em massa, o scRNAseq nos permite inferir a heterogeneidade transcricional em amostras de tumor no nível de célula única. A incorporação dessa abordagem nos últimos anos levou a muitas descobertas, como a identificação de estados e programas celulares imunes e tumorais associados a respostas clínicas a imunoterapias e outros tipos de tratamentos. Além disso, tecnologias de célula única aplicadas a tecidos dissociados podem ser usadas para identificar o repertório de receptores de células T e B das regiões de cromatina acessíveis e a expressão de proteínas, usando anticorpos com código de barras de DNA (CITEseq).
A viabilidade e a qualidade da amostra dissociada são variáveis críticas ao usar essas tecnologias, pois podem afetar drasticamente a contaminação cruzada de células individuais com RNA ambiente, a qualidade dos dados e a interpretação. Além disso, protocolos de dissociação longos podem levar à eliminação de populações de células sensíveis e à regulação positiva de uma assinatura gênica de resposta ao estresse. Para superar essas limitações, criamos um protocolo de dissociação universal rápida, que foi validado em vários tipos de tumores humanos e murinos. O processo começa com a dissociação mecânica e enzimática, seguida de filtração, lise de sangue vermelho e enriquecimento de mortos-vivos, adequado para amostras com baixa entrada de células (por exemplo, biópsias por agulha). Este protocolo garante uma suspensão de célula única limpa e viável, fundamental para a geração bem-sucedida de emulsões de esferas de gel (GEMs), código de barras e sequenciamento.

Although many advancements in cancer research have led to the development and FDA approval of agents targeting inhibitory receptors expressed on immune and tumor cells, known as checkpoint blockade inhibitors, therapy resistance and identifying mechanisms that drive patient response remain challenging1. The complex challenge of characterizing tumor heterogeneity on its molecular diversity and the intricate interplay between tumor cells and the immune microenvironment necessitates new approaches to dissect this complex ecosystem at the single-cell resolution. Understanding the molecular intricacies within tumors and their microenvironments is pivotal for advancing therapeutic strategies and deciphering the complex biology underlying cancer progression2. Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) has become increasingly popular because it provides high-resolution analysis of individual cells within complex tumor samples3,4.
Tumor heterogeneity, encompassing genetic, epigenetic, and phenotypic diversities, poses a challenge in uncovering the intricacies of cancer biology5. The conventional methods of bulk RNA sequencing tend to obscure the unique expression profiles and phenotypes of heterogeneous cell populations present within tumors, as these methods average signals across entire cell populations4. In contrast, scRNA-seq allows the dissection of individual cell types, revealing diverse gene expression, repression patterns, and cellular states otherwise overlooked4,6. The premise of scRNA-seq lies in its capacity to decode individual cells&#39; genetic and molecular signatures, holding immense promise in discovering new cancer therapeutics7.
By deciphering the gene expression profiles of tumor cells and the surrounding stromal and immune cells, researchers can identify novel therapeutic targets and develop precision genetic medicine strategies tailored to individual patients6. Furthermore, dissecting the immune repertoire within the tumor microenvironment provides crucial insights into the interplay between tumor cells and immune effectors, paving the way for immunotherapeutic interventions3. Despite advances in using scRNAseq on clinical samples, several challenges during the processing steps can harm the cell&#39;s RNA integrity, viability, and quality of the data generated. Moreover, processing tissue with low cell viability can increase ambient RNA levels in the droplets generated during the encapsulation of individual cells, resulting in cross-contamination and incorrect annotation of cell types, while long dissociation protocols performed at 37 &#176;C can lead to the upregulation of a stress response gene signature in multiple cell types8,9,10.
The stepwise procedure (Figure 1A) outlined in this protocol commences with rapid mechanical and enzymatic dissociation of tumors, followed by filtration and the removal of dead cells, depending on the viability of each tumor sample. At present, this procedure has been verified in melanoma11, colorectal12, head and neck squamous cell carcinoma13, pancreatic and lung (unpublished data) tumor samples. These techniques ensure the generation of high-quality viable cell suspensions crucial for downstream analyses14. Notably, removing red blood cells, devoid of synthesized RNA, becomes imperative to purify the sample15. Subsequent evaluation of cell counts and the elimination of dead cells serve as a prerequisite for successful 10x Genomics Gel bead-in Emulsion (GEM) generation, barcoding, and increase the recovery of transcripts and sequenced cells without jeopardizing the exclusion of sensitive populations (e.g., neutrophils and epithelial cells)16. These steps are fundamental in unlocking the potential of single-cell resolution analysis within tumor samples9,10, uncovering novel gene expression profiles and immune signatures necessary for driving innovative therapeutic interventions, and identifying new tumor vulnerabilities.

Autor em destaque: explorando estratégias para uma resposta imune bem-sucedida contra tumores

Dissociação de amostras de tecido tumoral humano e de camundongo para sequenciamento de RNA de célula única

Uma biópsia de melanoma suspensa em RPMI foi obtida e imediatamente colocada em gelo. A amostra foi transferida para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 420 μL de RPMI e enzimas de digestão, picada em pequenos pedaços usando tesoura e submetida à digestão enzimática subsequente por 15 min em um misturador térmico a 37 °C posicionado verticalmente (Figura 1). Após a digestão, a amostra foi filtrada através de um filtro descartável estéril de 50 μm e o filtro foi lava...

Este protocolo descreve o procedimento para dissociar rapidamente amostras de tumores humanos e de camundongos para sequenciamento de RNA de célula única.

Human tumor samples hold a plethora of information about their microenvironment and immune repertoire. Effective dissociation of human tissue samples into ...

dissociation-human-mouse-tumor-tissue-samples-for-single-cell-rna

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Dissociation of Human and Mouse Tumor Tissue Samples for Single-cell RNA Sequencing

1.3K visualizações.  Massachusetts General Hospital. O escopo de nossa pesquisa é estudar os mecanismos de resposta ou resistência em imunoterapias padrão de tratamento. Nosso laboratório está tentando entender o que impulsiona uma resposta imune bem-sucedida contra tumores e se podemos identificar esses preditores de terapia para encontrar alvos que possam superar a resistência. O maior avanço nos últimos anos foi o desenvolvimento e integração de técnicas de sequenciamento de RNA de célula única....

Vídeo: Autor em destaque: explorando estratégias para uma resposta imune bem-sucedida contra tumores

Human tumor samples hold a plethora of information about their microenvironment and immune repertoire. Effective dissociation of human tissue samples into viable cell suspensions is a required input for the single-cell RNA sequencing (scRNAseq) pipeline. Unlike bulk RNA sequencing approaches, scRNAseq enables us to infer the transcriptional heterogeneity in tumor specimens at the single-cell level. Incorporating this approach in recent years has led to many discoveries, such as identifying immune and tumor cellular states and programs associated with clinical responses to immunotherapies and other types of treatments. Moreover, single-cell technologies applied to dissociated tissues can be used to identify accessible chromatin regions T and B cell receptor repertoire, and the expression of proteins, using DNA barcoded antibodies (CITEseq).
The viability and quality of the dissociated sample are critical variables when using these technologies, as these can dramatically affect the cross-contamination of single cells with ambient RNA, the quality of the data, and interpretation. Moreover, long dissociation protocols can lead to the elimination of sensitive cell populations and the upregulation of a stress response gene signature. To overcome these limitations, we devised a rapid universal dissociation protocol, which has been validated on multiple types of human and murine tumors. The process begins with mechanical and enzymatic dissociation, followed by filtration, red blood lysis, and live dead enrichment, suitable for samples with a low input of cells (e.g., needle core biopsies). This protocol ensures a clean and viable single-cell suspension paramount to the successful generation of Gel Bead-In Emulsions (GEMs), barcoding, and sequencing.

This protocol outlines the procedure for rapidly dissociating human and mouse tumor samples for single-cell RNA sequencing.