As funções das proteínas são dependentes da temperatura e são ótimas à temperatura. Este protocolo fornece uma maneira de resolver estruturas de proteínas em temperaturas mais altas. Esta abordagem pode fornecer estruturas funcionalmente relevantes e melhorar a compreensão da dependência da temperatura das estruturas proteicas.
Demonstrando o procedimento estará Yuan-Chih Chang, Gerente da instalação EM da Academia Sinica Cryo. Comece fazendo um orifício de um centímetro em um tubo de centrífuga de 50 milímetros em sua extremidade fechada. Coloque o tubo na câmara do aparelho de vitrificação na saída de água ultra-sônica.
Configure a temperatura do aparelho de vitrificação para a temperatura especificada e permita que a câmara do aparelho de vitrificação atinja 55 graus Celsius e 100% de umidade relativa. Deixe repousar por pelo menos meia hora para estabilizar as condições antes de iniciar o experimento. Coloque o banho de água em uma placa quente e ajuste a placa quente para a temperatura desejada.
Verifique com um termômetro para garantir que a água atinja 55 graus Celsius. Incubar a amostra no banho-maria e pré-aquecer a ponta da pipeta na borda da placa quente por dois minutos ou mais antes do experimento de blotting. Descarga de brilho em uma grade suportada por carbono holey a 25 miliamperes por 30 segundos.
Coloque o papel de filtro de vitrificação na câmara do aparelho de vitrificação o mais tardar cinco minutos antes da experiência de blotting. Incubar a pinça com a grelha no aparelho de vitrificação durante dois minutos ou mais. Construa o recipiente de etano com etano de acordo com os procedimentos padrão, garantindo que o etano não transborde.
Use uma pipeta para aplicar de sete a nove microlitros da amostra na grade. Em seguida, aguarde de um a dois segundos, apague por um a um segundo e meio e mergulhe rapidamente a amostra em etano líquido. Transfira a grade do etano líquido para a caixa de crio armazenada em nitrogênio líquido.
Corte as grades e descarregue-as para adquirir microscópio eletrônico ou instrumento Cryo EM. Use a tela de exibição do instrumento Cryo EM e a função de baixa dose do software para rastrear a condição de gelo na grade e a distribuição da amostra na grade. Se a qualidade da grade resultante não for boa, repita o processo de preparação da grade com condições variadas, como tempo de espera, tempo de blotting, etc.
Se a qualidade da grade resultante for boa, repita as mesmas etapas para criar grades a uma temperatura diferente. Transfira as grades de boa qualidade para um instrumento Cryo EM de alta resolução. Realizar coleta e análise de dados de acordo com os procedimentos estabelecidos.
No caso da grade bem-sucedida, um gradiente de gelo formado com gelo mais espesso no canto superior esquerdo da grade e gelo mais fino no canto inferior direito. Caixas azuis e verdes adequadas para a coleta de dados foram observadas na grade de sucesso. Um contraste brilhante foi observado na outra grade.
Indicando uma camada fina, de gelo ou uma ausência de gelo. Apenas dois quadrados foram considerados adequados para a coleta de dados na segunda grade. Uma das grades consistia de gelo principalmente na forma cristalina, o que era inadequado para a coleta de dados.
Por outro lado, a outra grade mostrou que a camada de gelo estava em um estado amorfo adequado para a coleta de dados. A preparação do como um recipiente e outros precisam ser completos de acordo com um ponto de tempo. O controle de tempo e o término do experimento com rapidez e precisão são os mais importantes.
Dependendo dos resultados obtidos com este protocolo, o pesquisador pode ter que ter mais cuidado na configuração das condições simples.
