A preparação padrão da amostra dificulta a realização de um bom sinal-ruído durante experimentos de difração de raios-X de microcristais. Este protocolo visa reduzir as fontes de fundo formados cristais de forma controlada. O uso de robótica de congelamento de socos e grades crioTEM fornece uma plataforma robusta para manipular os microcristais repetidamente, reduzindo o volume líquido circundante e proporcionando uma vitrificação rápida da amostra.
A destreza necessária para lidar com grades é semelhante à necessária para a colheita tradicional de cristais. Outro fator importante é a determinação dos parâmetros iniciais de manchas utilizando a solução de cristalização, que é fundamental para reduzir o uso da amostra. Para começar, configure e esfrie o congelador automatizado de mergulho de acordo com as instruções do fabricante.
Pouco antes do uso, o brilho descarrega as grades crioTEM por 25 segundos com uma corrente de 15 miliamperes e 0,39 milibarbares de pressão, em seguida, manter as grades de descarga de brilho em uma placa de Petri coberta. Defina a umidade relativa da câmara de amostra para 90% e o tempo de inchaço para cinco segundos. Certifique-se de que o congelador de mergulho esteja configurado para mergulhar automaticamente a amostra após a mancha ser concluída.
Abra o selo do poço de cristalização e do reservatório. Adicione rapidamente dois a cinco microliters da solução do reservatório na gota de cristal para manter o volume da queda. Transfira 10 microlitres da solução do reservatório para um tubo de 0,5 mililitro para uso posterior e reseal o poço para evitar que a queda de cristalização seque.
Use os fórceps de congelamento de mergulho para escolher uma única grade de descarga de brilho e carregar a grade no instrumento com o lado de carbono voltado para longe do braço de manchas. Gire os fórceps segurando a grade para que o lado do carbono fique de frente para o braço manchado. Use uma pipeta de 2,5 microliteres para aplicar dois microliters de solução de reservatório ao lado não-suporte da rede crioTEM.
Gire a rede com o lado carbono voltado para longe do braço de manchas e aplique cuidadosamente o líquido do reservatório no lado de suporte da máquina de imagem de carbono da rede. Inicie o processo de mancha e observe o líquido extraído da superfície de carbono até que a onda de estalar através da superfície da rede seja visível. Se a onda de estalar não for visível, aumente o tempo de mancha em um a dois segundos antes que o braço manchador se retraia da grade.
Coloque a placa de cristalização sob o microscópio de luz e posicione bem o alvo dentro do campo de visão. Coloque uma grade de descarga de brilho fresco no congelador de mergulho e aplique o líquido do reservatório no lado não-suporte da rede, como demonstrado anteriormente. Gire a grade com o lado de suporte da filme de carbono de frente para a porta de amostra do congelador de mergulho.
Retire o selo temporário da placa de cristalização e use a pipeta em dois microliters para aspirar suavemente a gota de cristalização repetidamente. Transfira dois microliters do chorume microcristal aspirado para o congelador de mergulho e aplique toda a amostra no lado carbono da rede crioTEM. Inicie a mancha e observe para a onda de estalar, em seguida, iniciar imediatamente o congelamento do mergulho.
Transfira rapidamente a rede do etano líquido para a caixa de grade imersa em nitrogênio líquido. Depois de borrar e mergulhar congelando a grade, retire a grade mergulhada do etano líquido, reiniciando o congelador de mergulho. Remova as fórceps que seguram a grade do congelador de mergulho e coloque a grade sob o microscópio de luz.
Ajuste o foco fino e avalie a densidade dos cristais através da grade. Depois de carregar a grade crioTEM no SEM, alinhe a amostra e ligue o feixe de elétrons. Inicialmente avalie toda a grade em uma ampliação de 45X e regise a imagem, em seguida, aumente a ampliação para uma inspeção mais aprofundada dos quadrados de grade individuais até que os cristais individuais sejam claramente observados.
Mova-se ao redor da grade e capture as imagens estádas, garantindo que as grades sejam planas e que a película de suporte de carbono esteja praticamente intacta. Certifique-se de que existem numerosos cristais individuais com um halo estreito de líquido vitrificado ao redor do cristal e os buracos são visíveis no filme de suporte ao carbono. Ao observar e capturar as imagens da rede, certifique-se de que as grandes regiões do líquido vitrificado estejam ausentes, o gelo hexagonal ou o gelo superficial não estão espalhados pela grade, e que os cristais não estão sobrepostos e distribuídos uniformemente através do filme de suporte.
Em uma grande dewar de espuma, esfrie o número necessário de porta-amostras VMXm carregados no cartucho de amostra. Adicione nitrogênio líquido acima da posição amostral no carregador de amostras. Transfira rapidamente a caixa de grade contendo grades carregadas de microcristais para o recesso da caixa de grade no carregador de amostras e desaparafusar ligeiramente a tampa para manter a tampa solta e rotacionável.
Retire a grade da caixa de grade e gire a grade para colocar a grade plana no suporte da amostra. Coloque rapidamente a ferramenta de circlip pré-resfriada sobre a grade na abertura da grade e pressione o botão para instalar o circlip. Adicione nitrogênio líquido aproximadamente 1,5 centímetros acima do porta-amostras.
Use as fórceps de amostra VMXm para levantar cuidadosamente o suporte de amostra carregado e colocá-lo de volta no cartucho de amostra. Substitua a tampa do cartucho, garantindo que o pino na parte superior do cartucho engaje com o orifício na tampa. Os micrografos eletrônicos de varredura de microcristais preparados em grades crioTEM mostraram dispersão mínima de fundo.
A rede estava livre do excesso de líquido e um halo estreito de líquido foi observado ao redor dos cristais. Os cristais poliédricos foram observados individualmente, bem como em aglomerados. Cristais de insulina ligeiramente maiores também mostraram alguns aglomerados junto com cristais isolados.
Microcristais muito grandes também foram montados com sucesso em grades crioTEM. Os buracos no filme de suporte de carbono eram claramente visíveis, indicando forte mancha. Muitas amostras exigiram maior otimização devido à variação do tempo de mancha e concentração dos microcristais.
As grades sobrecarregadas com cristais reduzem a eficiência de manchas e várias treliças foram registradas em uma única imagem de difração. O curto tempo de desatalização para soluções de cristalização altamente viscosas pode resultar em uma amostra excessivamente molhada. Para uma solução de cristalização de viscosidade mais baixa, um curto tempo de manchas resulta no roubo de microcristais de um lado das grades.
A preparação ideal da amostra torna possível explorar todas as capacidades do VMXm para coletar dados de difração de raios-X de alta qualidade na maior resolução possível com uma alta relação sinal-ruído. Determinar a mancha inicial de uma solução de cristalização é a chave para o uso de amostra mínima. Se a amostra for muito limitada, pule a avaliação da densidade.
Em última análise, é melhor ter uma amostra diluída. Estas amostras estão agora prontas para experimentos de difração de raios-X na linha de feixe VMXm, difração de elétrons microcristais ou moagem de feixe de íons focalizada antes do micro ED.
