Количественная Дрожжи Хронологический продолжительность жизни на вырост возрасте клетки

Резюме

Хронологический старения у дрожжей относится к потере жизнеспособности клеток, связанных со временем в стационарной фазе. Здесь мы опишем высокой пропускной метод количественного определения дрожжей хронологическом продолжительность жизни.

Аннотация

Почкующихся дрожжей

протокол

Часть 1: Подготовка старения культур

1. Подряд штаммов интерес из замороженных запасов на YEPD пластин агар (1% дрожжевой экстракт, 2% Бакто-пептон, 2% агара, 2% глюкозы).
2. Инкубируйте клетки при 30 ˚ С в течение 48 часов или до отдельных колоний появится.
3. Выберите одну колоний и переливая ее 5 мл YEPD жидкой среде (1% дрожжевой экстракт, 2% Бакто-пептон, 2% глюкозы) в пробирках.
4. Рост культур течение ночи при 30 ˚ С, сохраняя при этом постоянную агитацию, используя либо шейкер или каток.
5. Привить 5 мл синтетического полного (SC) среды (табл. 1) с 50 мкл ночной культуры. Вообще три SC культуры готовятся для каждого штамма обеспечить трех экземплярах биологической репликации анализ продолжительности жизни для каждого штамма изучается.
6. Поддержание культур на 30 ˚ C с постоянной агитации на каток в течение всего эксперимента (обычно 2 или более недель).

Часть 2: С возрастом жизнеспособность точкой

После двух дней культуры в СК-средах, клетки должны быть в стационарной фазы и первые возрастные точки готова быть приняты. Последующие возрастные точки следует принимать каждые 2-3 дня в течение минимум двух недель. Для каждой возрастной точки:

1. Подготовка Bioscreen 100-а сотовые пластины для прививки, заполняя каждую лунку со 145 мкл YEPD. Будьте уверены, чтобы оставить по крайней мере один хорошо заполнены только YEPD и нет клеток для анализа данных позже.
2. Удалить старения культур из инкубатора.
3. Кратко вихрь первой культуры, который будет инокулировали в сотовые пластины, стараясь не расплескать культуры.
4. Удалить 5 мкл смешанной культуры и пипеткой его в первой скважины на сотовые пластины. Пламя устье каждой пробирке до и после удаления 5 мкл.
5. Повторите эту процедуру для каждого старения культуры будучи уверенным отметить также положение, соответствующее каждой культуры. Идентичные также должности, должны быть использованы для каждой последующей возрастной точки на протяжении всего эксперимента.
6. Замените культур в 30 ˚ C инкубатор, когда закончил с прививками.

Часть 3: Загрузка Bioscreen C MBR машины

1. Expose отсек инкубатора, подняв крышку и снимите крышку к образцу лоток.
2. Вставить новые прививки сотовые пластины в образец лоток (используйте левый слот, если вы только чтение одной пластины).
3. Установите крышку на образец лоток и нижняя крышки отсека инкубатора.
4. Убедитесь, что жидкий теплоноситель выше минимального уровня заполнения. Если низкий, добавьте больше, используя 1000 мкл пипетки с жидкий теплоноситель условии.
5. Использование программного обеспечения Bioscreen "EZExperiment", установите следующие параметры для получения подходящей кривые роста CEREVISIAE Saccharomyces:
   • Количество образцов: Введите количество скважин со средствами массовой информации или 200
   • Фильтр: 420-580nm, широкополосный
   • Температура: 30 ˚ C
   • Эксперимент Длительность: 1 день, 0 часов, 0 секунд
   • Измерение Интервал: 30 минут
   • Shaking: На, непрерывная дрожь, высокая
6. Нажмите кнопку "Пуск", чтобы начать чтение.

Часть 4: Анализ данных

Как правило, шести возрастных точках принимаются в течение двух недель. Возрастные точки, принятые на дни 2, 4, 6, 9, 11 и 13. В зависимости от опытно-конструкторских и штаммов проходят испытания, может быть желательно взять возрастные точки более или менее часто или в течение более 2 недель. Важно, чтобы загрузить сотовые пластины в том же порядке для каждой возрастной точки так, что каждая культура старения соответствует той же позиции и в любом возрасте-точка, так как это сделает анализ данных гораздо легче.

1. Получить выходных файлов из машины Bioscreen C MBR. Программное обеспечение "EZExperiment" выведет Bioscreen данных с разделителями табуляции файл, совместимый с Microsoft Excel, а также другого программного обеспечения. Первая колонка показывает, в какое время измерения ОП было принято в ходе эксперимента, с последующим столбцов, представляющих каждую лунку в Bioscreen пластин Honeycomb (рис. 1).
2. Удалить первом чтении OD от каждой колонки. Это чтение "шума".
3. Нормализация данных, вычитая значение ОП хорошо с YEPD один из всех значений ОП в каждом столбце. Это устраняет фоне поглощения в средствах массовой информации.
4. Участок результат кривых. Кривые изменится в зависимости от возраста (рис. 2). Например, путем построения кривых вырост из колонки 1 (1 и пластины сотовые) по шесть очков время, есть различные сдвиг вправо кривых с течением времени.
5. Рассчитайте время удвоения (δ) для каждой скважины на основе кинетики роста день 2 возрастные точки. Уравнение для расчета времени удвоения яс:
   
   где ОП ₁ и ₂ представляют OD последовательных измерений OD и Т ₁ и Т ₂ является время между измерениями. Рассчитать удвоение раз только между значениями ОП от 0,2 до 0,5. Среднее арифметическое этих значений Время удвоения, что хорошо. Рассчитать удвоение раз только между значениями ОП от 0,2 до 0,5. Среднее арифметическое этих значений Время удвоения, что хорошо. Большинство штаммов дикого типа дрожжей должно дать значение времени удвоения от 85 до 90 минут.
6. Для каждой возрастной точки, вычислить сдвиг во времени (Δt) в результате кривые по сравнению с начальной возрастной точки (день 2). Простой способ сделать это состоит в определении разницы в продолжительности времени, которое потребовалось для каждой лунки для достижения ОП 0,3 между начальным возрастом точкой и каждой последующей возрастной точки. Времени, конкретной скважины достигла 0,3 ОП может быть вычислена по линейное уравнение регрессии соответствующего п (ОП) как функцию времени между двумя временных точках брекетинг OD = 0,3.
7. Рассчитать долю выживших в каждой возрастной точкой для того, чтобы генерировать выживания кривой (рис. 3). Определить начальный возраст точкой (день 2), чтобы быть на 100% жизнеспособность. Для каждой последующей возрастной точки вычислить процент выживаемости по следующей формуле:
   
   где S _N является выживание процент, Δt _п сдвиг во времени, а δ _п время удвоения.
8. Создание кривых выживаемости (рис. 3В) в соответствии с пожеланиями для каждой скважины (или повторить скважин), откладывая часть (или процент) жизнеспособных клеток в зависимости от возраста.
9. Рассчитать выживания интеграл (СИ) для каждой скважины. С. И. определяется как площадь под кривой выживания и может быть оценена по формуле:
   
   где возраст _п возрастных точку (2, например, 4, 6, 9, 11 и 13) и S _N является ценность для выживания в этом возрасте точки.
10. Определение статистических параметров повторить скважин с СИ и выживанию данных. Общие статистические параметры, представляющие интерес, включают среднее, медиана, и дисперсии для каждого набора биологических повторяет. Т-тест или подобный анализ может быть использован для попарного сравнения СИ для разных экспериментальных и контрольных групп. Он также может быть желательной для создания кривых выживаемости, как описано в 4,8 от усредненных биологических повторяет.

Часть 5: Представитель результаты

По завершении эксперимента, у вас будет построена кривая выживания и выполняется анализ данных достаточно, чтобы определить хронологический старения потенциал для нескольких различных штаммов или условий. Если выполнены должным образом, рост кривые, полученные из машины Bioscreen C MBR должен быть похож на тех, показано на рисунке 2 и в результате кривые выживания должна напоминать показанные на рисунке 3. Как правило, дикого типа клеток, культивированных в условиях, описанных здесь, имеют средний срок службы хронологического порядка 7 дней. Существенные изменения в выживаемости наблюдается в различных штаммов и при определенных условиях, таких как рост в 0,05% СМИ глюкозы, медиана выживаемости может превышать 30 дней.

Рисунок 1. Вывод данных из Bioscreen программы "EZExperiment". Колонка отображает время, в которое поглощения чтении принято не было. Последовательные столбцы представляют скважин сотовые пластины инокулированных клеток, взятых от старения культур.

Рисунок 2. Нарост кривых из одного биологического репликацию по ходу эксперимента. Существует явный сдвиг в кривых течением времени, как клетки в культуре старения теряют жизнеспособность. Период времени между начальной точкой времени (день 2) и последовательные момент времени определяет жизнеспособность в то определенного возраста.

Рисунок 3. А) кривая выживаемости генерируется с использованием данных из нарост рисунке 1. 2-й день временной точке устанавливается как 100% жизнеспособность точки. B) Окончательные кривые выживания двух штаммов в одном эксперименте. Эти кривые выживаемости представляют средний viabilities трех биологических повторяет для каждого штамма. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение в пределах биологических повторяет. Затененной области под кривой выживаемости представляет выживания интеграл (СИ) для штамма 1.

Таблица 1. Синтетические определенной среде Используется для Хронологический старения (штамм backgrouой BY4743)
Компонент	Концентрация (г / л)
D-глюкозы	20
Дрожжи азотистого основания (-AA/AS)	1,7
(NH 4) 2 SO 4	5,0
Аденин	0,04
L-аргинин	0,02
L-Аспарагиновая кислота	0,1
L-глутаминовая кислота	0,1
L-Гистидин	0,1
L-лейцин	0,3
L-лизин	0,03
L-метионина	0,02
L-фенилаланин	0,05
L-серин	0,375
L-Треонин	0,2
L-триптофан	0,04
L-тирозин	0,03
L-валин	0,15
Урацил	0,1

Примечание: Этот рецепт составляет auxotrophies в диплоидных BY4743 напряжения. Amino auxotrophies кислота должна быть компенсирована за счет добавления 5X, чтобы конечная концентрация синтетических полной среде.

Обсуждение

Высокой пропускной хронологический срок службы анализа, описанного здесь, является эффективным методом для количественного старения потенциал большого числа штаммов с высокой точностью и точностью. Первичного продвижения этого метода по сравнению с классическими методами для опре?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Peptone	Reagent	BD Biosciences	211677
Bacto Yeast Extract	Reagent	BD Biosciences	288620
Difco Agar	Reagent	BD Biosciences	214530
Yeast Nitrogen Base w/o A.A. and A.S.	Reagent	MidSci	J630-500G
Amino Acids	Reagent	Sigma-Aldrich
Ammonium Sulfate	Reagent	Spectrum	AM185
Dextrose	Reagent	Fisher Scientific	D16-10
Bioscreen C MBR machine	Tool	Growth Curves USA	5101370
Bioscreen 100-well Honeycomb plate	Tool	Growth Curves USA	9502550