Фермент связанных Immunospot анализ (ELISPOT): Количественная оценка Th-1 клеточного иммунного ответа против микробных антигенов

Резюме

Идентификация микробного целей адаптивного иммунитета при идиопатической болезни может быть достигнуто путем использования фермента связаны immunospot анализа.

Аннотация

Адаптивный иммунитет является важным компонентом для оформления внутриклеточных возбудителей. Способность обнаруживать и количественно эти реакции в организме человека является важным диагностическим инструментом. Фермент-связанного immunospot анализа (ELISPOT) приобретает все большую популярность благодаря своей способности идентифицировать клеточные реакции иммунитета против микробных антигенов, в том числе иммунитетом населения, таких как люди с ВИЧ инфекцией, трансплантации и использования стероидов. Этот анализ имеет возможность количественно иммунного ответа против антигенов микробов, а также отличить, если эти ответы Th1 или Th2 характер. ELISPOT не ограничивается месте воспаления. Он является универсальным в своей способности оценить для иммунных реакций в периферической крови, а также сайты активного участия таких как бронхоальвеолярного лаважа, спинно-мозговой жидкости, а также асцит. Обнаружение иммунных реакций против одного или нескольких антигенов возможно, а также конкретных эпитопов в микробных белков. Этот анализ облегчает обнаружение иммунных реакций с течением времени, а также различия в антигенов признан клетках-хозяевах T. Двойной анализов ELISPOT цвета доступны для обнаружения одновременного выражения двух цитокинов. Последние заявки на эту технику включать диагностику внелегочного туберкулеза, а также исследования вклада инфекционных антигенов к аутоиммунным заболеваниям.

протокол

За следующий протокол, мы используем мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), а клетки интерес. Однако, этот протокол может быть использован с другими типами клеток. Выполните тест, в капоте культуры тканей с использованием стерильной техники.

День 1: подготовка пластин и клеток

1. Выньте ELISPOT пластине и откройте его в капот.
2. Промыть пластины в 3 раза с 150 мкл 1X PBS помощью многоканальной пипетки, если таковой имеется, в противном случае одной скважины пипетирования является приемлемым.
3. Выньте пакет водоемов и открыть его в капот.
4. Добавьте 2 мкг / мл захват антитела, анти-человеческий интерферон-γ, до 11 мл 1X PBS. Vortex хорошо. Передача антител микс на водохранилище.
5. Разместить 100 мкл раствора для покрытия в каждую лунку использовании многоканальных.
6. Оберните пластину в парафильмом.
7. Место пластину на ночь в холодильник. Пластины хороши на несколько недель. Эмпирическое правило, что если до сих пор остается в жидком скважин, пластины могут быть использованы.

Сотовые подготовка

Если МНПК свежие затем подсчитать клетки и инкубировать в течение ночи при 37 ° C с 5% CO _2. Для РВМС хранятся в жидком азоте, оттаивания клеток необходимо. Протокол выглядит следующим образом:

1. Оттепель криопробирку клеток в 37 ° С водяной бане, пока почти полностью оттаять.
2. Сразу ресуспендируют в 5 мл R10 СМИ.
3. Спиновые течение 5 минут при 225 х г.
4. Ресуспендируют раз в 5 мл R10 СМИ и подсчета жизнеспособных клеток с трипановым синий.
5. Принесите концентрации до 2 х 10 ^{6 клеток} / мл в R10 СМИ.
6. Отдых в течение ночи при 37 ° C с 5% CO _2.

День 2: создание пластины

1. Табличке с крышкой с образцами идентификационный номер, а условия и даты.
2. Промыть пластины в 6 раз с 150 мкл стерильного 1x PBS использовании свалки и промокните метод. Будьте осторожны, чтобы не всплеск пластины в то время как демпинг. Это может привести к скважинам пластины становятся пурпурными.
3. Добавить 100 мкл R20 в каждую лунку.
4. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение 1 часа.
5. В то время как пластина инкубации, граф клеток, которые отдыхали в одночасье.
6. Спиновые клеточной суспензии при 1500 оборотов в минуту в течение 5 минут. Декантируйте супернатант и ресуспендируют осадок, так что у вас есть конечной концентрации 1х10 ^{6 клеток} на 1 мл в R10 СМИ.
7. После 1 часа инкубации удалить R20 использовании свалки и промокните метод. Будьте осторожны, чтобы не всплеск пластины в то время как демпинг.
8. Добавить 100 мкл клеточной решение (10 ⁵ клеток) в каждую лунку. Добавить соответствующие пептиды и / или антигенов в соответствующие лунки в двух экземплярах. Используйте новый наконечник пипетки каждый раз, когда вы идете в пептид рабочего раствора. Нормальная концентрация пептида 10-40 мкг / мл. Так как пептиды меняются, каждый исследователь должен титровать пептидов для получения оптимальных результатов.
9. В отрицательном скважин контроля, только добавить клетки (без пептиды)
10. В положительном скважин управления, добавьте фитогемагглютинином (ФГА, 10 мкг / мл; Sigma).
11. Выдержите в течение ночи при 37 ° C с 5% СО ₂ (~ 18 часов).

День 3: Разработка пластины

1. Промыть пластины в 6 раз с 150 мкл 1xPBS использовании свалки и промокните метод.
2. Добавить 100 мкл PBS в каждую лунку пластины с использованием многоканальной пипетки.
3. Положите пластину в холодильник на 15 минут.
4. Возьмите пластину из холодильника и поместить его в капот культуры ткани.
5. Подготовка решения биотином антител
   • Добавить 0,5 мкг / мл антитела, биотин (МАБ 7-В6-1) к 11mL PBS.
   • Vortex решение хорошо перемешать.
   • Если планируете добавить решения с использованием многоканальных, залить ее в резервуар.
6. Отменить PBS, щелкая его в мусорную корзину. Будьте осторожны, чтобы не всплеск пластины в то время как демпинг.
7. Разместить 100 мкл раствора в каждую лунку.
8. Инкубируйте планшет в капюшоне культуре ткани при комнатной температуре в течение одного часа.
9. Промыть пластины в 6 раз с 150 мкл 1xPBS использовании свалки и промокните метод. На ^6-й стирки, оставьте PBS на тарелку, пока вы не подготовлены Стрептавидином антител.
10. Подготовка Стрептавидином антител.
    • Добавить 5,5 л μ Стрептавидином антител (стрептавидин-ALP) для 11mL PBS (1:2000 разбавления).
    • Vortex решение хорошо перемешать.
    • Если планируете добавить решения с использованием многоканальных, залить ее в резервуар.
11. Отменить PBS, оставшихся в скважинах и промокните пластины.
12. Добавить 100 мкл Стрептавидином раствора в каждую лунку.
13. Инкубируйте планшет в капюшоне культуре ткани при комнатной температуре в течение 1 часа.
14. Промыть пластины в 6 раз с использованием PBS свалки и промокните метод. На ^6-й стирки, оставьте PBS на табличке, пока вы не сделали цветовое решение.
15. Работа в темное время суток. Подготовка щелочной раствор субстрата фосфатазы (щелочной фосфатазы Субстрат Kit IV BCIP / НБТ):
    • Добавить 4 капли реагента субстрата с 1 по 11 мл трис-буфера, вихревые хорошо. Добавить 4 капли реагента субстрата 2 до Трис буфера, вихревые хорошо. Добавить 4 капли реагента субстрата 3 до Трис буфера, вихревые хорошо.
16. Удалите оставшиеся PBS и промокните пластины.
17. Добавить 100 мкл цветовое решение в каждую лунку пластины с использованием многоканальной.
18. Включите свет после 5 до 10 минут цвет развивается.
19. Разрешить цвет реагентами, чтобы остаться на пластине, пока пятна начинают свою очередь, фиолетовый и совершенно темно. Это должно занять от 5 до 20 минут. Будьте осторожны, чтобы не оставить раствор субстрата слишком долго, так как это может привести к высоким фоном.
20. Промыть пластины ELISPOT 3 раза с водопроводной водой.
21. Оставьте сохнуть в течение часа или на ночь.
22. Прочитано пластину вручную или с читателем пластины ELISPOT.
23. Магазин пластину в коробку от освещенности.

Представитель Результаты:

ELISPOT предназначен для количественного определения иммунного ответа против микробных антигенов. Каждое пятно указывает на одну ячейку реагировать, выражая цитокинов интересов. Пятна можно пересчитать вручную или с помощью читатель ELISPOT пластины.

Оценки, которые ELISPOT была выполнена правильно следует начинать с исследования отрицательного контроля для фона производство цитокинов интересов. В отрицательном скважин контроль можно было бы ожидать, чтобы увидеть без пятен, хотя небольшой фон (фиолетовый цвет) может присутствовать. Как правило, не должно быть меньше, чем в среднем на пять мест на лунку. Положительный контроль скважин подтверждают, что реакция была выполнена правильно, и что клетки реагируют на антигенную стимуляцию. В положительном скважин контроль можно было бы ожидать, чтобы увидеть глубокий фиолетовый фон из-за слияния пятна (Рис1). Там должно быть немного, чтобы не белом фоне. Если положительный контроль и отрицательные контрольные образцы были подходящими, то можно считать скважин содержащих антиген интереса. "Неоптимальный" результат будет отражен высокий фон (скважины фиолетовый), без пятен или очень мало пятен, пустой центр, плохо определены пятна или сливной пятна. Список советы по устранению неполадок обеспечивается (табл. 1).

Рисунок 1. Представителем пластины ELISPOT. Каждая пластина должна содержать положительного контроля, отрицательного контроля и пептида интереса проводятся на минимум в двух скважин. С9, C10, D9 и D10 являются положительными скважин контроля, как вы можете видеть есть темно-фиолетового цвета, сливающиеся клетки, и едва ли белом фоне. Отрицательные скважин управления G11, G12, H11 и H12. Эти скважины не имеют фиолетовый фон, а не пятнами, как ожидалось. Пятна G7, G8, H7 и H8, иллюстрирующие клеточных реакций на микробный пептидов; фиолетовые пятна представляют собой единый реагировать ячейки выражения цитокинов интересов.

Таблица 1

Наблюдение	Возможная проблема	Возможное решение
Высокий фон	1. По обе стороны мембраны не мыть правильно 2. Слишком много клеток, секретирующих цитокин 3. Пластина не высохла должным образом 4. За разработанные пластины	1. Вымойте обе стороны мембраны с помощью дистиллированной воды до и после окрашивания. Реагенты могут просочиться через мембраны в основание плиты, и они могут вызвать высокий фон, если не смыть. 2. Уменьшите количество клеток на лунку, это потребует оптимизации 3. Сухие пластины дольше, прежде чем читать 4. Сокращение времени разработки
Нет пятен / Очень немногие Пятна	1. Не хватает клетками цитокинов секретирующих / белок 2. Обеспечить клетки стимулируются правильно 3. Клетки не выдерживают лОнг достаточно или может занять некоторое время, чтобы ответить на стимулятор 4. Недостаточное развитие цвет 5. Не хватает первичных или вторичных антител	1. Увеличение количества клеток. Это потребует оптимизации 2. Кроме того, использование положительного контроля стимуляция - стимулятор, который вы знаете, будут вызывать выражение вашего цитокинов / белок 3. Увеличение времени инкубации ячейки или использовать косвенный метод (предварительная обработка клеток с стимулятор) 4. Монитор цветной развития с головой микроскопом и убедиться, что развивающиеся реагенты хранились правильно и не потеряли деятельности 5. Концентрация первичных и / или вторичные антитела должны быть увеличены. Это потребует оптимизации.
Пустые области	1. Мембрана не предварительно обработанных 2. Мембранные высыхания на определенном этапе 3. Клетки распределяются неравномерно	1. Обеспечить мембрана адекватно предварительно с 70% этанола (все мембраны не нужно это так, свяжитесь с поставщиком). Промыть хорошо с PBS 3 раза после 2. Обеспечить мембраны не сушит 3. Убедитесь, что вы смешивать клетки осторожно, чтобы иметь хорошую гомологичных клеточной суспензии до пипетирования из в лунки
Пустой центр	1. Ущерб от стиральной	1. Расход на автоматизированных шайбу (или пипетки), может быть слишком высокой. Нужна более мягким процедуры промывки
Ложные срабатывания	1. Вторичные агрегатов антител 2. Клетки до сих пор на мембране 3. Загрязнения клеточных культур	1. Фильтры вторичными антителами 2. Убедитесь, что все клетки отмывали от мембраны с PBS Tween 20 до вторичного инкубации антител. Клетки левого на мембране даст неправильной формы пятна 3. Храните реагенты, стерильные и чист, как это возможно. Убедитесь, что ваша культура клеток техника асептических. Проверьте ложных срабатываний, запустив СМИ отрицательного контроля. Для движения платформ, видеть плохо определены места
Сливной Пятна	1. Бедные покрытия, слишком много антител 2. Длительное культуре клеток 3. Клетки чрезмерно стимулировали	1. Сокращение первичных концентрации антител 2. Чем дольше клетки инкубируют, более цитокинов / белок они выделяют. Это приведет к большей пятна, которые начнут сливаются и становятся неразличимы. 3. Уменьшить культуре клеток шаг инкубационного периода. Чрезмерная стимуляция приведет к много цитокинов / белка выделяется клетки. Это даст пятна, которые начнут сливаются и становятся неразличимы. Уменьшить количество стимуляторов в культуре средств массовой информации и культуры для более короткий промежуток времени
Плохо определены пятна	1. Мембрана не предварительно обработанных (если ваша оболочка требует этого, обратитесь к поставщику) 2. Пластина движения во время клеточного инкубации	1. Мембраны должны быть предварительно обработаны с этанолом или это может привести к нечеткой, плохо определены пятна. Это будет трудно для читателя, чтобы отличить эти 2. Не допускайте, чтобы переместить пластину во время клеточного инкубации, как клетки, которые перешли будет создано более одной точке. Если возможно использовать специальный инкубатор, который не будет открыта во время инкубации. Не нажимайте пластины после добавления клетки
Положительный контроль скважин низкой	1. Недостаточный уровень развития - может быть результатом использования стрептавидином-ALP и / или BCIP / НБТ решения, которые не были доведены до комнатной температуры	1. Приведите реагенты до комнатной температуры перед добавлением в лунки
Плотность пятен затрудняет их количественного	1. Слишком многие клетки были добавлены в скважинах	1. Сделать разведения клеток (например, 1 х 10 6, 5 х 10 5, 1 х 10 5, 5 х 10 4, 1 х 10 4 клеток на лунку), чтобы определить оптимальное количество ячеек, которое приведет к образованию различных пятен

Обсуждение

Анализ ELISPOT стала одним из наиболее важных и широко используемых тестов для контроля иммунного ответа в организме человека и множество других видов. При анализе ELISPOT, иммунная клетка частот могут быть измерены на одном уровне клетки без расширения или манипуляции клеточных популяций. E...

Материалы