Методы Анализ Drosophila Поведение

Резюме

DROSOPHILA MELANOGASTER является генетически и поведенчески послушный модели системы, которая была использована, чтобы понять молекулярные и клеточные основы многих важнейших биологических процессов на протяжении более века ^1. Дрозофилы было хорошо использовали, чтобы получить понимание генетической основы лету поведения.

Аннотация

DROSOPHILA MELANOGASTER, дрозофилы, была использована для изучения молекулярных механизмов широкого спектра заболеваний человека, таких как рак, сердечно-сосудистых заболеваний и различных неврологических заболеваний ^1. Мы оптимизировали простой и надежной поведенческие тесты для определения личиночных передвижения, взрослым возможность восхождения (RING анализа), и ухаживания поведения дрозофилы. Эти поведенческие тесты широко применяются для изучения роли генетических и средовых факторов на лету поведение. Личинок возможность сканирования могут быть надежно использованы для определения ранней стадии изменения в обход способности личинок дрозофилы, а также для изучения влияния лекарств или генов человека заболевания (у трансгенных мух) на их передвижение. Личиночной анализ сканирования становится все более применима, если выражение или отмены ген вызывает летальность в куколки или взрослой стадии, так как эти мухи не доживают до взрослого, где они в противном случае могут быть оценены. Это основнойssay также может быть использован в сочетании с ярким светом или стресс изучить дополнительные поведенческие реакции у личинок дрозофилы. Ухаживание поведение широко используется для исследования генетических основ сексуального поведения, а также может быть использована для изучения деятельности и координации, а также обучения и памяти. Drosophila брачного поведения включает в себя обмен различных сенсорных стимулов, включая визуальные, слуховые и хемосенсорной сигналы между мужчинами и женщинами, которые приводят к сложной серии хорошо характеризует поведение двигателя кульминацией успешного спаривания. Традиционное восхождение взрослых анализы (отрицательный geotaxis) являются утомительным, трудоемким и занимает много времени, со значительным изменением различных испытаний ^2-4. Быстрый итеративный отрицательный geotaxis (RING) анализ ⁵ имеет множество преимуществ перед более широко используются протоколы, обеспечивающие воспроизводимое, чувствительный, и высокая пропускная способность подхода к количественному опорно-двигательного взрослых и отрицательные geotaxis бehaviors. В кольце анализа, несколько генотипов или медикаментозного лечения может быть проверена одновременно с использованием большого количества животных, с высокой пропускной способностью подход делает его более сговорчивым для скрининга экспериментов.

протокол

А. Анализ личинок Crawling

1. Личинки коллекции

1. Установка 8 унций бутылку мух (10-15 мужчин + 10-15 женщин).
2. Давайте мухи откладывают яйца в течение 24 часов, затем снимите бутылку мух. (Передача взрослых в новую бутылку и повторять по мере необходимости).
3. Инкубируйте бутылку в течение 3-4 дней, или до третьего возраста личинки видны.
4. Добавить 50 - 100 мл 20% сахарозы в бутылку с личинками и оставьте на 20 минут. Личинки всплывают наверх.
5. Сбор личинок помощью 25 мл пипетки серологические кончиком отрезаны, и место в сетку корзины.
6. Вымойте личинок в сетку корзины в два раза деионизированной H ₂ O. Личинки готов к экспериментам.

2. Для лечения личинок с наркотиками

1. Используйте щетку для транспортировки нужное количество личинок 5 мл стакан, содержащий раствор 5% сахарозы + наркотиков.
2. Давайте личинки питаются в течение 15 минут.
3. Налейте наркотиков обработанных личинок в сетку корзины и полоскания. Теперь они готовы к использованию.

3. Опорно-двигательного анализ (измерение общее расстояние, пройденное или сокращениями стенки тела)

1. Используйте щетку для перевозки отдельных личинки:
   1. 15 см, чашки Петри, содержащие 2% агарозном (ранее налил и позволили, чтобы укрепиться) на миллиметровой бумаге с 0,2 см ² сетки.
      1. Подсчитать количество линий сетки пересекаются в 1 минуту.
   2. Ну стеклянной посуде рассечение содержащий разбавленный раствор пасты дрожжей.
      1. Граф перистальтику сокращений (полного переднего до заднего движения = 1 сжатие) в течение одной минуты, соблюдая при вскрытии микроскопом.
2. Повторяйте, пока желаемое количество личинок были подсчитаны.

Б. Быстрое итеративный отрицательный geotaxis (RING) протокола

Этот анализ был первоначально де-описывается Гаргано и др. ^5.

1. Соберите вновь появился взрослый самец мухи под свет CO ₂ обезболивания и поместить в стандартный флакон с пищей (или питание + лекарство).
2. Поддерживать мух при комнатной температуре (от настольных. ~ 22 ° C) в течение 2-3 дней, чтобы обеспечить восстановление CO ₂ (и накопление стационарного уровня препарата в случае необходимости).
3. Передача около 25 мух без обезболивающего, чтобы подготовленные ампулы из полистирола.
4. Соберите флаконах с мухами в кольцо аппарата (рис. 1).
5. Позвольте мух, чтобы акклиматизироваться к окружающей среде, спокойно, в течение 15-20 минут.
6. За это время камера место цифровой ~ 1 м в передней части аппарата (на платформе, если это необходимо для выравнивания центра линзы на середине высоты ампулы), фокусировки и масштабирования камеры на аппарате, а также установить таймер 3,0 секунды.
7. Осторожно возьмитесь за кольцо аппарат левой рукой, чтобы не расстояниеУрО мух, и удерживайте таймер с правой рукой.
8. Резко нажмите на аппарате вниз на поверхность скамьи в три раза, убедившись, что кран достаточно сильно, чтобы сбить все мухи на дно флакона.
9. Одновременно с завершением третьего крана, начать 3 секунды таймер обратного отсчета.
10. В три секунды сфотографировать.
11. Сброс таймера в течение 1 минуты и начать. За это время сбросить камеру и сосредоточиться на аппарат, и установить еще один канал таймера в течение трех секунд.
12. Через 1 минуту, повторите шаги 1.7-1.10
13. После всего 5-6 исследования, загружать изображения на компьютер и использовать ваш любимый просмотрщик изображений, чтобы открыть и набрать среднюю высоту поднялись для каждого флакона.
14. Выполнить статистический анализ на различных группах сравнения средняя высота поднялся.

С. ухаживания и спаривания Пробирной

1. Первое, что утром, ясно и производству бутылок FLIх годов, которые будут использоваться.
2. В течение дня (каждые 3-4 часа), собирать вновь появилась сексуально наивных мужчин и женщин:
   1. Место мужчины индивидуально во флаконах или пробирках со средой.
   2. Поместите 5-6 женщин вместе в одном флаконе / трубы.
   3. Изолировать собранных мух при 25 ° С до 12 часов свет / темнота в течение 5 дней.
   4. Передача одной женщины в камеру спаривание колес.
   5. Передача одного мужчину в камеру спаривание колес.
   6. Соблюдайте пара при вскрытии микроскоп для следующего поведения:
      1. Ориентация (мужчина ориентируется на женщин)
      2. Нажатие (мужчина стучит женщина)
      3. Крыло песня (мужской расширяется и вибрирует одно крыло)
      4. Лизание (мужчина лижет женские гениталии)
      5. Керлинг (мужчины кудри его живот под себя)
      6. Спаривание попытка (Свернувшись деятельности при попытке установить женщин)
3. Соблюдайте 10 минут или до успешного спаривания, отметив, что время, в которое происходит каждый (задержки), общее время занимался в брачном поведении до совокупления (для расчета индекса ухаживания), а также число пар, которые успешно выполняют данное поведение ( частота). 100% диких пар типа обычно спариваются в течение 5 минут.
4. Вычислять ухаживание индекс (СИ), разделив время, проведенное в ухаживании, деленное на общее время до совокупления. Для диких пар типа это обычно колеблется в пределах 0,6-0,8.

D. Результаты представитель

Сканирование анализа

Нормальный дикий тип личинка будет блуждать ~ 3 см / мин, и выставки ~ 40-50 стенки тела сокращений в минуту. Недавно мы разработали модель Drosophila ФУЗ / TLS связанных бокового амиотрофического склероза, который показывает личиночной сканирование дефектов, снижение продолжительности жизни и взрослых восхождение нарушения ^6. Мы планировали выражение ое дикого типа и мутантных форм FUS / TLS для моторных нейронов (ОК-371-GAL4 водителем) и выполнил личиночной анализ сканирования. Как будет показано ниже, диких личинок типа сканирования до 12 см, в то время как выражение дикого типа FUS снизилась личиночной ползать способность примерно 6 см. Животные выражения ALS вызывающие мутации R521C в FUS / TLS обладают очень тяжелыми нарушениями в обход движения (рис. 1), ползание лишь около 1 см / мин.

Отрицательный анализ RING geotaxis

Молодые дикого типа мухи взрослых должны иметь среднее восхождение высотой ~ 4-5 см в 3 секунды времени (время может быть в диапазоне от 3-х секунд для размещения различных штаммов или уровни активности для определения заданной средней высоты для данного напряжение / лечение). Мухи, которые остаются на дне присваивается значение 0. Не рекомендуется использовать более 25 мух в одном флаконе, потому что становится трудно определить место каждого лету для измерения высоты. Nо десенсибилизация наблюдалась со скоростью до 6 последовательных испытаний расстоянии 1 минуты друг от друга, у нас работает. Очень важно не для повторного использования полистирола тестирования флаконов в этом тесте после первого набора данных собраны, потому что новые мухи помещается использовать флаконы не вырастет в той же степени, как в свежем ампул.

Рисунок 1. Установки для RING анализа. Цифровая камера помещается ~ 1 м в передней части устройства, содержащие мух в полистирола флаконах; фокус и зум камеры на аппарате, а также установить таймер до 3,0 секунд.

Рисунок 2. Представителю данные из личиночной анализ сканирования использовании мух эктопически выражения UAS-FUS WT, и UAS-FUS R521C под контролем водителя двигательных нейронов (OK371-GAL4).

Обсуждение

Drosophila поведение жестко регулируется генетическими и экологическими факторами. Мы и другие, которые ранее использовались тесты, описанные здесь, чтобы собрать данные для изучения генов, связанных с поведением летать и нейродегенеративных заболеваний человека моделируется в Dros...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу
Сахароза	Fisher Scientific	S5-500
Агароза	Invitrogen	16500-500
6 унций Drosophila бутылки	Genesee Научные	32-130
Paint Brush (# 1)	Тед Пелла, Inc	11859
Лети пищевых компонентов
Кукурузной муки	Fisher Scientific	NC9109741
Агар	Genesee Научные	66-104
Меласса	Fisher Scientific	NC9349176
Пропионовая кислота	Acros	14930-0010
Tegosept	Вершина	20-258
Этанол	РыбакНаучный	BP2818-4
Дрожжи	Genesee Научные	62-107