В режиме реального времени Digital Imaging лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия при ишемии-реперфузии (ИРИ) в мышцах Кремастер Крысы

Резюме

Цифровой прижизненной микроскопии эпифлуоресцентной посткапиллярных венул в cremasteric микроциркуляция является удобным способом для получения понимание лейкоцитов эндотелия взаимодействия В естественных условиях При ишемии-реперфузии (IRI) из поперечно-полосатой мышечной ткани. Мы здесь представить подробный протокол безопасно выполнять технику и обсудить ее применения и ограничения.

Аннотация

Ишемии-реперфузии (ИРИ) был вовлечен в большое множество патологических состояний, таких как инсульт, инфаркт миокарда, кишечной ишемии, а также после трансплантации и сердечно-сосудистой хирургии ^1. Реперфузии ранее ишемические ткани, в то время важное значение для предупреждения необратимых повреждение ткани, вызывает чрезмерное воспаление пораженной ткани. Рядом с производством реактивных форм кислорода, активации системы комплемента и повышенной проницаемости капилляров, активации лейкоцитов является одним из принципа актеров в патологический каскад воспалительных повреждений тканей при реперфузии. ^{2, 3} лейкоцитов активации многоступенчатый процесс, состоящий прокатки, сцепление фирмы и переселение и опосредуется сложным взаимодействием молекул адгезии, в ответ на хемоаттрактантов такие как дополнение факторов, хемокинов, или тромбоцитов, фактор активации ^4. <с классом = "jove_content"> В то время как лейкоциты прокатки в посткапиллярных венул преимущественно опосредовано взаимодействием селектины ⁵ их счетчик лигандов, фирма адгезии лейкоцитов к эндотелию является селектина контролируемые через связывание молекулы межклеточной адгезии (ICAM) и сосудистые сотовых молекул адгезии (VCAM). ^{6, 7}

Золотой стандарт в естественных условиях наблюдения лейкоцитов эндотелия взаимодействия является метод прижизненной микроскопии, впервые описанная в 1968 году ^8.

Хотя различные модели IRI (ишемии-реперфузии) были описаны для различных органов, ^9-12 мало подходит для прямой визуализации лейкоцитов набор в микроциркуляторного русла на высоком уровне качества изображения ^8.

Мы здесь способствовать цифровой прижизненной микроскопии эпифлуоресцентной посткапиллярных венулы в cremasteric микроциркуляциюкрыс ¹³ как удобный способ для качественного и количественного анализа лейкоцитов набор для IRI-исследований в поперечно-полосатой мышечной ткани и обеспечивает детальное руководство для достижения техники. Мы также иллюстрируют распространенные ошибки и полезные советы, которые должны позволить читателю по-настоящему оценить и безопасно выполнять методом.

В шаг за шагом протокол изобразить, как начать работу с дыханием контролируемой анестезии при достаточном мониторинга держать животное твердо наркозом в течение длительного периода времени. Затем описываются cremasteric подготовка в виде тонкого плоского листа за выдающиеся оптическим разрешением и обеспечивают протокол лейкоцитов изображений в ИРИ, который был хорошо зарекомендовали себя в наших лабораториях.

протокол

1. Анестезия и мониторинга

1. Соответствующие национальные и институциональные этика должна быть на месте до выполнения экспериментов на животных. После одобрения со стороны комитета по этике Anesthetize мужчина Sprague Dawley крыс с массой тела от 120 - 180 г. Доставка 2 - 3% по объему ИФ в окно из плексигласа с помощью ИФ испаритель и поместить крыс внутри.
2. Как только соответствующий уровень анестезии достигается (отсутствие реакции на ноги или хвост щепотку) крыс взвешивают и побрился на брюшной шейной области.
3. Положите крысу в спинной лежачее положение на грелку, чтобы поддерживать температуру тела на 37 ° С и применяются ИФ на 2% по объему использования силиконовой маске.

Следующие шаги подготовки лучше всего достигается с помощью операционного микроскопа.

4. Для подготовки трахеи, сонной артерии и яремной вены, выполнить 2 см, горизонтальный разрез кожи в области ое супрастернальные выемку и мобилизации слюнных желез в сторону.
5. Вы сейчас столкнулись брюшной мышцы шеи. Аккуратно разделить их по средней линии и найти трахеи. Выставьте 1 - 2 см, трахеи и разместить микро щипцы под ней, чтобы поднять его вверх.
6. Теперь перерезать примерно на полпути через брюшную сторону трахеи. Будьте осторожны, чтобы не порезать весь путь до конца, если вы делаете, срез трахеи сползет обратно в грудь и очень трудно работать.
7. Вставьте Abbocath трубки (14G), используемых в качестве трахеи трубки в нижней части трахеи, которая ранее была связана с животными вентилятора. Совет: Фирма фиксацию на магнитных зажимов, а также ушивание трахеи вокруг трубы необходимо сохранить трахеи трубку на место. Обычно мы используем Terylene 5/0 шов, однако подобный шовный материал может быть использован.
8. Дыхание может быть объем контролируемых (частота 35 - 45 вдохов / мин; дыхательный объем, 4,5 - 5 мл; FiO ₂ 0,35 - 0,50;. Изофлюран 1,5 - 2% по объему) ¹⁴ Ателектаз можно предотвратить путем поддержания положительного давления в конце выдоха от 5 до 10 мм H ₂ O. ¹⁵
9. Для сонных canulation, право грудинно-подъязычный мышцы отделяются от тупой диссекции, чтобы найти сонную артерию.
10. Отделите блуждающего нерва тщательно от сонной артерии и артерии установить на угловой микро щипцы, чтобы остановить кровь течет от сердца.
11. Пройдите два куска равной длины шва под сонной артерии. Со ссылкой на сердце, тем больше дистальной шва связан плотно закрывают кровь течет из области головы в то время как проксимальный шов связано свободно вокруг сонной артерии.
12. Использование микро-ножницы небольшой надрез в сонную артерию между двумя лигатурами.
13. Вставьте полиэтиленовый катетер (0,28 мм внутреннего диаметра), наполненный физиологическим раствором, который подключен к датчику давления.
14. РемОве микро щипцы и нити катетер далее в артерии. Затем затяните проксимальных лигатуры вокруг артерии, и катетер. Совет: Применение второго проксимальный шов предотвращает кровотечение после удаления микро щипцы.
15. Свяжите дистальной лигатуры вокруг сонной и катетер для дополнительного крепления.
16. Монитор анестезии непрерывно мониторинг частоты сердечных сокращений и артериального давления. Выполните прерывистый артериальной крови газа анализа с использованием анализатора газов крови ^16. ЧСС менее 300 ударов в минуту или более 360 ударов в минуту, а также среднее артериальное давление опускается ниже 80 мм рт.ст. более 5 минут критерии исключения. ^{17, 18} Поддержание крови рН в физиологических пределах (7.35 - 7.45). В случае, если эксперимент должен быть прекращен из-за неправильного ставки мониторинга, разрыхлить животного дислокации шее или exanguation.

Для внутривенного применения флуоресцентных красителей или других лекарственных средств ое проценты, выполните следующие действия:

17. Фокус области левой яремной вены с хирургическим микроскопом.
18. С пинцетом в каждой руке, разорвать тонкую фасцию выявить яремную вену. Установите вены на угловой микро щипцы. Кровоток будет остановить.
19. Используя щипцы, два куска равной длины шва передаются под яремной вены согласованных на сонной canulation. Свяжите дистального шва плотно и проксимального шва свободно вокруг яремную вену.
20. Сделайте небольшой надрез в яремную вену и вставьте полиэтиленовый катетер (0,28 мм внутреннего диаметра), которые были сброшены с физиологическим раствором. Отметить, что разрез и canulation может быть более требовательными и трудоемким, чем в сонной артерии.
21. Пропустите катетер по направлению к сердцу и закрепите лигатуры ближе к сердцу вокруг вены и катетера.
22. После того, как соответствующий проходимости, связать дистальной лигатуры вокруг катетера. Совет: Дополнительная фиксация бого катетера с лентой может предотвратить смещение.
23. Промыть катетеры часто, чтобы предотвратить свертывание внутрипросветный.

2. Подготовка мышц Кремастер

1. Мы используем алюминий этапе 1,5 - 2 см толщины cremasteric изображений. Этап быстро принимает желаемую температуру грелки облегчая тем самым тепловой контроль cremasteric ткани. Это очень важно для воспаления исследований. Кроме платформы оргстекла могут быть использованы, хотя регулирование температуры cremasteric сложнее. Поместите мошонку в центре сцены.
2. Начальная надрез в коже и внешних семенной фасции над мошонку в очень дальний конец следует осторожнее расширение подкожных пространства с помощью тонких ножниц. Не прикасайтесь к основной ткани с инструментами.
3. Как только ткань подвергается его смоченной предварительно нагретую (37 ° С) фосфатным буферным физиологическим раствором шкальций и магний й. Применяют раствор регулярно подвергается любой ткани.
4. Соединительная ткань между внешним семенной фасции и мышцы кремастер тщательно удалены, чтобы освободить мышцы кремастер от окружающих тканей.
5. Внешняя поверхность мышцы кремастер тогда осторожно очищены от соединительной ткани. Непрерывное superfusion во вскрытии гидратов соединительной ткани, способствуя прозрачности и удаления.
6. Сшивать дистального конца мешок кремастер удерживать и немного расширить конце мешка.
7. Надрезать дистального конца мешок на брюшной аспект и удлиненный разрез проксимальнее с использованием микро ножницы. Тщательно прижечь кровоточащие сосуды вдоль линии разреза использования тепловой прижигания. Избегайте ненужных прижигание ограничить дополнительные воспалительные стимулы. Совет. Кровотока динамики вблизи периферии препарата изменены это повреждение тканей ¹⁹ Поэтому, чтобы свести к минимумусебе влияет на сбор данных, кровеносные сосуды вблизи центра подготовки должны быть использованы для работы с изображениями.
8. Открытая кремастер лежит плашмя на алюминиевой подставке, хотя по-прежнему связаны тонкой связки придатка яичка под. Отражая яичка с одной стороны выставляет этой связки в том числе небольшие артерии и вены, которые соединяют в придатке яичка. Использование прижигания для герметизации сосудов и использовать микро-ножницы, чтобы вырезать соединительной связки между яичком и cremasteric ткани.
9. Аккуратно отодвинуть изолированных яичка в паховом канале. Другие авторы резекцию яичка после проксимальной лигатуры (орхиэктомии) вместе с соответствующим паховой площадку увлечение. ²⁰ В чувствительный модели IRI индуцированной активации лейкоцитов, мы стараемся избегать любых дополнительных хирургических раздражители, поэтому мы воздерживаемся от резекции яичка, которая, как правило, не необходимо, чтобы получить достаточное воздействие на мышцы кремастер.
10. В дополнение к первойфиксации шва четырех краев ткани (по два с каждой стороны) и закрепите нити на ленту осторожно распространять cremasteric ткани радиально на алюминий стадии. Оставляя разрыв между этапом алюминия и внешнего входа в паховый канал упрощает последующее отсечение cremasteric для ишемии.
11. Место двух концах полиэтиленовый катетер (0,28 мм внутреннего диаметра) близка к cremasteric ткани superfusion установки. Убедитесь, что просвет свободен от воздуха, чтобы избежать воздушных пузырьков в конечном камеры жидкость.
12. Нарисуйте линию вазелин (вазелин) вокруг мышц кремастер помощью шприца. Строка должна увеличивать размер покрытия скольжения, который используется для освещения.
13. Для создания жидкостной камеры, поместите площадь скольжения крышки (32 × 32 мм) по сравнению с cremasteric ткань и прочно прикрепить к краям вазелином линии.
14. В случае, если cremasteric ткани не superfused с определенными наркотиками, непрерывная замена окружающих гриппомID несущественно. Однократного применения фосфатный буферный солевой раствор кальция и магния в созданную камера может затем быть достаточным. Местное стимуляция с наркотиками, однако, должна быть выполнена непрерывно через микро-перфузионного насоса со скоростью 3 мл в час.
15. Cremasteric ткань готова к микроскопических изображений.

3. Прижизненные установки

Основные прижизненный установки может отличаться. Для эпифлуоресцентной изображений эксперименты должны быть выполнены в темной комнате.

1. Животное переходит в стадию прижизненного эпифлуоресцентной микроскоп с 470 нм Светодиодный источник света для освещения эпидемии. Используйте цель погружения в воду (20 × / 1,0), чтобы достичь увеличения примерно 800 ×. Запись наблюдений с помощью высокого разрешения цифровых камер и хранить записи на персональном компьютере для автономного оценки.
2. Для лейкоцитов маркировки, вводить родамина6G внутривенно через яремную катетер в концентрации 0,4 мг / кг массы тела.
3. Выберите посткапиллярных венулы для наблюдения. Судно размер должен составлять от 20-60 мкм и приток крови должно быть достаточно. Чтобы свести к минимуму влияние предварительной активации ткани, только сосуды, в которых лейкоцитов прокатки <20 cells/30 секунд, а число присоединяющихся клеток <10 cells/200μm из эндотелия венул может быть использована для дальнейшего анализа.
4. Если это возможно, до трех посткапиллярных венул может быть использован для наблюдения, но они должны быть расположены в соответствующем разделе cremasteric ткань, чтобы избежать смешения суда в различные моменты времени.

4. Ишемии-реперфузии (ИДК)

1. Давайте ткани стабилизации в течение 30 минут.
2. Выполнение записи 30 секунд, чтобы установить базальных значений лейкоцитов качению и сцепления. В идеале, порождают в полные три базальные записи для проверки ячейкиномера и получить стандартные отклонения.
3. Аккуратно поместите клип Бимер судно вокруг самого проксимального конца подвергаются cremasteric ткани с помощью применения щипцов. Застой должно произойти немедленно и могут быть визуализированы эпифлуоресцентной микроскопии в наблюдаемых разделе судна.
4. Разнообразие время курсов могут быть использованы в зависимости от уровня повреждения требуется. Мы используем 30 минут ишемии время, как описано другими авторами. ^21-23 Снимите зажим судна впоследствии. Позвольте кровь для стабилизации в течение 15 минут.
5. Последующие записи длительностью 30 секунд можно сделать по всему реперфузионного периода (например, 30 секунд каждые 15 минут). Сохранить записи в цифровом виде для автономного анализа.
6. По окончании эксперимента крысы эвтаназии цервикальным сдвигом в достаточной анестезии, нажав тупой инструмент, как тупой край лезвия ножниц у основания черепа. С другойстороны, основания хвоста, быстро вытащил, в результате чего разделение шейных позвонков с черепом.

5. Offline анализ воспроизведения видео

1. Для автономного анализа воспроизведения видео было бы полезно использовать программное обеспечение, которое позволяет выбирать различные фотографии и наблюдение за видеоряд в замедленном темпе. Отрегулируйте яркость и контрастность соответствующим образом. Мы используем программное обеспечение, предоставленное производителем микроскоп, который позволяет измерения длины и цифрового увеличения.
2. Для количественного определения лейкоцитов прокатки, определяют виртуальные линии, которая пересекает судно вертикально, чтобы это соответствовало во всех записях. Подсчитайте количество подвижного лейкоциты, которые проходят линии в течение 30 секунд вручную.
3. Для количественной оценки сторонник лейкоцитов, определение 200 мкм судно раздел, который соответствует во всех записях ²³ Подсчитайте количество отчетливо видны лейкоциты, которые остаются неизменными в течение 30 секунд -. Таким образом definред как сторонник ^24.

6. Представитель Результаты

IRI мышц кремастер не влияет на среднее артериальное давление (САД), частоты сердечных сокращений и рН крови

Использование вышеупомянутых установки (рис. 1), мы исследовали микроциркуляцию в ИРИ в течение двух часов протокол, однако гораздо больше времени наблюдения до 6 часов возможно. Как показано на рисунке 2, IRI мышц кремастер не оказывает существенного влияния на macrohemodynamic крыс обращение как среднее артериальное давление и частоту сердечных сокращений остается стабильным на протяжении всего периода исследования. Кроме того, мы мониторинга гомеостаза частые измерения артериального рН, которые варьировались в физиологических пределах и не показали существенных межгрупповых различий.

ИРИ вызывает лейкоцитов прокатки в cremasteric обращения

Лейкоцитов эндотелия взаимодействие является одним из ключевыхсобытие в острое воспаление. С помощью прижизненной микроскопии мы обнаружили, зависящих от времени увеличение числа подвижного лейкоцитов в ИРИ мышц кремастер (рис. 3А) согласованы с предыдущими данными ^{21, 25.} Роллинг установлены в течение двух часов времени наблюдения до максимума 137,63 ± 22,55% от исходного значения после 120 минут реперфузии времени, а затем достигли статистической значимости по сравнению с мнимой оперированных животных (137,63 ± 22,55 против 99,43 ± 14,04% от базовой стоимости).

ИРИ вызывает адгезии лейкоцитов в cremasteric обращения

Для дальнейшей оценки лейкоцитов эндотелия взаимодействия мы проанализировали адгезии лейкоцитов в 200 разделе судно мкм. ИРИ вызвало увеличение числа лейкоцитов, что сторонник значительно превысили значения мнимой работает животных после 60 минут (118,33 ± 6,83 против 96,27 ± 5,78% от базовой стоимости) и далее ASCEnded 120 минут реперфузии (рис. 3В).

В целом описанные в модели естественных условиях поставки согласованных данных острого активация лейкоцитов в ИРИ в то время как выживаемость животных и обращения стабильность гарантирована.

Рисунок 1. А. Блок-схема для прижизненной микроскопии эпифлуоресцентной производительность при ишемии-реперфузии мышц кремастер крысы. После необходимых препаратов для анестезии и мониторинга, мышцы крысы кремастер подвергается для работы с изображениями. Отчеты активации лейкоцитов до и после ишемии тканей. Последующий анализ видео лучше всего выполнять в автономном режиме. B. Схема фигура на предлагаемые прижизненный установки. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

<с классом = "jove_content" FO: keep-together.within страницу = "Всегда">
Рисунок 2. IRI мышц кремастер не влияет на среднее артериальное давление (САД), частоты сердечных сокращений и рН крови. Среднее артериальное давление (А) и частоты сердечных сокращений (B) наблюдались каждые 30 минут в течение всего эксперимента через датчик давления после canulation права сонной артерии. Измерение артериального рН (C) была выполнена через 0, 60 и 120 минут. Значения среднего ± SEM из 6 разных крыс и колебался на физиологическом уровнях без существенных межгрупповых различий. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 3. ИРИ увеличивается лейкоцитов-Эндотелиальной взаимодействия в cremasteric обращения. После маркировки лейкоцитов с родамина 6G (0,4 мг / кг массы тела) прижизненной эпифлуоресцентной микроскопии был использован для определения лейкоцитов эндотелия взаимодействия реперфузии в течение 120 минут протокола через 30 минут после ишемии тканей. Записи были сделаны на увеличение примерно × 800. А. ИРИ значительно увеличивает количество подвижного лейкоцитов в посткапиллярных венул мышц кремастер 120 минут реперфузии в то время как лейкоциты качению остается стабильным в течение всего эксперимента в cremasteric ткани, которая не претерпела ишемии. Значения среднее ± SEM из 6 наблюдаемых крыс. # Р <0,05 помощью непарный тест тонн. B. число лейкоцитов сторонник значительно увеличивается в случайно выбранном разделе 200 мкм посткапиллярных судно через 30 минут после cremasteric ишемии и последующей 60 минут реперфузии тканей. Результаты получить даже моментовповторно вынесено после двух период реперфузии часов. Значения среднее ± SEM из 6 наблюдаемых крыс. # Р <0,05 помощью непарный тест тонн. C. Представитель фотографии посткапиллярных венулы до ишемии (слева) и 120 минут после IRI (справа). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Обсуждение

Лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия, производство активных форм кислорода и активации системы комплемента являются ключевыми особенностями IRI-индуцированной дисфункции ткани. ²⁶ микроциркуляции пораженной ткани рассматривается как неотъемлемый сайт воспалительные забо...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Наименование оборудования:	Компания:	Каталог №:	Комментарии:
Forene 100% (V / V)	Аббат	B506	API изофлуран
Terylene Шовный	Serag Weissner	OC108000
Portex изобразительных Диаметр полиэтиленовых труб	Smiths Медицинский	800/100/100	0,28 мм внутреннего диаметра
0,9% физиологического раствора	Fresinus Каби	808771
Изменение-наконечником люкс прижигания комплект	Bovie медицинской	Del1
Abbocath-T 14G	Venisystems	G713- A01	используется в качестве объектива трубы
Servo 900C Вентилятор	Маке		использоваться в качестве животного ventialtor
Логический преобразователь давления	Smiths Медицинский	MX1960
Sirecust 404 монитор	Сименс
ABL 700 Настольный анализатор	Радиометр		для измерения артериального газа
Грелки	Effenberger	8319
Алюминиевые этап	Alfun	AW7022
Хирургический микроскоп OPMI 6-SDFC	Carl Zeiss
Микрохирургические инструменты лаборатории си др.	S & T	767
Бимер судно клип	Динер	64,562
Применение щипцов	Динер	64,568	Клип на судно Бимер
Родамина 6G	Sigma-Aldrich	R4127
Вазелин белый DAB	Уинтроп	2726853
Крышка стекла			32x32 мм
			Прижизненные установки
Zeis Axio Scope-1 MAT	Карл Zeis	490036	эпифлуоресцентной микроскоп
470 нм светодиодные	Карл Zeis	423052	Источник света флуоресценции
Colibri 2 Системные	Карл Zeis	423052
W-план Apochromat 20x / 1,0 DIC	Карл Zeis	421452	Цель погружения в воду
AxioCam MRM Правка 3 FireWire	Карл Zeis	426509	высокое разрешение цифровых камер
Axio LE зрения программного обеспечения	Карл Zeis	410130	использовать для автономного анализа