Patch Clamp Записи в внутренних волосковых клеток уха, изолированных от данио рерио

Резюме

Цель этого видео, чтобы продемонстрировать процедуры для получения здоровых, неповрежденных клеток волос с внутренними органами уха взрослых данио рерио, а затем использовать их для патч зажим исследований, направленных на характеризующая биофизических свойств их напряжения закрытого каналов.

Аннотация

Патч зажим анализа напряжения закрытого каналов в волосковых клеток, изолированных из различных видов были описаны ранее ^1-4, но это видео представляет собой первое применение этих методов волосковых клеток из рыбок данио. Здесь мы демонстрируем метод, чтобы изолировать здоровых, неповрежденных клеток волос от всех внутреннее ухо конце-органов: мешочек, лагены, утрикулюса и полукружных каналов. Кроме того, мы продемонстрировать разнообразие в волосах размера ячейки и морфологии и приведем пример из видов записей патч зажим, который может быть получен. Преимущество использования этого данио модели системы по сравнению с другими связано с наличием у рыбок данио мутантов, которые влияют как на слуха и равновесия. В сочетании с использованием трансгенных линий и других методов, которые используют генетического анализа и манипуляций, изолятор и электрофизиологических методов, введенных здесь должно способствовать более глубокое понимание роли волосковых клеток рлежало в посредничестве этих сенсорных модальностей.

протокол

1. Предварительно экспериментальные препараты

1. Подготовьте шесть решений (см. Таблицу 1 для композиции): (а) 100 мл NZR (нормальный рыбок данио Рингер), (б) 50 мл NZR + Tricaine (MS222), (в) 10 мл NZR + BSA, (г) 100 мл Locas (низкий Ca ^{2 +} раствор), (д) 10 мл Locas + папаин, (F) 100 мл K ^{+-внутреннее} решение. Решения (а), (б), (г) и (е) могут быть сохранены на срок до одного месяца при 4 ° C. Решения (с) и (е) должны быть подготовлены в день эксперимента. Все решения должны быть комнатной температуры перед началом эксперимента.
2. Этикетка и заполнить четырех 35 мм чашки Петри примерно на полпути с решениями (а), (в), (г) и (д).
3. Сделать рассекает блюдо, заполнив 60 мм чашки Петри с Sylgard (Dow Corning, Midland, MI), а затем резки полости в ней, что позволит рыбе сидеть прямо, без опрокидывания.
4. Подготовка по крайней мере два инструмента изолятор склеивания фолликула конца собачьей шерсти до конца стеклаПипетки Пастера с суперклеем, позволяя волосам выходить за конец пипетки примерно на 0,5 см. Волосы с мягким мехом собак, как лабрадоры и Weimaraners хорошо работать.

2. Выделение слухового и вестибулярных Лабиринт

1. Жертва одного взрослого рыбок данио путем погружения в стакан, содержащий NZR + Tricaine. Визуальное наблюдение за жабры, пока все оперкулярной движения прекратились. Подождите еще десять минут, прежде чем снимать рыбу и промывка свежей NZR. Эти процедуры были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC) из университета Pepperdine, но одобрение должно быть получено от собственного учреждения.
2. Pin рыбы рассекает блюдо спинной стороной вверх, вставив одну стандартную швейных прямой контактный (около 2,5 см) через каждые глазницы и третий контакт через спинно-вентральной оси около одной трети до половины расстояния от головы до хвоста, как показано наРисунок 1А.
3. В масштаба (0,62-5x) стерео рассекает микроскопом оснащены 10-кратным окуляры, использовать весной ножницами (Fine науки Инструменты каталожный номер 15000-02), чтобы разоблачить мозга и короткий сегмент спинного мозга путем удаления крыши черепа от точки примерно 0,5 см каудально по отношению к уровню жабры вперед, к носу рыбы. Отрежьте спинной мозг и поднять мозга с тонкими щипцами (Fine науки Инструменты каталожный номер 11251-30) при одновременном сокращении спинномозговых нервов и другие вложения, снять головной мозг и выбросить (рис. 1б).
4. Вентральной половины черепа капсулу, которая остается образует «чаши», который содержит внутренние органы уха. Соблюдайте видный, белые, непрозрачные отолитов в lagenas и sacculi расположены симметрично на хвостовом конце каждого внутреннего уха и в поперечном положении мешочке отолиты более рострально (рис. 1С и 4А).
5. Снимите миску кости резки всех вентральной и боковых attachmenTS, осторожно подняв его из головы с тонким пинцетом. Поместите его в чашку Петри, содержащую Locas (рис. 1D и 4В).
6. Использование двух пар тонких щипцов, трещины, кроме чаши на ее средней линии либо захват боковых краев кости и тянет их друг от друга или, наоборот, разделения правой и левой половин, вставляя точки щипцами в центре и любопытных половинки друг от друга. Удалите два лабиринты из кости с использованием тонких щипцов (рис. 2).
7. Осмотрите лабиринты для определения слуховой и вестибулярной стороны-органов: полукружных каналов, Мешочки, sacculi и lagenas (рис. 4в). Розовато районах, находящихся под каждым отолита являются пятна содержащие волосковых клеток. Кроме того, полоса розовый внутри ампулы полукружных каналов определяет купола, где волосковые клетки расположены.
8. Осторожно снимите отолитов из лагены и маточки использованием тонких щипцов ( 2 и 4С). Это не обязательно, чтобы удалить отолита из мешочка так как это может привести к повреждению саккулярной волосковых клеток.

3. Изоляция волосковых клеток

1. С помощью пластиковой пипетки передачи (Fisher Scientific номер по каталогу 13-711-9 утра), переместить в конце органам блюдо, содержащее Locas + папаин минимизации объема жидкости передается.
2. Инкубируйте этих структур в этом растворе в течение тридцати минут при комнатной температуре.
3. В конце инкубационного периода, переместить структур блюдо, содержащее NZR + BSA и инкубировать в этом растворе в течение не менее тридцати минут. Волосы клетки будут оставаться здоровым в этом растворе в течение четырех часов, но будет ухудшаться после 1-2 часов после изоляции (см. следующие шаги).
4. В рамках подготовки к изоляторе, переместить одну из конечных органы блюдо, содержащее NZR.
5. Для lagenas и Мешочки, используют собак волосы аккуратно снимите пятна-листы розовато эпителиальных тиСГУП, которые содержат волосковые клетки (рис. 3А). Пятна могут быть зачерпнул (с использованием собачьей шерсти) из под отолитов sacculi, и купул от их местоположения внутри ампулы полукружных каналов.
6. Использование двух изолятор Инструменты, полученного на стадии 1.4, растирают макулы или купола, чтобы создать поле обломков, которое содержит волосковые клетки (рис. 3В). Разрешить клетки по крайней мере пять минут, чтобы оседают на дно тарелки перед его перемещением.
7. Переезд блюдо на стадии инвертированный микроскоп оснащен оптикой фазового контраста. Соблюдайте клеток при 40-кратном увеличении и обратите внимание на различия в морфологии. Многие клетки авокадо формы, а другие длинные и тонкие. Наличие апикальной пучки волос идентифицирует их как волосковых клеток и фазы яркости обеспечивает их здоровье. Микрофотографии изолированные клетки волос показан на рисунке 5.

4. Патч зажима данио рерио волосковых клеток

1. В рамках подготовки к перфорированныйНоминальная патч записи ^5,6, подготовить амфотерицин содержащие внутреннее решение следующим образом: место 5 мг амфотерицина В (Sigma A4888) в 1,5 мл трубки микроцентрифужных и залейте 100 мкл ДМСО. Сразу вихрь этого решения в течение 10-20 секунд, пока все амфотерицин не растворится. Затем пипеткой 625 мкл K ^{+-внутреннее} решение во второй трубке микроцентрифуге. Добавить 10 мкл амфотерицин решение K ^{+-внутреннее} решение, и вихрь, как указано выше. Раствора амфотерицина продлится несколько часов, но отказаться от окончательного решения после того, как один час.
2. Изготовление патч пипетки BF 150-86-10 боросиликатного стекла (Sutter Instruments) с помощью многоступенчатой ​​съемник (Саттер Р-1000). Пипетки должны были склонить чашу диаметром около 2 мкм и будет иметь сопротивление 1-3 МОм с решениями в таблице 1. Настройки на съемник, которые хорошо работают следующим образом: Тепло = Ramp minus10, Pull = 0, скорость = 18, Delay = 1, давление = 600. Формукончиком пипетки хорошо видно из фотографии на вставке в рис 5. Blunt "Пуля-образной" пипетки являются предпочтительными, поскольку они предлагают наименьший доступ сопротивление во время электрофизиологических записей.
3. Используйте 28 калибра Microfil иглу шприца (MF28G-5; инструменты Всемирного Precision), чтобы заполнить записи электрода на полпути с амфотерицином содержащих K ^{+-внутреннее} решение.
4. Прикрепите электрод к headstage из усилителя зажим патч. Применить -10 мВ, 10 мс Напряжение шага при 10 Гц и поддерживать положительное давление в электроде, как это маневрировал в воздухе / раствор и вниз к нижней части записи блюдо рядом с клетками.
5. Поместите электрод перпендикулярно к здоровой клетке. Когда электрод находится достаточно близко к клетке так, что она начинает отходить от исходящую решения, быстро обратное давление, применяя небольшой вакуум на электрод, пока клетка "скачки" на него. Немедленно прекратить всасывание на гоЭлектрод е и применять проведение потенциал -70 мВ внутрь электрода. В течение нескольких секунд уплотнения гигаом будет формироваться.
6. Соблюдайте емкостных токов переходных процессов при возникновении и прекращении ступеней напряжения, которые появляются вскоре после уплотнения образования. Продолжайте следить за перфорации мембраны под электродом амфотерицин, наблюдая, как переходные процессы приобретают все большие масштабы их максимального размера (примерно в десять минут).
7. Чтобы подтвердить создание целой клетки (перфорированные) конфигурации в здоровую клетку, вызывают внешние K ⁺ токов, применяя гиперполяризующего и деполяризующих шаги напряжение. Большинство клеток волос имеют видные внешние токи (см. Рисунок 6).

5. Представитель Результаты

Рисунок 4 показывает снимки, сделанные во время шагов изолятор. В панели, отолиты, связанные с lagenas, saccluli и Мешочки можно увидеть throuGH тонкий слой кости, который перекрывает их. Эти непрозрачные структуры обеспечивают удобное ориентиры, чтобы помочь в безопасном удалении конца органов от животных во время последующих этапов вскрытия. Группа B показывает «чаши» кость, которая содержит нетронутыми лабиринты и видных отолитов в Мешочки, lagenas и sacculi. Группа C показывает лабиринт, который был удален из кости. Обратите внимание на большое отолита с зубчатым краем в лагены, сосулька форму отолита в мешочек и бобовидные отолита в мешочке. Некоторые различия в размерах и морфологии видел в клетки, выделенные из лагены показано на рисунке 5. Здоровые клетки легко идентифицируется как фаза яркие с резкой периметру. Сотовые формы можно условно разделить на два класса: авокадо-образный (АВО) и длинные и тонкие (THN), хотя размеры клеток в каждой группе может значительно варьироваться (см., например AVO 1 и АВО 3). Врезка показывает кластертри ячейки, которые не были полностью изолированы друг от друга. Черного цвета и гранулированных появление клетки на вставке б легко идентифицирует эту ячейку, как мертвый. Врезка показывает, с кончика пипетки патч иллюстрирующие форму и размеры подходят для записи с этих клеток.

В настоящее время следы показано на рисунке 6, были получены в ответ на гиперполяризующего и деполяризующих шаги потенциал, налагаемые на ячейки лагены похожие на AVO 2, показанный на рисунке 5. Данной реакции в клетках различных форм и размеров может варьироваться в широких предлагая разнообразие в дополнение напряжения закрытого каналов.

Рисунках 1-3: Мультфильмы иллюстрирующий шаги в изоляции волосковых клеток.

Рисунок 1. Удаления части черепа capsuле содержащих внутренние лабиринты уха из рыбок данио.. PIN-код жертву рыбок данио спинной стороны до рассекает блюдо. B. Открытое черепа, удалить и уничтожить мозг. C. Соблюдайте отолитов в Мешочки, lagenas и sacculi. D. Удалить брюшной части черепа капсула, содержащая лабиринтов.

Рисунок 2. Удаление лабиринты из черепа капсулы.. Трещина черепа, кроме капсулы на своей средней линии. B. Удалить лабиринты из кости. C. Снимите отолитов из lagenas и Мешочки с помощью пинцета.

Рисунок 3. Изоляции волосковых клеток из лабиринтов.. Аккуратно снимите маculae с собакой волос. B. Растирают пятна с двумя волосками собаки. C. Использование изолированных клеток волос для патч зажим.

Рисунок 4. Изображения, полученные во время шагов в изоляции отдельных клеток. A. После удаления головного мозга, отолиты, связанных с двумя lagenas и sacculi (стрелки) и Мешочки (стрелки) могут быть визуализированы. B. После удаления вентральных часть черепа капсула, содержащая внутренние органы слуха от животного. Мультфильм в правой половине B определяет места левого мешочке, лагены и мешочек. Пунктирная линия показывает приблизительную позицию левого лабиринта. C. Право лабиринт (медиальный вид) D: мультфильм чертеж, иллюстрирующий ключевые части лабиринта, в C. : передняя полукругового канала, B: горизонтальный канал, C: задний канал, D: утрикулярной отолита, е: мешотчатых отолита, F: lagenal отолита. Шкала бар в D составляет 1 мм для А и В, 0,5 мм для C и D.

Рисунок 5 изолированный, здоровых клеток от лагены иллюстрирующие разнообразие морфологии; AVO. Авокадо формы клеток; THN: длинные, тонкие клетки. Врезка: кластер из трех полностью изолированными клетками; вставкой Ъ: мертвые клетки; вставкой C: кончик электрода патч, используемые в электрофизиологических записей из рыбок данио волосковых клеток. Шкала бар = 20 мкм, относится к главной фигурой, и все вставками.

Рисунок 6. Токи записано в патче зажат волосковых клеток. Усредненные ответы в ячейку (аналогично то AVO 2 на рисунке 5) до трех презентаций ступеней напряжения применяется в 10 мВ шагом от -140 мВ до +70 мВ от проведения потенциал -70 мВ. Обратите внимание на инактивации ток, который появляется в более деполяризованной потенциалов. Напряжение величины шага показаны рядом с некоторыми из следов.

Обсуждение

Тщательная диссекция конца органов и нежной обработки клеток имеет решающее значение для успешной изоляции здоровым, неповрежденным и физиологически активных клеток волос. Придерживаясь следующих советов будет гарантировать успех:

1. Это легче получить здоровые клетки от мелких рыб (2-2.5 см в длину). Крупные рыбы имеют гораздо больше капелек жира, что неясные визуализации во время вскрытия процесса.
2. Необходимо соблюдать осторожность при снятии отолитов, которые залегают на волосковых клеток. Старайтесь не прикасаться к клеткам, когда захват отолиты щипцами.
3. Лучшие результаты получаются, когда пятна и купул были сняты в виде листов и клетки растирают с эпителием.
4. Мы находим использование собак волос растирают клетки, превосходит другие методы, в том числе с использованием человеческой ресницы ^7, который не так конические и менее гибкой.
5. Во время патч зажим, применение положительного давления в тОн электрода, как она проходит через воздух / раствор важно держать наконечник чистой. Выпуск положительное давление для того, чтобы клетка "прыгать" на электрод, также важно. Этот метод очищает небольшой объем амфотерицин раствор, содержащий от наконечника, тем самым увеличивая вероятность формирования гигаом печать с камеры. В наших экспериментах мы используем перфорированные технику записи патча вместо более традиционного цельноклеточной конфигурации из-за хрупкости клеток. Попытка "идут целые ячейки" часто приводит к потере печати гигаом.

Метод, описанный здесь, даст сотни здоровых клеток волос на одно животное. Этот метод может быть выполнено при комнатной температуре и не требует специального оборудования за пределы рассекает микроскопом. В предыдущем докладе Юпитер описывает вскрытие внутреннего уха у рыбок данио помощью вентральной подход ^8. Эти авторы демонстрируют Диссеие в целом, параформальдегид фиксированные внутренние органы уха. Мы призываем читателей, чтобы посмотреть это видео для сравнения с нашими методами. Одним из преимуществ метода представленные здесь является получение живых клеток полезно для физиологических исследований. Кроме того, их использование в экспериментах патч зажим для изучения напряжения закрытого канала (как показано здесь) использование этих клеток может быть расширен для изучения клетки резонанс ^9,10, монитор нейротрансмиттеров путем измерения емкости ^11,12, расследование нейромодуляции индуцированных активация лиганд закрытого каналов ^13, а также подключиться к богатству информации, которую можно почерпнуть из использованием мутантов, которые влияют как на слуха и равновесия ^14.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Имя решения	Рецепт
(А) NZR (Нормальный данио рерио Рингера) (в мм)	116 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl 2, 3 Глюкоза, 5 Na +-HEPES, рН 7,35.
(Б) NZR + Tricaine	NZR + 0,02% 3-аминобензойной кислоты этиловый эфир метан сульфонат (Sigma A5040).
(С) NZR + BSA	NZR + 0,4% бычьего сывороточного альбумина (Sigma A2153).
(Г) Locas (Low Ca 2 + Решение) (в мм)	100 NaCl, 2 KCl, 0,05 CaCl 2, 0,05 MgCl 2, 3 Глюкоза, 30 Na +-HEPES, рН 7,35.
(Е) Locas + папаин	Locas + 0,05% L-цистеина (Sigma C1276) + 0,2% папаина (Sigma P3375).
(F) K +-внутреннее решение (в мМ)	52 K 2 SO 4,38 KCl, 1 K +-EGTA, 5 K +-HEPES, рН 7,3.