귀에 세포의 패치 클램프 녹음 절연 Zebrafish에서

요약

이 동영상의 목적은 성인 zebrafish의 내부 귀 기관에서 건강 손상 세포를 획득하고 자신의 전압 개폐 채널의 biophysical 속성을 특성화하기위한 패치 클램프 연구를 위해 사용에 대한 절차를 설명하는 것입니다.

초록

종의 다양한 절연 감각 세포의 전압 개폐 채널 패치 클램프 분석은 이전에 ^1-4 설명이 동영상은 zebrafish의 세포에 그러한 기술의 첫 번째 응용 프로그램을 나타냅니다되었습니다. saccule, lagena, utricle과 반원의 운하 : 여기 우리는 귀에 최종 기관에서 모두 건강하고, 손상 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 또한, 우리는 헤어 셀 크기와 형태의 다양성을 보여하고 얻을 수 패치 클램프 녹음의 종류의 예를 제공합니다. 다른 이상이 zebrafish 모델 시스템의 사용의 장점은 청력과 균형 모두에 영향을 미칠 zebrafish 돌연변이의 가용성 때문이다. 유전자 변형 라인과 유전자 분석 및 조작, 세포 절연 및 electrophysiological 방법을 사용 다른 기술의 사용과 함께 역할 세포 P에 큰 통찰력을 촉진한다 여기에서 소개이러한 감각 modalities을 중재에 놓여 있었다.

프로토콜

1. 사전 실험 준비

1. 여섯 솔루션을 (작품에 대한 표 1 참조) 준비 : () 100 ML NZR (정상 zebrafish 벨소리의), (B) 50 ML NZR + Tricaine (MS222), (C) 10 ML NZR + BSA, (D) 100 ML의 LoCaS (저 칼슘 ^{2 +} 솔루션), (E) 10 ML LoCaS + papain, (F) 100 ML K ⁺ - 내부 솔루션입니다. 솔루션 (가), (B), (D)와 (F) 4 ° C.에서 최대 1 개월에 저장할 수 있습니다 솔루션 (C)하며 (e)에서 실험의 날을 준비해야합니다. 모든 솔루션은 실험을 시작하기 전에 실온에서해야합니다.
2. 라벨 약 중간 솔루션 (A), (C), (D)로하고 (E) 4 35mm 페트리 요리를 채 웁니다.
3. Sylgard (다우 코닝, 미들랜드, MI)와 60mm 페트리 접시를 입력 한 다음 생선이 끝난 팁 않고 똑바로 앉을 수 그것을에 구멍을 절단하여 해부 접시를합니다.
4. 유리의 끝 부분에 개 머리 접착 고치 끝에서 두 개 이상의 셀 절연 도구를 준비superglue과 파스퇴르 피펫은 머리가 약 0.5 cm하여 피펫의 끝을 지났 확장 할 수 있도록합니다. 래브라도 리트리버의와 Weimaraners 같은 부드러운 부드러운 털로 덮인 개에서 머리카락이 잘 작동합니다.

2. 청각 및 Vestibular 미궁의 절연

1. NZR + Tricaine를 포함하는 비커에 빠져​​있는 성인 zebrafish를 희생. 모든 opercular 움직임​​이 정지 할 때까지 시각적으로 아가미를 모니터링 할 수 있습니다. 물고기를 제거하고 신선한 NZR와 린스하기 전에 추가로 10 분 동안 기다리십시오. 이러한 절차는 기관 동물 케어의 승인을 페퍼 다인 대학위원회 (IACUC)를 사용하지만, 승인을 자신의 기관에서 취득해야했습니다.
2. 에 물고기를 핀 머리에서 거리의 절반에 하나의 3 분 등쪽 - 복부 축으로 각 눈 소켓 세 번째 핀을 통해 하나의 표준 재봉 스트레이트 핀 (약 2.5 cm 길이)를 삽입하여 요리 등의 측면을 해부 에 도시 된 바와 같이 꼬리에그림 1A.
3. 줌 (0.62-5 배) 10 배 접안 렌즈가 장착 스테레오 해부 현미경에서 약 점에서 두개골 지붕을 제거하여 뇌와 척수의 짧은 세그먼트를 노출 봄 가위 (정밀 과학 도구 카탈로그 번호 15000-02)를 사용 앞으로 생선의 코에 아가미의 수준에 꼬리 0.5 cm. 척수를 잘라 척수 신경 및 기타 첨부 파일을 절단하면서 고급 집게 (고급 과학 도구 카탈로그 번호 11251-30)으로 뇌를 들어, 뇌를 제거하고 (그림 1B) 폐기합니다.
4. 남아있는 두개골 캡슐의 복부 반은 내이 (内耳) 기​​관을 포함하는 "그릇"을 형성한다. 각 내이 (内耳) 등 rostrally 측면 위치 utricle의 otoliths (그림 1C 및 4A)의 꼬리 끝 부분에 대칭있는 lagenas과 sacculi의 눈에 잘 띄는, 흰색, 불투명 otoliths을 관찰합니다.
5. 모든 복부와 측면 부착을 절단하여 뼈의 그릇을 제거TS 부드럽게 고급 집게로 머리에서 그 생각을 지울 리프팅 동안. LoCaS을 (인물 1D 및 4B)가 포함 된 페트리 접시에 놓으십시오.
6. 고급 집게 두 쌍을 사용하여 두 뼈의 측면 가장자리를 잡고 있으며 중앙에 포셉의 포인트를 삽입하고 반쪽를 떼어 내려고하면 왼쪽과 오른쪽 절반을 분리, 분해 또는 대안을 당겨 그 중간 선에서 그릇을 분리 균열 분리. 고급 포셉 (그림 2)를 사용하여 뼈에서 두 labyrinths를 제거합니다.
7. 반원의 운하, utricles, sacculi 및 lagenas (그림 4C) : 청각 및 vestibular 최종 기관을 식별 할 수 labyrinths을 검사합니다. 각 otolith 아래의 분홍빛이 도는 지역은 세포를 포함하는 maculae 있습니다. 마찬가지로, 반원의 운하의 ampullae 내부 분홍색의 띠는 세포이있는 cupula를 식별합니다.
8. 조심스럽게 고급 집게를 사용하여 lagena과 utricle에서 otoliths를 제거 ( 도 2 및도 4C). 그것은 이렇게하면 saccular 세포에 손상을 줄 수 있으므로 saccule에서 otolith을 제거 할 필요가 없습니다.

3. 헤어 셀 절연

1. 플라스틱 전송 피펫을 (피셔 과학 카탈로그 번호 13-711 - 오전 9시)를 사용하여, 포함 된 음식에 최종 장기를 이동 LoCaS + papain는 유체 이송의 볼륨을 최소화.
2. 상온에서 삼십분이 솔루션에서 이러한 구조를 품다.
3. 잠복기의 끝 부분에 NZR + BSA를 포함하는 요리로 구조를 이동하고 적어도 30 분 동안이 솔루션에 품다. 세포는 최대 4 시간이 솔루션에 건강 유지되지만 (다음 단계 참조) 분리 후 1 ~ 2 시간 후에 저하됩니다.
4. 세포 분리를위한 준비에 NZR를 포함하는 요리로 최종 장기 중 하나를 이동합니다.
5. lagenas 및 utricles를 들어, 부드럽게 분홍빛이 도는 상피 TI의 maculae - 시트를 발사하는 강아지 털을 사용하여세포를 (그림 3A)를 포함 ssue. maculae는 건져 할 수있는 sacculi의 otoliths 아래에서 (개 머리를 사용하여), 그리고 반원의 운하의 ampullae 내부의 위치에서 cupulae.
6. 단계 1.4에서 조리 두 셀 절연 도구 사용하여 세포를 (그림 3B)를 포함 파편 필드를 생성 할 수있는 망막 황반 또는 cupula을 씹다. 세포에게 그것을 이동하기 전에 접시의 바닥에 정착 할 최소한의 시간이 소요됩니다.
7. 위상 대비 광학 장착 역 현미경의 무대에 요리를 변경합니다. 40X 배율에서 세포를 관찰하고 형태의 다양성을 확인합니다. 다른 사람들이 길고 얇은 반면 대부분의 세포는 아보카도 모양입니다. 혀끝의 머리 번들의 존재는 세포로를 식별 및 위상 - 밝기는 자신의 건강을 실현할 수 있습니다. 절연 세포의 Photomicrographs는 그림 5에 표시됩니다.

4. Zebrafish 헤어 셀을 클램핑 패치

1. perfo를위한 준비장소 5 MG amphotericin B (시그마 A4888) 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 100 μl DMSO를 입력 : 정격 패치 녹음 ^5,6는 다음과 같이 amphotericin 함유 내부 솔루션을 준비합니다. amphotericin의 모든 해산 될 때까지 10~20초에 대한 즉시 와동이 솔루션입니다. 두 번째 microcentrifuge 튜브에 다음 피펫 625 μl K는 ⁺ - 내부 솔루션입니다. 위와 같이 ⁺ - 내부 솔루션 K와 소용돌이에 amphotericin 솔루션 10 μl를 추가합니다. 재고 amphotericin 솔루션은 몇 시간 지속 하나 시간 후 최종 솔루션이 삭제됩니다.
2. 다단 풀러 (셔터 P-1000)를 사용하여 BF 150-86-10 붕규산 유리 (셔터 계측기)에서 패치 피펫을 제조. 피펫은 약 2 μm의 직경 팁이 있어야하며 표 1에서 솔루션 MΩ 1-3의 저항을 갖게됩니다. 다음과 같이 작업이 잘되어 있다는 풀러의 설정 : 열 = 램프 minus10는 = 0, 속도를 당겨 = 18, 지연 = 1, 압력 = 600. 의 모양좋은 피펫의 끝은 그림 5의 삽입 C의 사진에서 분명하다. 그들은 electrophysiological 레코딩을하는 동안 최소 액세스 저항을 제공하기 때문에 갑작스런 "총알 모양의 '피펫이 선호됩니다.
3. amphotericin 함유 K ⁺ - 내부 솔루션으로 반 녹화 전극을 채우기 위해, 28 게이지 Microfil의 주사기 바늘 (세계 정밀 계측기 MF28G-5)를 사용합니다.
4. 패치 클램프 증폭기의 headstage에 부착 전극합니다. -10 뮤직 비디오, 10 Hz에서 10 밀리 전압 단계를 적용하고이 셀 근처의 녹음 요리의 맨 아래로 공기 / 솔루션 인터페이스를 통해 maneuvered되고 같이 전극에 긍정적 인 압력을 유지하고 있습니다.
5. 건강한 찾고 셀에 직교 전극을 배치합니다. 그것이 밖으로 흐르는 솔루션에서 벗어나되도록 전극이 충분히 셀 근처에있는 경우, 신속하게 전극에 약간의 진공을 적용, 압력을 반대로 그 위에 셀 "점프"까지. 즉시 일에 흡입을 중단전자 전극과 전극의 내부에 -70 mV의 개최 가능성을 적용 할 수 있습니다. 몇 초 내에 gigaohm 씰이 형성됩니다.
6. 곧 인감 형성 한 후 표시되는 전압 단계의 시작 및 종료의 용량 현재의 과도을 관찰합니다. 과도가 (약 10 분) 최대 크기에 크기에 성장 보면서 amphotericin에 의해 전극 아래에 멤브레인의 천공을 감시하고 있습니다.
7. , 건강한 셀에 전체 셀 (구멍) 구성의 설립을 확인 전압의 단계를 hyperpolarizing하고 depolarizing을 적용하여 외부 K ⁺ 전류를 유도합니다. 대부분의 세포는 눈에 잘 띄는 외부 전류를 (그림 6 참조)가 있습니다.

5. 대표 결과

그림 4는 세포 분리의 단계에서 찍힌 사진을 보여줍니다. 패널에서이 lagenas, saccluli 및 utricles와 관련된 otoliths은 throu 볼 수 있습니다GH는 뼈의 얇은 층을 overlies 것을. 이러한 불투명 한 구조 해부의 후속 단계 동안 동물에서 최종 장기의 안전한 제거에 도움 편리한 랜드 마크를 제공합니다. 패널 B는 그대로 labyrinths과 utricles, lagenas 및 sacculi의 눈에 잘 띄는 otoliths를 포함 뼈의 "그릇"을 보여줍니다. 패널 C는 뼈에서 제거되었습니다 미로를 보여줍니다. lagena에서 부채꼴 가장자리와 큰 otolith, utricle의 saccule과 콩 모양 otolith의 고드름 모양의 otolith을 확인합니다. 크기와 lagena으로부터 격리 세포에서 볼 형태의 다양성의 일부는 그림 5에 도시된다. 건강한 세포는 쉽게 날카로운 경계가있는 밝은 상으로 확인된다. 세포 모양은 약 2 클래스로 나눌 수 있습니다 : 아보카도 모양 (아보)과 긴 얇은 (thn) 각 그룹 내에서 세포의 크기가 현저하게 달라질 수 있지만 (예를 들어 아보 1 아보 3 비교). 삽입이의 클러스터를 보여줍니다에 세 세포가 완전히 서로 분리되지 않았습니다. 삽입 B에있는 세포의 블랙 색상과 세부적인 외관은 쉽게 죽은로 셀을 식별합니다. 삽입 C는 이러한 세포에서 녹화에 적절한 형태와 크기를 도시 한 패치 피펫의 끝을 보여줍니다.

그림 6에 표시된 현재의 흔적은 그림 5와 같이 아보 2와 비슷한 lagena 셀에 부과 잠재력 단계를 hyperpolarizing하고 depolarizing에 대한 응답으로 얻었다. 다양한 크기와 모양의 세포의 현재 반응은 널리 전압 개폐 채널의 보완에 다양성을 제안 다를 수 있습니다.

1-3 그림 : 세포의 분리의 단계를 설명하는 만화.

그림 1. 두개골 capsu의 제거zebrafish에서 귀에 labyrinths을 포함하는 르.. 요리를 해부에 zebrafish 등쪽면을 희생 핀. B는. 오픈 두개골은 제거하고 뇌를 폐기하십시오. C. utricles, lagenas 및 sacculi. D의 otoliths을 관찰합니다. labyrinths를 포함하는 두개골 캡슐의 복부 부분을 제거합니다.

그림 2. 두개골 캡슐에서 labyrinths의 제거.. 그 중간 선에서 두개골 캡슐을 분리 균열. B. 뼈에서 labyrinths를 제거합니다. C는. 집게를 사용하여 lagenas과 utricles에서 otoliths를 제거합니다.

그림 3. labyrinths에서 세포의 분리.. 부드럽게 교장 발사개 머리 culae. B. 두 개 머리카락과 maculae을 씹다. C.이 패치 클램프에 대한 격리 된 세포를 사용합니다.

그림 4. 이미지는 개별 셀의 고립의 단계 중에 찍은. 뇌의 제거 후 A.이 두 lagenas 및 sacculi (화살표)와 utricles (화살촉)과 관련된 otoliths를 시각적으로 할 수 있습니다. B.은 복부의 제거 후 동물의 내이 (内耳) 기​​관을 포함하는 두개골 캡슐의 일부. B의 오른쪽 반으로 만화는 왼쪽 utricle, lagena과 saccule의 위치를 식별합니다. 점선은 왼쪽 미로의 대략적인 위치를 나타냅니다. C. 오른쪽 미로 (중간보기) D : C에서 미로의 주요 부분을 보여주는 만화 그리기. : 앞 반원형 운하, B : 수평 운하, C : 뒤 운하, D : utricular otolith, E : saccular otolith, F : lagenal otolith. D의 스케일 바는 A와 B에 대한 1mm, C 및 D. 0.5 mm를 나타냅니다

그림 5 형태의 다양성을 보여주는 lagena에서 절연, 건강한 세포, 아보 :. 아보카도 모양의 세포, thn : 긴 얇은 세포. 삽입 세 불완전하게 격리 세포의 클러스터, 삽입 B : 죽은 세포, 삽입 C : zebrafish 세포에서 electrophysiological 레코딩에 사용되는 패치 전극의 끝. 스케일 바 = 20 μm의 주요 그림 및 모든 insets에 적용됩니다.

패치에 기록 그림 6. 요즘에는 헤어 셀을 고정. 셀에 평균 응답 (유사 t-70 mV의 개최 가능성에서 70 뮤직 비디오까지 -140 뮤직 비디오에서 10 MV 단위로인가 전압 단계의 세 프레젠테이션에 그림 5에서 O 아보 2). 더 depolarized 가능성에 나타나는 운영을 중지시키지 전류를합니다. 전압 단계 magnitudes는 흔적의 일부 옆에 표시됩니다.

토론

최종 기관과 세포의 부드러운 치료에주의 해부 건강, 손상 및 생리 학적 활성 세포의 성공적인 고립 중요합니다. 다음 사항을 준수하는 것은 성공을 보장합니다

1. 이 작은 물고기 (길이 2-2.5 cm)에서 건강한 세포를 얻을 쉽습니다. 큰 물고기 해부 과정이 불분명 시각화 많은 지방 방울을 갖추고 있습니다.
2. 세포를 ... 위에 가로 눕다 otoliths를 제거 할 때주의가 필요합니다. 집게로 otoliths를 잡을 때 셀을 터치하지 마십시오.
3. 최고의 결과는 maculae와 cupulae가 상피에서 triturated 시트 및 셀로 떠낸 때 얻을 수 있습니다.
4. 우리는 인간의 속눈썹에게로 테이퍼 덜 유연하지 않은 ^7을 사용 등의 다른 방법에 우수 할 셀을 씹다 할 수있는 개 머리의 사용을 찾으십시오.
5. 패치 고정, t에 긍정적 인 압력의 응용시공기 / 솔루션 인터페이스가 끝이 깨끗하게 유지하는 것이 중요하다 통해 통과로 그는 전극. 전극에 "점프"할 셀을 활성화 할 수있는 긍정적 인 압력의 출시도 중요합니다. 이 방법은 따라서 셀 gigaohm 밀봉을 형성 가능성을 증가 멀리 끝에서 amphotericin 함유 솔루션의 작은 볼륨을 삭제합니다. 우리 실험에서는 대신보다 전통적인 전체 셀 구성으로 인해 세포의 취약성의 구멍 패치 녹화 기술을 사용합니다. gigaohm 씰의 손실에 자주 결과 "전체 셀을 이동 '하려고했습니다.

여기에 설명 된 방법은 동물 당 건강한 세포 수백 얻을 수 있습니다. 기술은 실온에서 수행하고 해부 현미경 이외의 특별한 장비가 필요하지 않습니다. 할 수 있습니다 목성의 이전 보고서는 복부 접근 방법 ^8을 사용 zebrafish의 내이 (内耳)의 절개를 설명합니다. 이 작성자는 아까 그 바 말인데을 보여줍니다전체, paraformaldehyde - 고정 귀에 장기 ction. 우리는 독자가 우리의 방법과 비교를 위해이 동영상을 감상하는 것이 좋습니다. 여기에 제시된 방법 중 하나 장점은 생리적 조사에 유용 라이브 세포의 획득입니다. 이러한 세포의 사용은 정전 용량 측정 할 ^11,12을 만들어 세포 공명 ^9,10, 모니터 신경 전달 물질 자료를 공부하도록 확장 할 수 있습니다 (여기를 참조) 전압 개폐 채널을 공부하는 패치 클램프 실험에서의 사용 외에,에 의해 유도 neuromodulation 조사 리간드 게이트 채널 ¹³ 활성화뿐만 아니라 청각과 균형 ¹⁴ 모두에 영향을 미칠 돌연변이를 사용 수집 할 수있는 정보의 풍부한를 활용할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
솔루션 이름	조리법
(A) NZR (일반 Zebrafish 벨소리의) (MM)을	116 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl 2, 3 포도당, 5 오세영 + - HEPES, pH를 7.35.
(B) NZR + Tricaine	NZR + 0.02 % 3-아미노 산 에틸 에스테르 메탄 술폰산 (시그마 A5040).
(C) NZR + BSA	NZR + 0.4 % 소 혈청 알부민 (시그마 A2153).
(D) LoCaS (저 칼슘 2 + 솔루션) (MM)을	100 NaCl, 2 KCl, 0.05 CaCl 2, 0.05 MgCl 2, 3 포도당, 30 그렇단 +-HEPES, pH를 7.35.
(E) LoCaS + papain	LoCaS + 0.05 % L-시스테인 (시그마 C1276) + 0.2 % papain (시그마 P3375).
(F) K +-내부 솔루션 (MM)을	52 K 2 SO 4,38 KCl, 1 K +-EGTA, 5 K +-HEPES, pH를 7.3.