İç Kulak Saç Hücreleri Patch Clamp Kayıtlar İzole Zebrafish gelen

Özet

Bu videonun amacı yetişkin zebrafish iç kulak organları sağlıklı, bozulmamış saç hücreleri elde etmek ve daha sonra kendi voltaj kapılı kanallar biyofiziksel özelliklerini karakterize yönelik yama klemp çalışmaları için bunları kullanarak prosedürleri göstermektir.

Özet

Çeşitli türlerin izole duyu saç hücreleri voltaj kapılı kanallar Yama kelepçe analizleri önceden ^1-4 tarif ama bu videoyu zebrafish saç hücreleri bu teknikleri ilk uygulamayı temsil edilmiştir. Kesecik, lagena, kesecik ve semisirküler kanallar: Burada iç kulak sonu tüm organlarının sağlıklı, sağlam saç hücreleri izole etmek için bir yöntem gösterilmektedir. Ayrıca, biz saç hücre boyutu ve morfolojisi çeşitliliğini göstermek ve elde edilebilir yama klemp kayıtları türlü bir örnek vermek. Diğerleri üzerinde bu zebrafish model sisteminin kullanım avantajı işitme ve denge hem etkileyen zebrafish mutant durumu kaynaklanmaktadır. Transgenik hatları ve genetik analiz ve manipülasyon, hücre izolasyonu ve elektrofizyolojik yöntemler kullanan diğer tekniklerin kullanımı ile birlikte rol saç hücrelerinin p içine daha fazla fikir kolaylaştırmalıdır burada tanıttıBu duyu modaliteleri arabuluculuk yatıyordu.

Protokol

1. Ön-deneysel Hazırlıklar

1. Altı çözeltileri (kompozisyonlar için bakınız Tablo 1) hazırlanması: (a) 100 ml NZR (normal zebrafish Ringer), (b) 50 ml NZR + Tricaine (MS222), (c) 10 ml NZR + BSA, (d) 100 ml Locas (düşük Ca ^{2 +} çözelti), (e) 10 ml Locas + papain, (f) ve 100 ml K ^+-iç çözelti. Solutions (a), (b), (d) ve (f) 4 ° C'de yukarı bir ay depolanabilir Solutions (c) ve (e) deney günü hazırlanması gerekmektedir. Tüm çözümler deneyler başlamadan önce oda sıcaklığında olmalıdır.
2. Etiket ve yaklaşık olarak yarım çözümleri (a), (c), (d) ve (e) dört adet 35 mm Petri kapları doldurun.
3. Sylgard (Dow Corning, Midland, MI) ile 60 mm Petri kabı doldurma ve daha sonra bir balık devrilme olmaksızın dik oturmak için izin verecek içine bir oyuk keserek bir diseksiyon çanak olun.
4. Bir cam sonuna bir köpek saç yapıştırma folikül sonuna kadar en az iki hücre izolasyonu araçları hazırlayınYapıştırıcı ile Pasteur pipeti, saç yaklaşık olarak 0.5 cm pipet sonunun uzatmak için izin verir. Labrador Retriever ve Weimaraners gibi yumuşak tüylü köpeklerin tüyleri iyi çalışır.

2. İşitsel ve Vestibüler Labirent İzolasyonu

1. NZR + Tricaine içeren bir behere daldırılarak bir yetişkin zebrafish Kurban. Tüm opercular hareketleri sona kadar Görme solungaçları izlemek. Balık çıkarma ve taze NZR ile yıkamadan önce ek bir on dakika bekleyin. Bu prosedürler Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanan ve Pepperdine Üniversitesi Komitesi (IACUC) kullanın fakat onay için kendi kurumunuzun alınmalıdır edilmiştir.
2. Için balık Pin kafasından uzaklığın yarısına yaklaşık üçte biri dorsal-ventral eksen boyunca her göz soketi ve bir üçüncü pin aracılığıyla bir standart dikiş düz pim (yaklaşık 2,5 cm uzunluğunda) takarak çanak dorsal yüzü yukarı diseksiyon de gösterildiği gibi, kuyrukŞekil 1A.
3. Bir zoom (0.62-5x) 10x oküler ile donatılmış stereo mikroskop altında, yaklaşık bir noktadan kafatası çatı kaldırarak beyin ve omuriliğin bir kısa segment ortaya çıkarmak için makas makas (Güzel Bilim Araçları katalog numarası 15000-02) kullanın ileri balık burun solungaçları seviyesine kaudal 0.5 cm. Omurilik kesin ve spinal sinirler ve diğer ekleri kesim sırasında ince forseps (Güzel Bilim Araçları katalog numarası 11251-30) ile beyin kaldırın; beyin kaldırmak ve (Şekil 1B) atın.
4. Kalır kafatası kapsül ventral yarısında iç kulak organları içeren bir "kase" oluşturur. Her iç kulak ve daha rostrally yanal konumlandırılmış kırbacık otolit (Şekil 1C ve 4A) kaudal ucunda simetrik olarak yerleştirilen lagenas ve sacculi öne çıkan, beyaz, opak otolit gözlemleyin.
5. Tüm ventral ve lateral attachmen keserek kemik kasesini çıkarınts yavaşça ince forseps ile başının dışarı kaldırırken. Locas (Şekil 1D ve 4B) içeren Petri kabı içine yerleştirin.
6. Ince forseps iki çift kullanarak, iki kemik arasında yanal kenarları kapma ve merkezi forseps noktalarına ekleme ve yarıya meraklı ile sağ ve sol yarısı ayrılması, ya da alternatif olarak ayrı çekerek kendi orta hattan kase ayrı çatlak dışında. Ince forseps (Şekil 2) kullanarak kemik iki labirent çıkarın.
7. Semisirküler kanallar, utricles, sacculi ve lagenas (Şekil 4C): işitsel ve vestibüler end-organ tanımlamak için labirentler inceleyin. Her bir otolit altında pembemsi alanlar saç hücrelerini içeren makulaları vardır. Benzer bir şekilde, yarı dairesel kanal ampülleri içinde pembe bir şerit saç hücrelerinin bulunduğu kupulada tanımlar.
8. Dikkatlice ince forseps kullanarak lagena ve kesecik gelen otolit çıkarın ( Şekiller 2 ve 4C). O bunu yaparken sakküler saç hücrelerinin zarar verebilir kesecik gelen otolit kaldırmak için gerekli değildir.

3. Saç Hücre İzolasyon

1. Plastik bir transfer pipet (Fisher Scientific katalog numarası 13-711-09:00) kullanarak içeren çanak sonuna organları taşımak Locas + papain sıvı transfer hacmi en aza indirir.
2. Oda sıcaklığında otuz dakika için bu çözelti bu yapıların inkübe edin.
3. İnkübasyon süresinin sonunda, NZR + BSA ihtiva eden çanak için yapı taşımak ve en azından otuz dakika süreyle bu çözelti içinde inkübe edilir. Saç hücreleri dört saate kadar bu çözüm sağlıklı kalacak ama (sonraki adımlara bakın) izolasyonunu takiben 1-2 saat sonra bozulacaktır.
4. Hücre izolasyonu için hazırlık olarak, NZR içeren çanak sonu organlardan biri taşıyın.
5. Lagenas ve utricles için hafifçe pembemsi epitel ti makulaları-sayfaları çıkarmak için bir köpek saç kullanmaksaç hücreleri (Şekil 3A) ihtiva ssue. Makulaları scooped edilebilir sacculi bir otolitler altında (a köpek saç kullanılarak), ve yarı-daire şekilli kanalların ampülleri içinde kendi konumlarından cupulae.
6. Adım 1.4 olarak hazırlanan iki hücre izolasyonu araçlarını kullanarak, saç hücreleri (Şekil 3B) içeren bir enkaz alanı oluşturmak için bir makula veya kupulada çiğnemek. Hücreler taşımadan önce çanak alt üzerine yerleşmek için en az beş dakika bekleyin.
7. Faz kontrast optik ile donatılmış bir inverted mikroskop aşamasına çanak yerini değiştirin. 40X büyütme altında hücrelerde gözlemleyin ve morfolojisinde çeşitliliği dikkat. Diğerleri uzun ve ince ise birçok hücre avokado şeklindedir. Apikal saç demetleri varlığı saç hücreleri olarak tanımlayan ve faz-parlaklık sağlık sağlar. İzole saç hücrelerinin fotomikrografı Şekil 5 'de gösterilmiştir.

4. Zebra balığı Saç Hücreleri Mengene Patch

1. Perfo için hazırlıkyeri 5 mg amfoterisin B (Sigma A4888) bir 1,5 ml mikrosantrifüj tüpe ve 100 ul DMSO ile doldurun: anma yama kayıtları ^5,6, şöyle amfoterisin içeren iç solüsyon hazırlanır. Amfoterisin tüm eriyene kadar 10-20 saniye boyunca hemen vorteks bu çözüm. Ikinci bir mikrosantrifüj tüp içine Sonra, pipetle 625 ul K ^+-iç çözüm. Yukarıdaki gibi iç çözelti ^+-K ve girdap için amfoterisin çözeltisi 10 ul ekle. Stok amfoterisin çözümü birkaç saat sürer, ancak bir saat sonra nihai çözüm kaybolacak.
2. Bir çok aşamalı çektirmesi (Sutter P-1000) kullanarak BF 150-86-10 borosilikat cam (Sutter Instruments) yama pipetler Fabrikasyona. Pipetler yaklaşık 2 mikron çapları Öneri olmalı ve Tablo 1'de çözümleri ile MΩ 1-3 dirençleri olacaktır. Aşağıdaki gibi isler iyi olduğunu çektirmesi üzerine ayarları: Isı = Rampa minus10, = 0, Hız çekin = 18, Gecikme = 1, Basınç = 600. Şekliİyi bir pipet ucu Şekil 5'in ilave c fotoğraf bellidir. Onlar elektrofizyolojik kayıtlar sırasında en az erişim direniş olarak Blunt "mermi şeklinde" pipetler tercih edilir.
3. Amfoterisin içeren K ^+-iç çözümü ile yarım bir kayıt elektrot doldurmak için, bir 28 gauge Mikrofil şırınga iğnesi (Dünya Hassas Aletler MF28G-5) kullanın.
4. Bir yama kelepçe amplifikatör headstage için takılan elektrot. -10 MV, 10 Hz'de 10 ms gerilim adımlar uygulanır ve bu hücrelerin yakın kayıt tabağın tabanına karşı aşağıya doğru hava / çözelti arabirimi üzerinden hareket ettirilebilir ve olduğu gibi elektrot pozitif basıncı muhafaza.
5. Sağlıklı görünen bir hücreye ortogonal elektrot yerleştirin. Bunun üzerinden akan çözüm uzaklaşmaya başlar böylece elektrot yeterli hücre yakın olduğunda, hızlı bir elektrot için hafif bir vakum uygulanarak, basınç tersine üstüne hücre "atlar" kadar. Hemen th emiş durdurmae ve elektrot elektrot içine -70 mV'luk bir tutma potansiyel uygulanır. Birkaç saniye içinde bir gigaohm mühür oluşturacak.
6. Yakında mühür oluşumundan sonra görünen gerilim adımların başlangıcı ve bitiminde kapasitif akımı geçici gözlemleyin. Transientler (yaklaşık on dakika), maksimum boyutuna büyüklüğü arttıkça izleyerek amfoterisin tarafından elektrodu altında membran perforasyonu izlemek için devam edin.
7. Sağlıklı hücre tam hücreli (delikli) yapılandırma kurulması onaylamak gerilim adımları hiperpolarizan ve depolarizan uygulayarak dışa K ⁺ akımları ortaya çıkarmak. Çoğu saç hücreleri belirgin dışa akımları (bkz. Şekil 6) var.

5. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 4 hücre izolasyonu adımları sırasında çekilen görüntüleri gösterir. Panelin A lagenas, saccluli ve utricles ile ilişkili otolitler throu görülebilirgh kemik ince bir tabaka onları üzerler olduğunu. Bu opak yapılar diseksiyon sonraki adım sırasında hayvan son organ güvenli çıkarmaya yardım etmek için uygun görülecek sağlar. Panel B bozulmamış labirentler ve utricles, lagenas ve sacculi öne çıkan otolit içeren kemik "kase" gösterir. Panel C kemik kaldırılmış bir labirent gösterir. Lagena içinde taraklı kenarı ile büyük otolit, kesecik de kesecik ile fasulye-şekilli otolit içinde saçağı-şekilli otolit not edin. Boyut ve lagena izole edilen hücrelerde görülen morfolojik olarak çeşitlilik bazıları Şekil 5 de gösterilmiştir. Sağlıklı bir hücre kolayca keskin bir çevre ile parlak aşaması olarak tanımlanır. Hücre şekil kabaca iki sınıfa ayrılabilir: avokado-şekilli (AVO) ve uzun ve ince (thn) her bir grup içindeki hücre boyutları önemli ölçüde değişebilir olmakla beraber (örneğin AVO 1 ve AVO 3 karşılaştırın). Inset bir bir küme gösterirBu hücreler üç tamamen birbirlerinden izole edilemedi. Içerlek b hücre siyah renkli ve granüler bir görünüm kolaylıkla ölü olarak bu hücreyi tanımlar. Ankastre c bu hücrelerin kayıt için uygun şekil ve boyutlar gösteren bir yama pipet ucu göstermektedir.

Şekil 6'da gösterildiği gibi akım izleri Şekil 5'te gösterilen AVO 2'ye benzer bir lagena hücre uygulanan olası aşamaları hiperpolarize ve depolarize yanıt olarak elde edildi. Farklı boyutlarda ve şekillerde hücrelerinde Güncel yanıtları yaygın voltaj kapılı kanallar tamamlayıcı çeşitlilik gösteren değişebilir.

Şekiller 1-3: saç hücrelerinin izolasyonu adımları gösteren Çizgi.

Şekil 1. Kafatası capsu çıkarılmasızebrafish gelen iç kulak labirentler içeren le. A. Çanak diseksiyon için zebrafish dorsal yüzü yukarı feda pin. B. Açık kafatası, kaldırmak ve beyin atın. C. Utricles, lagenas ve sacculi. D otolit uyun. Labirentler içeren kafatası kapsül ventral kısmı çıkarın.

Şekil 2. Kafatası kapsül labirentler kaldırılması. A. Onun orta hatta kafatasının kapsülü dışında Crack. B. Kemik labirentler çıkarın. C. Forseps kullanarak lagenas ve utricles gelen otolit çıkarın.

Şekil 3. Labirentler saç hücrelerinin izolasyonu. A. Yavaşça ma kaldırınBir köpek saç ile culae. B. İki köpek tüyleri ile makulaları Karışım. C. yama kelepçe için izole saç hücreleri kullanın.

Şekil 4,. Görüntüler ayrı ayrı hücrelerin izolasyonu adımları sırasında alınmıştır. Beyin çıkarılmasından sonra A., iki lagenas ve sacculi (oklar) ve utricles (ok uçları) ile ilişkili otolitler görselleştirilebilir. B. ventral çıkarıldıktan sonra hayvan iç kulak organları içeren kafatası kapsül kısmı. B sağ yarısında karikatür sol kesecik, lagena ve Keseciklerin konumları tanımlar. Kesikli çizgi sol labirent yaklaşık konumunu gösterir. C. Sağ labirent (medial görünüm) D: C labirent anahtar bölümlerini gösteren Karikatür çizimi. Bir: ön yarıdairesel kanal, b: Yatay kanal, c: Posterior kanal, d: utricular otolit, E: sakküler otolit, f: lagenal otolit. D Ölçek çubuğu A ve B için 1 mm, C ve D için 0,5 mm temsil

Şekil 5 morfolojisi çeşitlilik gösteren lagena İzole, sağlıklı hücreler; avo:. Avokado şekilli hücrelerden; thn: Uzun, ince hücreler. Inset bir: Üç tam olarak izole hücre kümesi; içerlek b: ölü hücre; içerlek c: zebrafish saç hücrelerinden elektrofizyolojik kayıtlar kullanılan yama elektrot ucu. Ölçek bar = 20 mikron ana figürü ve tüm parçalar için geçerlidir.

Bir yama kaydedilen Şekil 6. Akımlar saç hücresi kenetlenir. Hücreye Ortalamalı yanıtları (benzer t-70 mV'luk bir tutma potansiyelinden +70 mV'a -140 mV 10 mV aralıklarla uygulanan voltaj adımı üç sunum için, Şekil 5'te o AVO 2). Daha depolarize potansiyelleri görünür inaktive geçerli unutmayın. Gerilim adım büyüklükleri izleri bazı yanında gösterilir.

Tartışmalar

Son organ ve hücreler nazik tedavi dikkatli bir teşrih sağlıklı, bozulmamış ve fizyolojik olarak aktif saç hücrelerinin başarılı bir şekilde izolasyon için çok önemlidir. Aşağıdaki ipuçları bağlılık başarı sağlayacaktır:

1. Bu küçük balık (uzunluğu 2-2.5 cm) sağlıklı hücreleri elde etmek kolaydır. Büyük balık diseksiyon işlemi sırasında olduğu belirsiz görselleştirme daha birçok yağ damlacıkları var.
2. Kıl hücreleri örten otolit, çıkarırken dikkatli olunmalıdır. Forseps ile otolit kapma sırasında hücreler dokunmaktan kaçının.
3. En iyi sonuçlar, makulaları ve cupulae epitel tritüre yaprak ve hücreler olarak kaldırdı zaman elde edilir.
4. Biz insan kirpik gibi konik ve daha az esnek olmayan ⁷ kullanıyorsanız dahil diğer yöntemleri, üstün olduğu hücreleri öğütmek için bir köpek saç kullanım alanı bulmaktadır.
5. Yama klemp, t pozitif basınç uygulanması sırasındaHava / çözüm arayüzü ucu temiz tutmak önemlidir aracılığıyla geçerken o elektrot. Elektrot üzerine "atlamak" için hücrenin etkinleştirmek için pozitif basınç serbest bırakılması da önemlidir. Bu nedenle bu yöntem hücreye bir gigaohm mühür oluşturan olasılığını arttırarak, uzak ucundan itibaren amfoterisin B ihtiva eden çözelti küçük bir hacim temizler. Deneylerde yerine daha fazla geleneksel tüm-hücre konfigürasyonu nedeniyle hücrelerin kırılganlık delikli yama kayıt tekniği kullanır. Gigaohm mühür kaybı genellikle sonuçları "tüm hücre go" çalışılıyor.

Burada açıklanan yöntem, hayvan başına sağlıklı saç hücrelerinin yüzlerce verecektir. Teknik oda sıcaklığında yapıldı ve bir diseksiyon mikroskobu ötesinde hiçbir özel ekipman gerektirir. Edilebilir Vallahi bir önceki raporun bir ventral yaklaşımı ⁸ kullanarak zebrafish içinde iç kulak diseksiyonu açıklar. Bu yazarlar disse göstermekbütün, paraformaldehid sabit iç kulak organlarının ction. Biz okuyucu bizim yöntemleri ile karşılaştırmak için bu videoyu izlemenizi tavsiye ederiz. Burada anlatılan yöntemlerin bir avantajı, fizyolojik araştırmalar için yararlı canlı hücrelerin elde edilmesidir. Bu hücrelerin kullanımı kapasitans ölçümleri ^11,12 yaparak hücre rezonans ^9,10, monitör nörotransmitter serbest çalışmak için uzatılabilir (burada görüldüğü gibi) voltaj kapılı kanallar incelemek için yama kelepçe deneylerde kullanılmasının yanı sıra, neden nöromodülasyon araştırmak ligand kapılı kanallar ¹³ aktivasyonu yanı sıra işitme ve denge ¹⁴ hem etkileyen mutantlar kullanılarak toplanan edilebilir bilgi zenginliği içine dokunun.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Çözüm Adı	Yemek tarifi
(A) NZR (Normal Zebrafish Ringer) (mM olarak)	116 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 3 glikoz, 5 Na +-HEPES, pH 7.35.
(B) NZR + Tricaine	NZR +% 0.02 3-aminobenzoik asit etil ester metan sülfonat (Sigma A5040).
(C) NZR + BSA	NZR +% 0,4 Bovine Albumin Serum (Sigma A2153).
(D) Locas (Düşük Ca 2 + Çözüm) (mM)	100 NaCl, 2 KCl, 0,05 CaCl2, 0,05 MgCl2, 3 glikoz, 30 Na-HEPES, pH 7.35.
(E) Locas + papain	Locas +% 0.05 L-sistein (Sigma C1276) +% 0.2, papain (Sigma P3375).
(F) K +-iç solüsyonu (mM cinsinden)	52 K 2 SO 4,38 KCl, 1 K +-EGTA, 5 K +-HEPES, pH 7.3.