Swimmeret Система Раки: Практическое руководство для рассечения нервной цепочки и внеклеточной регистрацию структуры Motor

Резюме

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

Аннотация

Здесь мы демонстрируем рассечение раков брюшной нервной цепочки. Препарат содержит две последние грудных ганглиев (T4, T5) и цепь брюшной ганглиях (А1-А6). Эта цепочка ганглиев включает в себя часть центральной нервной системы (ЦНС), что приводит скоординированной локомоции плеоподов (swimmerets): системы swimmeret. Он известен более пяти десятилетий, что в раков друг swimmeret управляется своим собственным независимым картины генерации ядра, который генерирует ритмичные переменного Задание ^1-3. Моторные нейроны, иннервирующие мускулатуру каждого swimmeret состоять из двух анатомически и функционально различных групп населения ^4. Один отвечает за отвода мощности (инсульт, PS) в swimmeret. Другие диски затяжного (обратный ход, RS) в swimmeret. Моторные нейроны swimmeret системы способны производить спонтанно фиктивный двигателя узор, который идентичен образцу, записанной в естественных условиях 1.

Целью данного отчета является ознакомление интересный и удобный модельную систему для изучения ритма генерирующих сетей и координации независимых микросхем для практических лабораторных курсов студентов. Протокол условии включает в себя шаг за шагом инструкции для вскрытия брюшной нервной цепочки раков, в пиннинга изолированной цепи ганглиев, desheathing ганглиев и записи swimmerets фиктивный шаблон двигателя внеклеточно от изолированных нервной системы.

Кроме того, мы можем контролировать деятельность swimmeret нейронов, записанных внутриклеточно из дендритов. Здесь мы также кратко описать эти методы и приведем несколько примеров. Кроме того, морфология swimmeret нейронов может быть оценена с помощью различных методов окрашивания. Здесь мы приводим примеры внутриклеточных (ионтофорезом) красителя заполнено нейронов и backfills бассейнов в swimmeret двигательных нейронов. В нашей лабораториимы используем этот препарат для изучения основных функций фиктивного передвижения, эффект сенсорной обратной связи о деятельности ЦНС и координации между микросхемами на клеточном уровне.

Введение

В swimmerets раков выполнять функцию в контроле позы и бить ритмично, когда животные плавать вперед, проветрите их норы или женщины проветрить свои яйца ^{5, 6.} The swimmerets сигнала раков, Pacifastacus leniusculus, встречаются парами из второго по пятое брюшной сегмент, с одной конечности на каждой стороне брюшной полости ^7. Центральной нервной системы производит на собственной ритмической двигателя стук, который приводит в движение swimmeret в интактных животных, а также в изолированном препарате нервной цепочки. Когда нет сенсорная обратная связь или убывания вход настоящее ритмичный двигатель модели производятся называется фиктивным передвижение ^{1, 2.} В системе swimmeret этот двигатель модели не отличается какого-либо параметра от деятельности swimmerets, измеренных в интактных животных.

Движение каждого swimmeret управляется микросхемой, который находится в и ограничивается одной сorresponding hemiganglion ^{1 -. 3} В каждой микросхемы есть шаблон генерации ядра, включает в себя пять выявленных удобства всплески интернейронов. Они могут быть функционально характеризуется либо как ингибитор хода силы (IPS) или ингибитор обратного хода (IRS) ^8. Эти IPS и IRS интернейронов не являются эндогенными генераторы, а их переменный деятельность обусловлена ​​взаимного ингибирования ^9. Потому что эти интернейронов ингибировать swimmeret моторные нейроны напрямую, переменное движение PS-RS генерируется ^10. Передвижение однако, не только требуют создания деятельности, но и координации различных независимых микросхем. В системе swimmeret такая координация устанавливается координационного микросхемы, которая гарантирует, что конечности являются активными в правильное время. Эта микросхема построена на трех определенных нейронов в каждом сегменте ^11-15.

Этот протокол предусматривает гое первый раз шаг за шагом рассечение руководство, чтобы изолировать цепь ганглиев (T4 до A6, рис 1). Мы покажем, как прикрепить Изолированная абдоминальная нервный тяж и desheathe каждый ганглий. В этом изолированном препарате нервной системы, нейроны, отвечающие за движения swimmeret готовы для использования в электрофизиологических и морфологических экспериментов. Вторая часть этого протокола демонстрирует основные особенности swimmeret узором двигателя. Это включает в себя шаг за шагом руководство для внеклеточно записи активности swimmeret двигательных нейронов. Аксоны двигательных RS нейроны проецируются через передней ветви нерва N1, в то время как аксоны PS двигательных нейронов проекта через заднюю ветви одного и того же нерва (рис 1) ^4. Поэтому их деятельность может быть записано от этих отраслей с помощью дифференциальных контактных электродов.

Рисунок 1: Изолированные нервной системы от грудного ганглия 4 (Т4) в брюшной ганглий 6 (A6) и принципиальная схема, что Т4.: Грудной ганглий 4; T5: грудной ганглий 5; A1, A2 ... A6 брюшной ганглий 1, брюшной ганглий 2 ... брюшной ганглий 6; N1: нерв N1; N2: нерв N2; N3: нерв N3; PS: рабочий ход; RS: возвращение-тактный. Направленные сокращения: = Передняя; P = задний.

Эта процедура рассечение и электрофизиологические техника продемонстрировала удобны для студентов и могут дополнять студентов практические занятия по физиологии. Изолированные цепи ганглиев был использован в ряде экспериментов по изучению функции нервной системы, координацию, или модуляцию swimmeret микросхем ^6, а также нейронную контроль адаптивного поведения в локомоции ^{16, 17.} Таким образом, система раков swimmeret обеспечивает огромное количество интересной преподавательской или тдождь возможности, которые все начинаются с рассечением брюшной нервной раков и внеклеточной записи фиктивного узором двигателя.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Эта процедура рассечение в соответствии с Директивой Европейского сообщества совета ²² сентября 2010 года (2010/63 / ЕС).

1. Подготовка

1. Получить раков, Pacifastacus leniusculus (Дана), обоих полов ≥8 см в размере. Убедитесь, что животные имеют жизненно важное значение и для живота и брюшной конечности целы.
2. Позаботьтесь, чтобы проверить панцирь, и что это кутикула жесткий и жестким. До и postmolt животные имеют мягкую панцирь и не подходит для экспериментов, потому что в процессе линьки многие Изменить параметры (например, снижение двигательной активности).
3. Соберите все инструменты и материалы, используемые во время вскрытия, закрепления и desheathing нервного мозга показано на рисунке 2 и приведены в дополнениях услуг.

На рисунке 2: Материалы и инструменты, используемые для вскрытия, закрепления и desheathing нервного мозга.

(1) большое ведро со льдом; (2) раки соленую воду; (3) физиологический раствор распылитель; (4) рассечение микроскоп; (5) рассечение блюдо; (6) сильные ножницы; (7) щипцы (8) весной ножницы; (9) Чашка Петри выстроились с четким Sylgard; (10) крепежных стержней; (11) холодный источник лампа.

2. Валовой Препарирование

1. Обезболить животное на льду в течение 15 - 20 мин. Осуществить первую часть валового вскрытия на лабораторном столе возле раковины, так как он включает стадию обескровливания и образец необходимо регулярно промывать с раками физиологического раствора во время процедуры.
2. Держите животных вентральной стороной вверх и использовать сильные ножницы, чтобы обрезать когти на своих базах в районе грудной клетки (рис 3-1). Снять левую и правую Уропод (рис 3-2).
3. Поместите животных вентральной стороной вверх в рассечение блюдо выстроились с черным Sylgard. ElevaTE головогрудь, вставив лед снизу и закрепить брюшко на тельсона (рис 4а).
4. Заполните солевой дозатор ~ 60 мл охлажденной раков физиологического раствора. Заливать раков с холодным физиологическим раствором через отверстие вильчатой ​​(фиг.4В). Избыток физиологического раствора будет стекать через порезы на уроподов. Обложка раков со льдом в течение обескровливания
5. Обезглавить животное с одного поперечный разрез только позади глаза животного, используя сильные ножницы (рис 5а). Удалить все ходильных ног рядом с базой суставов, как указано на рисунке 5B.
6. Изолировать живота с последних грудных сегментов из остальной части головогруди. Сделать первым разрез на уровне второго пешеходных ног (грудного сегмента 3), вставив кончик ножниц в отверстие второго минутах ноге и резки на противоположную сторону. (6А-1).
7. Продлить этот первый срез для обеих сторон через тОн головогруди (6А-2).
8. Переверните животного, открытого, чтобы некоторые из внутренних органов видно. Нажмите видное пищеварительной железе (рис 6В-3) к передней части образца и использовать пинцет, чтобы удалить репродуктивные органы из брюшной полости.
9. Снимите переднюю часть головогруди (6С). Использование боковые разрезы, чтобы удалить боковые части панциря, которые охватывают жабры, по обе стороны от оставшейся грудной клетки (фиг 6D-4). Удалить жабры и промыть образца с холодной физиологического раствора.
10. Продолжить рассечение с разрезом по всей длине грудины пластину, как показано на рис 6Е-5. Сделать это сокращение на максимальных боковых позициях между pleuron и swimmerets (рис 6E красной маркировкой). Перейдите на другую сторону с одной и той же разреза. Промыть образец с холодной физиологического раствора.
11. Выполните оставшиеся рассечение под dissectioп микроскоп. Поместите живота брюшной стороне раки в в рассечение блюдо выстроились с черным Sylgard и заполненной с раками физиологическим раствором так, чтобы она покрывала образец.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги (2.12-4.8) содержат направленные инструкцию для правшей экспериментаторов. В следующих шагах (2.12-6.8) важно, чтобы заменить раков физиологический раствор равномерно, каждые 20-30 мин в холодной солевой раствор, чтобы сохранить нервную систему здоровой.
12. Закрепите образец булавками насекомых сзади на тельсона и вперед на остатки панциря. Поместите образец, так что тельсона точки слева и параллельно краю стола.
13. Используйте грубые щипцы в левую руку, чтобы схватить через отверстие ходьба ног (рис 7А) и потяните образца открытый (7В белая стрелка). Определить большие два спинных сгибателя пряди (рис 7b-1 и С-1) и сократить свои вентральнойосновы, как показано на фиг.7В.
14. Определить грудины артерии (7С-2), которая спускается от спинного (сердца) к брюху, на ^4-й грудной сегмент. Это артерия находится прямо над нерва мозга (7С-3), прежде чем она проектов в рамках нервной цепочки, образуя вентральный артерии.
15. Трансекта грудины артерии. Как показано на рисунке 7С, поднимите артерии во-первых, с помощью одного лезвия ножниц, и только вырезать, когда вентрально находится нервный тяж видна.
16. Закрепите спинной сгибателей спереди (с правой стороны). Это должно быть сделано в максимально вытянутом положении булавками, чтобы они не загораживать обзор и образец остается растягивается. Когда спинной мышцы пряди крепятся (8-1), первый брюшной ганглий, A1 и A2, с соответствующими нервами N1, N2, и N3 могут видеть (рисунок 8).
17. Используйте пинцет, в левой руке, чтобы захватить спецификацииИмен на одном открытия ходильных ног. На протяжении следующей вскрытия шаги осторожно потяните, чтобы сохранить образец открытой.
18. Трансекта нервы N3 в самой отдаленной позиции от нервного тяжа. (Рисунок 8-3).
19. Сокращение мышц сгибателей, близкие к вентральной аподеме, как показано на рисунке 8-4. Позаботьтесь, чтобы не повредить нерв шнур или N2 нервы.
20. Повторите шаги 2,18 и 2,19 для N3 нервов и мышц сгибателей оставшегося брюшной ганглиях A2 до A5.
21. На последнем брюшной ганглий, A6, вырезать спинной сгибателей из брюшной аподеме и образец должен выглядеть так, как показано на рисунке 9.
22. Вырезать грудины пластину кзади от нервов A6 (9-1) и держать брюшную часть (9-2). Откажитесь от спинной части с сгибателей (рис 9-3). Fix грудины пластину вперед с контактами через отверстия в ходильных ног,и сзади А6.

3. Точная Вскрытие

1. Поместите образец под микроскопом с передней части, направленной в сторону и задней части к краю таблиц.
2. Используйте пинцет, как показано на рисунке 10А для удаления наиболее передних отделах cephalothoracic Sterna.
   ПРИМЕЧАНИЕ: грудных ганглиев и связанных с ними нервы частично покрываются за счет мускулатуры ног и cephalothoracic Sterna. Cephalothoracic Стерна образуют скелет, который отделяет боков, расположенных полостей ходильных ног друг от друга и от медиальной полостью, в которой брюшной нервной проживает.
3. Сокращение мышцы между оставшимися экзоскелетонных структур, как указано на рисунке 10B-1 и В2. Используйте пинцет, чтобы захватить и поднять передний конец брюшной нервной (рис 10С).
   ПРИМЕЧАНИЕ: нервный тяж будет поврежден в процессе таким образом избежать поднимая NERVе шнур несколько раз.
4. Разрежьте грудной нервы боков, одновременно поднимая нервный тяж (рис 10C-3). Храните эти нервы на подходящей длины для закрепления. Удалить выжатый часть цепочки ганглиев, который был подобран с пинцетом, путем срезания все ткани кпереди Т4 (рис 10C-4).
5. Поместите образец с передней части слева и сосредоточиться на А1. Отрежьте N1 нервы и N2 A1 на подходящей длины (макс. 1 см) для закрепления их.
6. Сосредоточьтесь на A2 и определить нервы N1, N2, и N3 этого сегмента (рисунок 11). Нервы N1 брюшной ганглиев А2-А5 находятся между двумя грудных кутикулы infoldings в каждом сегменте (рис 11A-1) и покрыты мускулатуры. Сделайте один разрез вдоль задней грудины кутикулы клубящийся. Начало в поперечной кромки живота и приступить к средней линии, как показано на рисунке 11А.
7. Если цель N1-прежнему бухтакрасный с тканью, как показано на рисунке 11B (красная стрелка), вырезать по мышечного пучка, но на этот раз впереди оба грудины кутикулы infoldings и нервов N1 (рис 11B-2).
8. Сокращение нерва N1 в дистальном направлении, насколько это возможно (рис 11C-3). Нерв N1 является полностью видны и передняя и задняя ветвь может быть идентифицирован (рис 11C).
9. Перейдите к противоположной нерва N1 и в первую сократить мышцы вдоль задней грудины кутикулы клубящийся, начиная медиально, недалеко от ганглия (рис 11d). Если нерв еще покрыты тканью, разрезать поперек мышечного пучка, но на этот раз впереди оба грудины кутикулы infoldings и нервов N1, как на рисунке 11B-2. Перерезать нерв N1 в дистальном насколько это возможно.
10. Вырезать нервы N2 этого ганглия до нужной длины (ок. 0,5 см) для закрепления.
11. Повторите шаги 3.7-3.11 для нервов A3-A5.
12. Вырезать нерVES ганглиозных A6, как дистально, как это возможно (рис 12а). Используйте пинцет, чтобы захватить несколько нервы A6 поднять эту ганглий и изолируют цепи ганглиев от грудины пластины.
13. Поднимая нервный тяж, осторожно потяните ее в передней направлении, как показано на рисунке 12B (белая стрелка). Как отдельные ганглии сняты, удалить вентральной артерии, что может быть присоединен к брюшной стороне нервной цепочки (рис 12С). Продолжайте эту (мягко) тянуть-Cut последовательность до тех пор, нервный тяж не полностью изолированы.
14. Передача изолированных цепь ганглиев на чашку Петри выложены прозрачного Sylgard и наполненной раков физиологического раствора (рис 12D).

4. Закрепление нервных шнура питания в чашке Петри

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте небольшие булавки, вырезанные из нержавеющей стальной проволоки (см добавок), чтобы прикрепить нервный тяж. Только прикоснуться к нервным окончанием пинцетом и не SqueezЕ связок или ганглиев.

1. Прикрепите цепь ганглиев прямой линии, в то время как применение нежный участок.
2. Упорядочить нервный тяж в чашку Петри с спинной стороной вверх (рис 13, черная линия). Брюшная сторона ганглиях, можно определить по его выпуклости; спинной стороны плоская. Pin грудной нервы сторон. Продолжить с нервами A6, растягивая нервных шнура вдоль своей продольной оси.
3. Разъем для нервов A1 на 90 ° по отношению к нервной цепочки.
4. Перейдите к A2 и прикрепить N2 нервы под углом 35-45 ° по отношению к нервной цепочки (рис 1А).
5. Отделите нервы N1 в их переднюю и заднюю ветви до закрепления как показано на рисунке 14. Используйте две пары тонких щипцов, чтобы забрать с одной парой щипцов передней и другой на задней ветви нерва N1. Будьте осторожны, чтобы выбрать только наиболее дистального концас нервных ветвей. Теперь потяните их тщательно друг от друга.
6. Прикрепите переднюю ветвь нерва N1 в 90 ° по отношению к нервной цепочки (рис 1А). Прикрепите заднюю ветвь нерва N1 между передней N1 отрасли и нерва N2.
7. Повторите шаги 4.4-4.6 для нервов ганглиев A3-A5. Хотя фиксации нервных шнур растянуть его в продольном, так и поперечном направлениях.

5. Desheathing ганглиях

1. Поместите препарат таким образом, что руки экспериментатора всегда опираясь на стабильном плоскости, чтобы избежать тряски. Для того, чтобы desheath ганглиях осветить нервный тяж снизу.
2. Сосредоточьтесь на любой брюшной ганглий A1 до A5. Используйте прекрасным весенним ножницы, чтобы сделать небольшой боковой разрез через ганглий оболочки, позади ганглия и между нервы N2 и N3 (15А красная стрелка).
3. Возьмите ганглиев оболочку, используя очень Fап пара та щипцы и вырезать поперек над связок влагалища, как показано на рис 15A-1. Будьте осторожны, не сжимайте и не перерезать нерв шнур с ножницами.
4. Все еще ​​держа и подъема ганглиев оболочку с пинцетом продолжают сокращать его вдоль боковых границ ганглии (рис 15В-2 и -3). Снимите оболочку. В качестве альтернативы контактный его с обеих сторон связок таким образом, что она зафиксирована, но нерв шнур не сжатом.
5. Повторите шаги 5.2-5.4 для всех брюшной ганглиях A1 до A5.
6. Desheathe грудной ганглий и ганглии A6 подобным способом. Для того, чтобы desheathe A6 начала кпереди ганглии и перейти в заднем направлении. Pin ганглии оболочку А6 до заднего конца цепи ганглиев.

6. внеклеточной записи с двигательных нейронов

1. Соберите все инструменты и материалы, используемые для внеклеточных записей, показанных Iн Рис 16В и перечислены в дополнениях. Обзор установки записи показано на фиг.16А. Начать все электронного оборудования, используемого в этом эксперименте (рис 16С), так что усилитель может прогреться в течение, по крайней мере 30 минут до записи. Включите компьютер и запустите программное обеспечение для записи.
2. Поместите цепь ганглиев на столе микроскопа и освещают снизу. Вставьте записи электрод в Sylgard близко к цели нерва и электрода сравнения в положении рядом, но на боковой ганглиев (рис 17A и B). Согните целевой нерв вокруг записи электрода (рис 17С).
3. Стретч нерв чуть-чуть, чтобы обеспечить контакт между электродом и нервом и вывод его на стороне (F igure 17D). Закрепите кабели электрода стола микроскопа с помощью пластилина, поэтому они остаются в нужном положении.
4. Используйтешприц, наполненный вазелина и 20 иглы (с закругленным кончиком) (рис 17E-3), чтобы изолировать целевой нерв от растворе ванны. Во-первых тыкать некоторые вазелин на Sylgard вокруг регистрирующего электрода. В результате слой вазелина охватывающий Sylgard в непосредственной близости от регистрирующего электрода (фиг 17E-4). Будьте осторожны, не непосредственно промокните на нерв и избежать воздушных пузырей в этом слое.
5. Уплотнение записи электрод с вазелином со всех сторон до уровня поверхности солевого раствора (рис 17F).
6. Повторите эту процедуру для всех целевых нервов, чья деятельность должна контролироваться.
7. Начало записи. Используйте непрерывную или разрыв свободный режим приема, и частоту дискретизации 5 кГц. Установите внеклеточный усилитель к следующим параметрам; получить в 1000 (усиливает сигнал 1000 раз, позаботиться, чтобы включить этот параметр усиления в настройках программного обеспечения приобретения)да полосовой фильтр от 300 Гц (НЧ) до 2000 Гц (High Cut).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

При одновременном внеклеточных записей с РС и ПС, моторных нейронов одного ганглия, переменный активность этих бассейнов двигательных нейронов, можно контролировать (рисунок 18), представляющая собой фиктивную картину передвижения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Анатомия рака и их животе ганглии было описано ранее ^{5, 18, ​​19, 20,} и рекомендуется, чтобы ознакомиться с ними до вскрытия для того, чтобы избежать сокращения важных нервов.

Очень важно, чтобы препарат при температуре ниже 23 ° C для предотвращения деградации изолир...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-channel extracellular amplifier: MA 102	Amplifier	Elektroniklabor, Zoologie, Universität zu Köln, Germany
air-table		Technical Manufacturing Corporation (TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA	63-534
Axon Digidata 1440A	Digitizer	Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA	DD1440A
big bucket
Clampex & Clampfit	pClamp 10, recording and analysis software	Molecular Devices Design, Union City, CA	pClamps 10 Standard
cold lamp source	with flexible light guide (fiber optic bundle)	Euromex microscopes holland, Arnhem, BD	LE.5211 & LE.5235
computer and monitor	equipped with recording software
container and pipette for liquid waste
crayfish saline	contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4.
dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable)	fluorescent dye, lysine fixable	Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany	D3328
dissection dish	(l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone
faraday cage
fixing pins
forceps (biology, Dumont #5)	Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX	Fine Science Tools (FST), Germany	11252-20
forceps (biology, Dumont #55)	Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX	Fine Science Tools (FST), Germany	11255-20
forceps (electronic, Dumont #5)	Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX	Fine Science Tools (FST), Germany	11251-20
intracellular electrode	Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament	Sutter Instruments, Novato, CA	BF100-50-10
Leica S8 Apo StereoZoom	Dissection Microscope                       Zoom 1x - 8x	Leica, Germany	10446298
microscope table
mirror	to illuminate preparation from below
modeling clay
Olympus SZ61	Dissection Microscope                       Zoom 0.67x - 4.5x	Olympus, Germany
petri dish	94 x 16 mm; lined with clear silicone	Greiner bio-one, Germany	633180
ring scissors	ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm	Fine Science Tools (FST), Germany	14054-13
spring scissors or alternative: Vannas spring scissors	cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm	Fine Science Tools (FST), Germany	15024-10 or          15000-08
student Vannas  spring scissors or alternative:  Moria Spring Scissors	cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm	Fine Science Tools (FST), Germany	91500-09 or           15396-00
sylgard	184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon	Dow Corning, Midland, MI, USA
syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip