JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Аннотация

Аденокарциномы протока поджелудочной железы (PDAC) содержит подмножество исключительно онкогенных раковых стволовых клеток (CSC), который, как было показано для привода инициацию опухоли, метастазирование и устойчивость к радио- и химиотерапии. Здесь мы опишем конкретной методологии для культивирования первичных человеческих панкреатических CSCs как сферы опухолевых в Анкоридже независимый условиях. Клетки выращивали в бессывороточной неприлипшие условиях для того, чтобы обогатить для ЦОНов в то время как их более дифференцированные потомства не выжить и размножаться на начальном этапе следующей посева отдельных клеток. Этот анализ может быть использован, чтобы определить, какой процент ЦОК, присутствующих в популяции опухолевых клеток. Оба размера (который может быть в диапазоне от 35 до 250 мкм) и количество опухолевых сфер, образованных представляет CSC активность питал либо в объемных популяций, культивированных раковых клеток или свежесобранных и переваренных опухолей 1,2. Используя этот анализ, недавно мы обнаружили, что метформин выборочно ablates панкреатоIC ЦОНов; факт, что впоследствии дальнейшее подтверждается демонстрируя уменьшенную экспрессию плюрипотентности генов, ассоциированных с / поверхностных маркеров и снижение в естественных условиях туморогенности метформина обработке клеток. В качестве заключительного этапа для доклинической разработки мы рассматривали мышей, несущих раковых опухолей с метформином и нашел значительно увеличивает выживаемость. Клинические исследования тестирования использование метформина у пациентов с PDAC В настоящее время ведутся (например, NCT01210911, NCT01167738 и NCT01488552). Механически, мы обнаружили, что метформин вызывает смертельный энергетический кризис в ЦОНов по повышению активных форм кислорода (АФК) производство и снижение трансмембранного потенциала митохондрий. В отличие от этого, не-ОКК не были устранены лечения метформином, а прошли обратимое остановку клеточного цикла. Таким образом, наше исследование служит в качестве успешного примера для потенциала формирования сферы в пробирке, как инструмент скрининга для выявления соединений, которые потенциально ориентированные CSCс, но этот метод требует далее в пробирке и в естественных условиях проверки, чтобы исключить ложные открытий.

Введение

Аденокарциномы протока поджелудочной железы (PDAC) является одним из наиболее агрессивных солидных опухолей. В настоящее время наиболее распространенной формой рака, связанных с смерть 4-й в западном обществе и, по прогнозам, вырастет к делу 2-й наиболее частой в течение следующего десятилетия (~ 400 000 смертей в год во всем мире) 3 .В время диагностики 90% больных, присутствующих с прогрессирующим заболеванием, которое имеет 5-летнюю выживаемость менее чем на 5% в. Этот показатель выживаемости удручающе остался неизменным в течение последних 50 лет, несмотря на все более и более интенсивной научно-исследовательской деятельности 4. Из оставшихся 10% пациентов, которые имеют потенциально '' отверждаемый болезни через хирургической резекции, 80% умрут от рецидива в течение 5 лет. В течение многих лет стандартом лечения поздних стадиях заболевания была гемцитабин монотерапии, но это только придает предельную преимущество выживания 5. Небольшие улучшения в краткосрочной выживание были достигнуты путем добавленияэрлотиниба 6 или 7 капецитабина, однако увеличение выживаемости в порядке недель с медиана общей выживаемости еще ~ 6 месяцев. В последнее время все обнадеживающие результаты появились на гемцитабина / наб -paclitaxel 8 и комбинированной FOLFIRINOX режима 9,10. Эти методы улучшения медианы выживаемости на скромные 2 и 4 месяца, соответственно, но являются высокотоксичными и долгосрочные выживших все еще редкое исключение. Хотя лечение предлагает потенциал для улучшения, это токсичные режимы, к которым многие пациенты не реагируют или только показывают постепенное улучшение общей выживаемости. Как следствие, существует настоятельная необходимость дополнить нынешние методы лечения и разработать роман, скорее всего мультимодальных терапевтических подходов.

Опухоль Неоднородность

Это становится все более очевидным, что рак неоднородность не ограничивается только отдельной эволюционной Субклоны withiп каждой опухоли 11, а также определяется фенотипических и функциональной гетерогенности и пластичности в каждом субклона 12. Так называемые раковые стволовые клетки (ЦОК) или опухоль-продвижения клетки ответственны за неоднородности intraclonal 13-16. В частности, ЦОНов представляют собой подмножество раковых клеток, для которых мы и другие предоставили убедительных доказательств, вплоть до одной клетки, что они представляют собой корень болезни, давая начало всем дифференцированных потомков в каждой субклона рака 17. Более того, эти клетки имеют важное значение для метастатического поведения, а также представляют собой важный источник для рецидива заболевания после лечения, даже при относительно эффективных препаратов, способных индуцировать регрессию опухоли начальный (например, наб -paclitaxel) 15,18-20. Важно отметить, что ОКК не обязательно представляют добросовестных стволовых клеток, и они не возникают из стволовых клеток ткани во многих случаях, а, скорее, они имеют ACQuired определенные особенности стволовых клеток. Большинство из них функционально определена, например ОКК оснащена неопределенной емкости самообновление делает их устойчивыми к обычной химиотерапии, и показывают увеличение инвазивность, которая способствует метастатической активностью.

Функциональные раковых стволовых клеток фенотипы

Функциональный фенотип ЦОНов основывается на их способности к самообновлению, которые могут быть проверены в лабораторных помощью образование серийный сферы и формирования колонии анализов соответственно. Еще более важно, ЦОНы, способные к самообновлению медведя в естественных условиях туморогенности, которые могут быть проверены путем ограничения разведения в естественных условиях анализов в качестве конечной функциональной считывания, предпочтительно во время серийного трансплантации индикативного эксклюзивной долгосрочной туморогенности. Кроме того, неоднородность в отсеке CSC, с отличным субпопуляции ЦОНов несущих исключительное умение порождать метастазов, что это не простопрямым следствием их исключительно в естественных условиях туморогенности. Действительно, metastastitic ЦОНов приобретают способность уклониться от первичной опухоли, выжить anoikis и в конечном итоге перемещать и семя вторичные сайты. Эти передовые функциональные возможности могут быть проверены в лабораторных использованием модифицированных вторжения анализов и в естественных условиях, используя метастазы анализов.

Ориентация раковых стволовых клеток

Мы и другие предоставили убедительные доказательства, что лечение с упором на объемной опухоли дифференцированных клеток ККПР, даже в сочетании с стромы таргетирования агентов, не имеют существенное влияние на прогрессирование опухоли и последующего исхода, если не в сочетании с CSC-стратегии таргетирования 21, 22. Таким образом, на основе ключевых функций ЦОК в прогрессирования заболевания и резистентности к терапии, эти клетки должны означать важным компонентом для любого нового подхода к лечению 18,20, но потребует более глубокое понимание уплотнительноее нормативной техники ЦОНов. Хотя ЦОНов и их более дифференцированные потомства несут одинаковые генетические основных состояний по отношению к генетическим изменениям, ЦОНов проявляют различны и, таким образом, эпигенетически решимости профили экспрессии генов, что акцию модули с плюрипотентных стволовых клеток. Большинство генов, участвующих в генерации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (Nanog, Oct3 / 4, Klf4, Sox2) не только были связаны с раком, но выражение их, в основном, ограничены в отсеке ОКК. Кроме того, функциональный актуальность ЦОНов по потери от-функции экспериментов с использованием генетических инструментов для таргетинга CSCs теперь твердо установлено понятие CSC для нескольких типов рака 23-25. Хотя большинство из этих подходов основаны на мышиных моделях и, таким образом, не легко перенести в клинику, они предоставить доказательства правильности концепции для потенциального клинического значения таргетинга CSCs в сочетании с объемными опухолевых клеток.

Изучение стволовых раковых клеток в ViТро выявлять Heel их ахиллесова

Для того, чтобы определить новые и клинически применимые способы для ориентации CSCs, их особенности регулярно изучал в пробирке и формирование сфера широко используется в данном контексте. Первоначально разработанная для изучения нормальной биологии стволовых клеток, в том числе самообновлению и дифференцировке мощности, этот анализ был позже адаптирована для изучения CSCs в пробирке и был использован для исследования CSCs выделенные из PDAC 20. Мы обнаружили, что опухолевые сферы, образованные из первичных клеток человека ККПР нести все отличительные черты ЦОНов, поэтому с указанием в них содержится добросовестных поджелудочной CSCs 21. Таким образом, сфера опухоли анализ представляет собой мощный инструмент для выявления более эффективных методов лечения в пробирке, но результаты должны быть дополнительно оценены в более строгими в естественных анализов. Действительно, данные, полученные с этого анализа в пробирке следует относиться с большой осторожностью, так как гое анализ может быть предметом значительных ошибок. Высоко стандартизированные протоколы, в том числе автоматизированный подсчет форменных сферах, должны быть созданы для обеспечения воспроизводимых и прогнозирования данных.

В этом контексте, недавно мы использовали эту пробу для выявления поджелудочной CSCs, полученные из разнообразного набора первичных человеческих PDACs и показали, что эти клетки очень уязвимы для перепрограммирования метаболического анти-диабетической соединения метформина. Ранее метформин были ингибируют расширение раковых клеток путем непрямой активации АМФ-активируемой протеинкиназы (AMPK) сигнализации и последующим ингибированием МРМ 26, что приводит к снижению синтеза белка и пролиферации клеток 27. В дополнение к этим эффектам на популяции опухолевых масса, и другие мы обнаружили, что метформин не способен воздействовать и на самом деле устранить субпопуляции ОКК в ряде солидных опухолей, таких как рак молочной железы, рак пищевода, глиобластомы и рака поджелудочной железы 28-31 </ SUP>. Таким образом, метформин представляет собой перспективный и безопасный новый терапевтическую стратегию для нескольких видов рака с себе неудовлетворенного медицинской необходимости. Кроме того, с помощью образования сферы, как способ обогащения ЦОНов, мы показали, что первичные эффекты метформина на поджелудочной ЦОНов не зависит от активации AMPK и в основном полагались на свои скромные митохондриальной токсичности (путем ингибирования комплекса I), который, по-видимому был смертельным для подмножества ЦОНов только. Для последних мы смогли оценить свои сотовые потребления кислорода и митохондриальной АФК в качестве индикаторов токсичности препарата на клеточном уровне. Впоследствии, данные эти в пробирке может быть подтверждено в доклинических моделях мыши и действительно привело к значительно продлевает выживаемость 31. Методология, представленная в настоящем документе позволяет быстро поколения профилей чувствительности препарат для ЦОНов, в том числе исследований по их влиянию на ЦОК метаболизма. Мы в настоящее время обеспечивают продлен экспериментальные информации об используемой комдополняющих в пробирке и в естественных условиях процедур.

протокол

Опухоли человека ККПР были получены с письменного информированного согласия (Comunidad де Мадрид, Испания (СР CNIO-СТС-11 -. ДИ 11/103-E) Имплантация человека поджелудочной железы в иммунодефицитных мышей требуется одобрение Institutional Review Board, а также институционального . Уход за животными и использование комитета (IACUC) Процедуры ксенотрансплантатных поджелудочной мышиных моделях опухолей должны проводиться в соответствии с институциональными и национальными правилами (здесь Этического комитета Институт де Salud Carlos III, Мадрид, Испания; протокол PA 34_2012).

1. Культура Медиа

  1. Подготовка полной среде.
    1. Дополнение RPMI среду с добавлением 10% FBS, 100 единиц / мл пенициллина / стрептомицина. Для 500 мл RPMI добавить 55 мл инактивированной нагреванием FBS и 6 мл пенициллина / стрептомицина (10000 ЕД / мл, 100x).
    2. Хранить полной среды при 4 ° С.
  2. Подготовка ЦОНов Medium.
    1. Дополнение бессывороточная DMEM / F12 mediuм с 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина и 2 мМ глутамина.
    2. Хранить среду CSC при 4 ° С. B27 (1:50) и 20 нг / мл свеже оФРФ добавляют в среду перед каждым экспериментом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: добавление B27 было показано, чтобы увеличить образование сфера опухоли и поддерживать несколько отрывков из сферы культуры 32. Состав среды является важным шагом и должна быть проверена для каждого типа клеток в культуре. Мы рекомендуем тестирования самообновление и дифференцировку потенциала сферы и анализировать выражение ЦОК маркеров с помощью проточной цитометрии (т.е., CD133 + CD44 + и).
  3. Подготовка внеклеточного Flux среде для анализа.
    1. Эта специфическая среда DMEM базальной 5030, содержащий витамины, аминокислоты и другие добавки, но не хватает глутамин, глюкоза, пируват и бикарбонат.
    2. Для текущего анализа, дополняют среду с 2 мМ глутамина, 8 мМ глюкозы и 2 мМ пирувата натрия до полного митохондриального метаболической активности.
      Примечание: отсутствие бикарбоната натрия является существенным для того, чтобы точно измерить внеклеточный подкисление клеток, растущих в культуре, так Стабильный среду, содержащую бикарбонат будет буфер вариации рН во время теста. Кроме того, использование в базальной среде позволяет жесткий контроль концентрации L-глутамина (как L-аланил-глутамин) глюкозы или пирувата натрия, необходимого для различных условий анализа и / или приложений.

2. Сфера Формирование Пробирной и анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Все протоколы культуры тканей и манипуляции должны быть выполнены с использованием стерильных методы с большим вниманием, используя чистую, моющего средства бесплатно, стерильный посуды. Перед использованием предварительно теплой среды и всех раствора в 37 ° С на водяной бане в (в качестве альтернативы, вы можете использовать среду и решения предварительно нагревают при комнатной температуре). Получить опухоли человека ККПР ранее подробно 21.

  1. Выделение ЦОНов от человека PDAC (Рисунок1)
    1. В стерильной камере биологической безопасности передачи человеческого ККПР ткани на 60 х 15 мм чашки для культивирования, содержащей 1 мл стерильной 1X фосфатным буферным раствором (PBS). Фарш опухоль на мелкие кусочки (1 - 5 мм) с использованием стерильного скальпеля и пинцета.
    2. Добавить 1 мл стерильной 1X PBS в чашку с культурой и повторить шаг Растирание, пока ткань не полностью диссоциирует, регулярно это требует 3-4 раундов. Передача суспензии ткани (верхний до конечного объема 5 мл с 1X PBS) в стерильную пробирку и механически гомогенизируют ее с диссоциации, таких как gentleMACS.
    3. Инкубируйте гомогенизированный ткани с коллагеназы (использовать 2,5 мг / мл коллагеназы в 1X PBS) в течение 60 мин при 37 ° С, а затем центрифугировать в течение 5 мин при 900 х г. Декантировать супернатант и ресуспендирования ячейки гранул в 10 мл полной среды. Фильтр клеточной суспензии через 40 мкм сито и центрифуги в течение 5 мин при 900 х г.
    4. Слейте супернатант и ресуспендируютосаждения 5 мл эритроцитов лизирующего буфера (аммония-хлорид калия, ACK), и инкубируют
    5. Ресуспендируют осадок в ОКК среды, пластины на желатин покрытием блюдо, и инкубируют при 37 ° С в течение 1 ч. Этот шаг будет удалить большинство клеток фибробластов, которые быстро придают плите.
    6. Удалить пластину из инкубатора и тщательно восстановления клеточной суспензии и количественной оценки количества жизнеспособных (трипанового синего-негативных клеток) с использованием гемоцитометра. Для этого, осторожно перемешать суспензии и пипеткой 20 мкл суспензии в пробирку Эппендорфа. Добавьте 20 мкл (1: 1) трипанового синего к клеткам в микроцентрифужных трубки и хорошо перемешать. Пипетка примерно 10 мкл смеси на гемоцитометра.
    7. Граф все четкие клеток в четырех угловых секторов счетной камеры для жизнеспособных клеток. Примечание: жизнеспособность и выход клеток может значительно меняться между образцов опухоли. Для PDAC образцы жизнеспособность регулярно колеблется betweан 45-70%, а кусочки ткани из макроскопического образца опухоли диаметром 3 - 5 мм должны давать примерно 5x10 6 жизнеспособных клеток.
  2. Сфера Формирование анализа и метформин лечение
    1. Отобрать необходимое количество клеток и добавить соответствующий объем ОКК среды подготовить концентрации клеток 2000 клеток / мл. Не держите клеточной суспензии на льду в течение не более чем 1 ч и хорошо перемешивают до обшивки.
    2. Добавить 500 мкл 1X PBS в первой и последней строке 24-луночный планшет для увлажнения, чтобы свести к минимуму испарение среднего. Семенной клеток в сверхнизкие клеток крепления планшеты при плотности 2000 клеток на лунку в 1 мл среды сферы опухоли (2000 клеток / мл).
      Примечание: количество клеток, используемых для формирования сферы анализов опухоли может варьировать от типов опухолей.
    3. Лечить по крайней мере 4 скважин с автомобиля (отрицательный контроль) и 4 скважин с каждого выделенного лечения., Например, 3 мм метформина. Plасе клеток в инкубатор при 37 ° С и поставить клеток с 5% CO 2 в течение одной недели.
      Примечание: среда не должна быть изменена, чтобы позволить спокойно образование сфер опухолевых, но может быть пополнен с факторами роста на ежедневной основе, поскольку они не являются стабильными в культуральной среде.
    4. Каждый день добавить лечение., Например, 3 мм метформина или транспортного средства на каждом из скважин. Оценка количества образованных сферах опухоли после 5 и / или 7 дней с использованием автоматизированной счетчика клеток, что позволяет рассчитывать на более крупные структуры (рисунок 2).
      Примечание: только сферы опухоли с, по меньшей мере 40 мкм должны быть рассмотрены и могут быть классифицированы как малая (40 - 80 мкм) или большой (80 - 120 мкм), соответственно. Результаты могут быть проиллюстрированы как процент опухолевых сфер, деленное на начальное число клеток, посеянных (например, 2000) клетки.
  3. Серийный Пассирование первого поколения опухоли сфер
    1. После 7 дней инкубации собирают опухолевые сферы, используя фильтр 40 мкм клеток и центрифуги их в течение 5 мин при 900 х г при комнатной температуре.
    2. Разбить осадок опухолевых сфер отдельных клеток с использованием трипсина, а затем разверните Полученные клетки одноклеточные суспензии снова в течение еще 7 дней, как описано выше (см 2.2).

3. Метаболизм анализ (РОС производства и потребления кислорода)

  1. АФК
    1. В этом протоколе, мы использовали карбокси-DCFDA в качестве примера для измерения АФК, так как это доступный, быстрый и широко используется зонд для обнаружения ROS. Тем не менее, существует несколько других зондов и методологий, которые могут быть использованы для этого анализа.
    2. Treat сферы опухоли с метформином, как описано в пункте 2.2 для выделенного периода времени. В конце лечения, опухоль урожай сферы, использующие мобильный фильтр 40 мкм, центрифуги клетки при 900 мкг в течение 5 мин и ресуспендируют осадок в 1 мл trypsв. Инкубировать в течение 20 мин при 37 ° С.
    3. После того, как клетки singularized, центрифуги при 900 мкг и ресуспендирования клеток в HBSS, содержащих 2,5 мкМ карбокси-DCFDA. Инкубируйте клетки в течение 20 мин при 37 ° С в темноте.
    4. До проточной цитометрии анализа защитить окрашенные клетки от света, карбокси-DCFDA может быть фотоокислению давая ложные положительные результаты. Поместите трубки на льду до анализа.
      Примечание: карбокси-DCFDA это люминесцентные после реакции с различными химически активного кислорода и азота, которые обнаружены в FL1 (например 488nm, ет 520 нм..).
  2. Потребление кислорода Измерение
    1. Для этого протокола, мы будем использовать систему внеклеточной поток Analyzer от морской конек биологических наук, в качестве примера. Шерсть желаемый культуральный планшет с раствором 22,4 мкг / мл клеток и тканевого адгезива в течение 20 мин при комнатной температуре. Промыть лунки водой 2 - 3 раза перед посевом клеток.
    2. В конце лечения, сферы опухолевые урожай, используя 4Фильтр сотовый 0 мкм, центрифуги клетки при 900 мкг в течение 5 мин и ресуспендируют осадок в 1 мл трипсина. Инкубируют в течение 20 мин при 37 ° С.
    3. Пластина singularized клеток в клеточной культуральной пластины с плотностью 30000 клеток / лунку на 96-луночный планшет (конечный объем: 150 мкл). Ресуспендируют клетки потребления кислорода анализа среде, содержащей глюкозу 8 мм и 2 мМ пирувата натрия.
    4. Центрифуга клетки в нижней части хорошо спин центрифугирования скважин до 100 мкг не была достигнута, и пусть центрифуги остановку с тормозом выкл. Обратный ориентацию пластины и повторите процедуру. Передача пластину 37 ° С инкубатор без добавления CO 2 в течение 30 мин.
    5. В то же время, подготовить картридж для анализа. Каждый хорошо имеет 4 различных форсунок для загрузки (25 мкл / порт):
      1. Порт: метформин. Чтобы получить конечную концентрацию 3 мМ в скважине, приготовить раствор 8x (24 мм) в качестве конечного объема 175 будетмкл после инъекции порта A.
      2. Порт B: метформин. Чтобы добавить 3 мм и получить конечную концентрацию 6 мм и, приготовить раствор 9x (27 мм) в качестве конечного объема составит 200 мкл после инъекции порт B.
      3. Порт C: метформин. Чтобы добавить 3 мм и получить конечную концентрацию 9 мм в скважине, приготовить раствор 10x (30 мм) в качестве конечного объема будет 225 мкл после инъекции порта C.
      4. Порт D: ротенон 11 мкМ, 1 мкМ, чтобы получить в конечной концентрации в скважине (11x). Примечание: ротенон полностью ингибирует любой остаточной активности митохондрий.
    6. Калибровка картридж и загрузите клеточной культуры пластины. Выполните анализ с использованием стандартного протокола смешивания и измерения.
    7. Рассчитывают процент ингибирования общего митохондриального дыхания достигается метформина в виде процента ингибирования, полученного с ротеноном (за 100%).

4.Модели ксенотрансплантата рака поджелудочной железы человека с ослабленным иммунитетом мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Заказать достаточное количество женских обнаженных бестимусным или других, более ослабленным иммунитетом мышах, таких как NOD-SCID, SCID-бежевый или NSG для экспериментов 33. Автоклав все хирургические инструменты до эксперимента и позволяют им остыть до комнатной температуры перед использованием. Для подкожных опухолей использовали как минимум 4 мышей в состоянии с одной опухолью в бок в общей сложности 8 опухолей.

  1. Ксенотрансплантата Трансплантация
    1. Подготовка опухолевых отрывки из образцов человека рака поджелудочной железы ткани. Передача опухоли в чашку Петри и рассекают ткани на небольшие кусочки (2 мм в диаметре, ~ 8 мм 3), используя скальпель и пинцет, чтобы удерживать ткани. Dip полученные куски в желатиновой белковый раствор смеси выдерживали на льду.
    2. Обезболить мышей, используя 1 - 3% изофлуораном или другие ингалируемых или инъекционные анестетики.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом любой хирургической прокedure, убедитесь, что у мышей полностью потерял сознание, стимулируя кожу живота или буксирует с парой Пинцет. Применить глазную мазь, чтобы предотвратить сухость.
    3. После анестезии вступило в силу, протрите спину мышей с этанолом, содержащего кожи антисептиком. Администрирование бупренорфин (0,05 мг / кг BW) до операции, чтобы обеспечить послеоперационную анальгезию.
    4. Поднимите заднюю кожу щипцами, сделать 0,7 - 1,0 см длинный разрез с стерильных микро ножницами, а затем прямо подготовить небольшой подкожный карман, в котором часть пациентов, полученных поджелудочной железы ткани вставляется (~ 8 мм 3).
    5. Закройте рану, используя 1 - 2 скобы кожи. Удалить их через 7 дней. Вернуться мышей в клетки и сохранить их на грелку или под лампой нагревания до тех пор, пока полностью активным снова.
    6. После имплантации опухоли, контролировать мышей, по крайней мере два раза в неделю для роста опухоли и общих признаков, возникающие заболеваемости, таких как взъерошенный мех, huncheд поза, и неподвижность.
    7. После опухоли достигают среднего размера 200 мм 3, мышей случайным образом, чтобы соответствующие процедуры. Администрирование транспортного средства или метформин в день с помощью IP-инъекции (150 мг / кг BW) или с помощью питьевой воды (150 мг / кг BW) с сопоставимыми эффектами лечения.
    8. Монитор опухолевой помощью циркуля и рассчитать объем опухоли раз в неделю (измерение объема опухоли = длина × 1/2 дыхания × ширина).
    9. Жертвоприношение мышей сразу опухоли достигли 1 см в диаметре или мыши начинают показывать какие-либо признаки сильной боли или болезни, как указано выше.

Результаты

Метформин избирательно поджелудочной CSCs

Сначала изучили функциональные эффекты метформина лечения на в пробирке самообновлению мощности ЦОНов. Для этого, мы провели анализы сфера формирования с использованием первичных человеческих клеток рака поджелудочной железы, выделенных из тканей ККПР резецированных во время операции. Мы заметили, что метформин сильно снизился размер сформированных сфер (рис 1А). Это был, скорее всего, путем ингибирования расширение потомства CSC, который до сих пор составляют основную часть клеток в сферах, как они обогащены только для ЦОНов. В самом деле, чем дольше сферы культивируют без пересева более обширную экспансию более дифференцированных потомков будет. Таким образом, мы обнаружили, метформин значительно уменьшить количество сфер, образованных на самом деле, независимо от их размера, происходящих в зависимости от дозы предлагая сильное ингибирование самообновление мощностью ССК (данные не показаны). Мы обнаружили, что метформин в 3 мМ значительно уменьшилось количество сфер, образованный (1В). Для того, чтобы более строго изучения долгосрочных последствий метформина на самообновление мощностью ЦОНов, мы впоследствии пересаживали образовавшиеся первичные сфер в средних и высших сферах. Хотя только первичные сферы лечили метформином, формирование сфер второго и третьего проходов была резко снижена и более, вовлекая метформин действительно необратимо устранены большинство ОКК (рис 1С). Таким образом, наши данные показали значительные эффекты лечения для метформина на самообновление мощности первичных поджелудочной ЦОНов и, таким образом, призвал нас, чтобы выполнить дальнейшее механистической, а также исследования в естественных условиях.

Метформин подавляет Митохондриальная потребления кислорода и вызывает АФК

Так metformiп было показано, чтобы действовать в качестве митохондриального яда путем частичного ингибирования активности Комплекс I, мы исследовали в следующем острые эффекты метформина на клеточном потребления кислорода в клетках, полученных сфер. Для этой цели были выбраны клетки, полученные из двух репрезентативных первичных опухолей ККПР и измеряли потребление кислорода с течением времени после последовательного впрыска 3 мм метформина (три инъекции) и 1 мкМ ротеноном (одной инъекции). Как показано на фиг.2А, инъекции метформина индуцированных быстрое и дозозависимое снижение потребления кислорода, которое изменяется между значительным различных опухолей. Мы рассчитали остаточной активности митохондрий при лечении метформином путем введения ротенон, мощный ингибитор комплекса I, которое способно полностью ингибировать митохондриальный потребление кислорода. Чувствительность к метформина по митохондриальной потребления кислорода коррелирует с его способностью индуцировать АФК определяется как смещение среднего значения попутаже после лечения метформином (фиг.2В, левая панель), которые могут быть легко количественно (фиг.2В, правая панель). Как и ожидалось, первичные клетки, которые наиболее чувствительны к ингибированию потребления кислорода также показал самое сильное увеличение продукции АФК на лечения метформином. Таким образом, метаболические опыты эти в пробирке продемонстрировать, что метформин задания CSCs путем ингибирования их зависимость от митохондриальной функции, что приводит к последующим увеличением митохондриальной производства АФК и в конечном итоге индукции апоптоза.

Метформин Лавки ККПР Прогрессирование В Vivo

Мы, наконец, изучал эффекты метформина в естественных условиях, используя ткани ксенотрансплантаты, полученных из различных пациентов с PDAC. Мы наблюдали значительное снижение опухолевой прогрессии метформина обработанных мышей по сравнению с контрольной группой, но никогда полностью опухоли DISAppeared (Рисунок 3). Впоследствии, во время длительных последующих всех опухолей в конечном итоге рецидив предполагая метформин устойчивость клеток, выживших в раннюю фазу лечения. Тем не менее, лечение метформином, даже когда применяется в качестве монотерапии, значительно расширен выживание у всех мышей.

figure-results-4493
Рисунок 1. Метформин избирательно на CSCs. () Метформин снизился размер сферах. Типичные изображения сфер получены после обработки указанных дозах метформина в течение 7 дней (справа). Количественное размера сферы (n≥6) (слева), указанные цифры в оси абсцисс представляют отдельные опухоли. (B), мощность формирование сфера в присутствии или отсутствии метформина в течение 7 дней (n≥6), указанные цифры в абсциссось представляют отдельные опухоли. (С) Представитель график CSC самообновлению мощности в средних и высших сферах первичных клеток рака поджелудочной железы. Сферы обрабатывали только во время формирования первого поколения сфере в общей сложности 7 дней (п = 6). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-5526
Рисунок 2. Метформин Лечение Ингибирует потребления кислорода и вызывает АФК. () Метформин тормозит дополнение потребление кислорода (OCR) клеток, полученных сфере. Два различных сфер ККПР вторичные лечили метформином и изменение OCR были измерены с помощью анализа внеклеточной потока. Ротенон инъекции был использован в качестве контроля для общего потребления митохондриальной OCR.Ось Х представляет собой расход кислорода в пмоль / ч кислорода, нормированной на содержание белка в каждой лунке. (B) ККПР сфер, используемых в обрабатывали в течение 8 часов с метформином и АФК оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием карбокси-DCFDA. Слева представитель проточной цитометрии участков. Право, сводка данных из трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-6626
Рисунок 3. метформин Лавки ККПР Прогрессирование В Vivo. Два разных ККПР ксенотрансплантатов ткани были имплантированы в мышей с иммунодефицитом и лечение было выделено после первоначального отбора опухоли была проверена. Мышей обрабатывали метформина (Met) добавляется к питьевой воде (150 мг / кг массы тела ВэйGHT; на основе 5 мл водопотребления в сутки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

С появлением и последующим проверки концепции CSC для многих опухолей, поле развития лекарственной получила новый импульс, с потенциалом для разработки более эффективных методов лечения рака, а затем снижение риска рецидива заболевания для. Тем не менее, поле CSC все еще находится на ранней стадии и многое еще предстоит сделать с точки зрения понимания CSC происхождения и распространения, а также их роль в формировании архитектуры опухоли и метастазов продвижения.

В этом контексте, использование воспроизводимых и значимых ЦОК анализов, а также в курсе интерпретация полученных данных представляет собой важную составляющую для углубления нашего понимания CSC биологии. Из многих биологических перспектив, формирование сфера стала чрезвычайно ценным анализа; тем не менее, пользователи должны быть осведомлены о своих ограничениях, чтобы правильно интерпретировать свои экспериментальные результаты. Важным аспектом, чтобы рассмотреть еще до оценки сферы FORMAДанные ние происхождение исследуемого образца, так как результаты, полученные из свежих образцов пациентов, полученных может значительно отличаться от результатов, полученных от установленных линий раковых клеток.

Классические анализы включают формирование сферы посева клеток при плотности клонального в сверхнизких крепежных пластин и оценки формирование сферы в присутствии эпидермального фактора роста (EGF) и / или основного фактора роста фибробластов (FGF-б), обогащенной, но не содержащей сыворотки среде 21, 34. Состав культуральной среды также важный вопрос, чтобы рассмотреть. В нашем опыте мы обнаружили, что DMEM / F12, дополненной В27, оФРФ и глутамина в отсутствие сыворотки оптимальная среда расти, расширяться и поддерживать CSC в недифференцированных условиях. Мы обнаружили, что в этом состоянии культуры (средней и подвески) клетки экспрессируют высокие количества раковых стволовых клеток маркеры (в том числе CD133 + CD44 +, CD24 + и) и не выражают дифференциации белков, ассоциированных (CK-20 И СК-19).

Одним из основных предположений для этих анализов является то, что каждая сфера является клональный, т.е. одна сфера результатом расширения одного стволовых клеток. Тем не менее, сферы неразрывно динамические структуры, которые склонны сливаться даже при низкой плотности посева 35. Покрытие клеток является важным шагом в протоколе и плотность одной клетки / лунку, безусловно, может обойти вопрос агрегации. Но даже перспективно, отсортированных клеток-предшественников, это регулярно приводит к образованию очень низкой сферы из-за низкой активности формирования внутренней сферой, а также может быть связано с ограниченной аутокринном стимуляции из-за эффектов разбавления. В нашем опыте мы обнаружили, что только 30% из посеянных клеток способны образовывать сферы. Мы рекомендуем использовать по крайней мере 100 клеток / лунку, чтобы получить последовательные и воспроизводимые результаты.

Другие способы культивирования в CSC роста основаны на твердых или полутвердых 3D культур (например, на основе мatrigel, коллаген или метилцеллюлозы). Эти методы были использованы, чтобы ограничить подвижность клеток и последующую агрегацию клеток 36. Тем не менее, каждый из этих матриц имеет свои ограничения. Например, Матригель является растворимым базальной мембраны изолированы от Engelbreth-Holm-Swan (EHS) опухоли и, хотя экстракт напоминает сложный внеклеточной среде опухоли найденный во многих тканях, он содержит несколько более или менее определенными факторами роста, которые зачастую становятся механистической исследования для конкретных регуляторных элементов очень трудно. Еще один момент рассмотрения является то, что сфера формирования потенциала и стволовых клеточных функций не являются взаимозаменяемыми терминами 34. В то время как некоторые стволовые клетки-предшественники и было показано, демонстрируют сферу формирования способности 37, неспособность генерировать сфер в пробирке не исключает в естественных условиях функцию стволовых / клеток-предшественников. Например, в состоянии покоя стволовые клетки могут просто не ответить на внеклеточных сигналов, предусмотренныхвыбран в пробирке условия культивирования. Таким образом, долгосрочный в пробирке и в естественных условиях самообновления мощностью очищенных клеточных популяций, преимущественно во время серийного пассирования, должна быть оценена для того, чтобы доказать или опровергнуть функцию стволовых клеток. В этом контексте, умение перспективно и одновременно пропагандировать различные популяции стволовых и прогениторных клеток из важнейших аспектов сферы формирования анализа и оказывает этот анализ очень ценный для поля CSC; тех пор, как его ограничения в виду при интерпретации полученных данных.

Сфера формирования анализы были широко используется для выявления ретроспективно стволовых клеток в зависимости от их способности к самообновлению и дифференцировке в одном уровне клетки в пробирке. Открытие маркеров, которые позволяют потенциальному изоляции стволовых клеток и их потомство от своей нише в естественных условиях позволяет функциональные свойства очищенных населения должны быть определены. Cную комбинацию формирования анализе сферы и FACS является успешная стратегия для выделения клеток из твердой ткани или обогатить конкретные субпопуляции PDAC в культуре. Например, одновременное выражение EpCAM, CD24 и CD44 определяет субпопуляции ЦОНов в состоянии: самообновления, дифференцировать и инициировать опухоль, отражающие неоднородность первоначальной опухоли. Герман и др. показали, что CD133 + клетки обладали дополненной пролиферативную способность и CSC располагает 15. Другие маркеры были также использованы для определения характеристик ЦОК: 1 ALDH- (альдегиддегидрогеназа-1) Выражение связано с высокой онкогенных клеток в поджелудочной железы 38; клетки, способные исключить красителя Hoechst 33342 ДНК, названный сторона населения (SP) клетки, имеют доказанный потенциал, позволяющий инициировать опухоли 39. Недавно мы показали, что внутриклеточное аутофлюоресценция отсек характеризует особый население клеток человека с эксклюзивными чертами ЦОК в различных типах опухолей40. Хотя ни один из этих маркеров не появится выборочно характеризуют чистую популяцию ЦОК, более и более сложные комбинации маркеров должны быть использованы для очистки FACS более изощренные популяции клеток.

Многие вопросы до сих пор остаются о точной роли ЦОНов в происхождения, прогрессии, и лекарственной устойчивости опухолей. Например, один из способов решения вопроса о клональной эволюции, чтобы определить, если и как один CSC инициирует опухоль, может быть анализ образцов пациентов на различных стадиях заболевания, и, в частности следовать число ЦОК во время и после лечения. Отвечая на эти вопросы, мы можем добиться существенного прогресса наших знаний ЦОНов в солидных опухолей и развитие лекарственной терапии, в конечном счете предотвратить прогрессирование опухоли и рецидив.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конкурирующего интерес раскрывать.

Благодарности

Настоящее исследование было поддержано ERC Расширенный следователь Грант (Па-CSC 233460), Седьмая рамочная программа Европейского сообщества (FP7 / 2007-2013) под грантового соглашения Нет 256974 (ЕРС-ТМ-NET) и не 602 783 (CAM-PAC ), Subdirección генерал де Evaluación у Fomento-де-ла Investigación, Fondo де Investigación Sanitaria (PS09 / 02129 и PI12 / 02643), и Programa Насьональ де Internacionalización де-ла-I + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; Ministerio де Economía у Competitividad, Испания). Е. Lonardo поддержали Roche стипендий. М. Чоффи при поддержке Программы стипендий La Caixa Predoctoral.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Counting Chamber/Hemocytometer Hausser Scientific Co3200
CASY Cell Counter and Analyzer for proliferation and viability measurementRoche InnovatisAG CASY Model TTC 45,60,150 μm
GentleMACS Dissociator Miltenyi Co130-093-235
GentleMACS C Tubes Miltenyi Co130-093-237
24-well Ultra-low Attachment Plates Corning3474
100-mm tissue culture dishes BD Falcon353803
Cell strainer BD Falcon352350
15-ml polypropylene conical tube BD Falcon352097
50-ml polypropylene conical tube BD Falcon352070
1.5 ml sterile tubes Eppendorf0030 120.086
50 ml centrifuge tubes Corning430828
Sterile petri dishes, 10 cm dishes Corning353003
26 G needles BD Falcon300600
100 ul Hamilton Syringe Hamilton Syringe Co81075
Collagenase type IV Stem Cell Technologies7909
RPMI Medium 1640 Life technologies11875-085
Penicillin/Streptomycin solution, 100X Life technologiesSV30010
Metformin SigmaD150959-5G
L-glutamine, 200 mM, 100X Life technologies25030-081
D-Glucose SigmaG8270
100mM Sodium Pyruvate solution Life technologies11360-070
Seahorse Assay medium Seahorse Bioscience100965-000
BD Cell-TAK Cell and Tissue adhesive BD Biosciences354240
Trypsin solution, 0.05% Life technologies25300054
B27 Supplement 50x Life technologies17504-044
Basic Fibroblast Growth Factor SigmaF0291
Bovine Serum Albumin SigmaA9576
Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12 SigmaD8437
Sterile 1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline SigmaD8537
Trypan Blue Life technologies15250-061
Carboxy-DCFDA(5-(and-6)-Carboxy-2',7'-DichlorofluoresceinDiacetate) Life technologiesC-369
RotenoneSigmaR8875
Ethanol 70% (vol/vol) Sigma459844
IsofluoraneIsoVet, Braun571105.8
MatrigelBD Biosciences35620
Sterile Cotton tipped applicator Puritan medical
XF96e FluxPak with cell plates, calibrant and cartridgesSeahorse Bioscience102416-100
XF96e Extracellular Flux analyzerSeahorse Bioscience
Incubator with CO2 input 
Micro scissors
Curved forceps
Splinter forceps
Caliper

Ссылки

  1. Whipple, C. A., Young, A. L., Korc, M. A KrasG12D-driven genetic mouse model of pancreatic cancer requires glypican-1 for efficient proliferation and angiogenesis. Oncogene. 31 (20), 2535-2544 (2012).
  2. Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4 (11), 1649-1652 (2009).
  3. Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Res. 74 (11), 2913-2921 (2014).
  4. Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 62 (1), 10-29 (2012).
  5. Burris, H. A., et al. Improvements in survival and clinical benefit with gemcitabine as first-line therapy for patients with advanced pancreas cancer: a randomized trial. J Clin Oncol. 15 (6), 2403-2413 (1997).
  6. Moore, M. J., et al. Erlotinib plus gemcitabine compared with gemcitabine alone in patients with advanced pancreatic cancer: a phase III trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group. J Clin Oncol. 25 (15), 1960-1966 (2007).
  7. Cunningham, D., et al. Phase III randomized comparison of gemcitabine versus gemcitabine plus capecitabine in patients with advanced pancreatic cancer. J Clin Oncol. 27 (33), 5513-5518 (2009).
  8. Von Hoff, D. D., et al. Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine. N Engl J Med. 369 (18), 1691-1703 (2013).
  9. Conroy, T., et al. FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer. N Engl J Med. 364 (19), 1817-1825 (2011).
  10. Gourgou-Bourgade, S., et al. Impact of FOLFIRINOX compared with gemcitabine on quality of life in patients with metastatic pancreatic cancer: results from the PRODIGE 4/ACCORD 11 randomized trial. J Clin Oncol. 31 (1), 23-29 (2013).
  11. Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
  12. Garcia-Silva, S., Frias-Aldeguer, J., Heeschen, C. Stem cells & pancreatic cancer. Pancreatology. 13 (2), 110-113 (2013).
  13. Hermann, P. C., Mueller, M. T., Heeschen, C. Pancreatic cancer stem cells--insights and perspectives. Expert Opin Biol Ther. 9 (10), 1271-1278 (2009).
  14. Hermann, P. C., Huber, S. L., Heeschen, C. Metastatic cancer stem cells: a new target for anti-cancer therapy. Cell Cycle. 7 (2), 188-193 (2008).
  15. Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
  16. Li, C., et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Res. 67 (3), 1030-1037 (2007).
  17. Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).
  18. Gallmeier, E., et al. Inhibition of ataxia telangiectasia- and Rad3-related function abrogates the in vitro and in vivo tumorigenicity of human colon cancer cells through depletion of the CD133(+) tumor-initiating cell fraction. Stem Cells. 29 (3), 418-429 (2011).
  19. Hermann, P. C., Bhaskar, S., Cioffi, M., Heeschen, C. Cancer stem cells in solid tumors. Semin Cancer Biol. 20 (2), 77-84 (2010).
  20. Mueller, M. T., et al. Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer. Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).
  21. Lonardo, E., et al. Nodal/Activin signaling drives self-renewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy. Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).
  22. Li, C., et al. c-Met is a marker of pancreatic cancer stem cells and therapeutic target. Gastroenterology. 141 (6), 2218-2227 (2011).
  23. Chen, J., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
  24. Schepers, A. G., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337 (6095), 730-735 (2012).
  25. Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. Defining the mode of tumour growth by clonal analysis. Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).
  26. Shaw, R. J., et al. The kinase LKB1 mediates glucose homeostasis in liver and therapeutic effects of metformin. Science. 310 (5754), 1642-1646 (2005).
  27. Martin-Castillo, B., Vazquez-Martin, A., Oliveras-Ferraros, C., Menendez, J. A. Metformin and cancer: doses, mechanisms and the dandelion and hormetic phenomena. Cell Cycle. 9 (6), 1057-1064 (2010).
  28. Honjo, S., et al. Metformin sensitizes chemotherapy by targeting cancer stem cells and the mTOR pathway in esophageal cancer. Int J Oncol. 45 (2), 567-574 (2014).
  29. Wurth, R., et al. Metformin selectively affects human glioblastoma tumor-initiating cell viability: A role for metformin-induced inhibition of Akt. Cell Cycle. 12 (1), 145-156 (2013).
  30. Cufi, S., et al. Metformin-induced preferential killing of breast cancer initiating CD44+CD24-/low cells is sufficient to overcome primary resistance to trastuzumab in HER2+ human breast cancer xenografts. Oncotarget. 3 (4), 395-398 (2012).
  31. Lonardo, E., et al. Metformin targets the metabolic achilles heel of human pancreatic cancer stem cells. PLoS One. 8 (10), e76518 (2013).
  32. Gu, Y., et al. The effect of B27 supplement on promoting in vitro propagation of Her2/neu-transformed mammary tumorspheres. J Biotech Res. 3, 7-11 (2011).
  33. Ishizawa, K., et al. Tumor-initiating cells are rare in many human tumors. Cell Stem Cell. 7 (3), 279-282 (2010).
  34. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
  35. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3 (10), 801-806 (2006).
  36. Lawson, D. A., Xin, L., Lukacs, R. U., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation and functional characterization of murine prostate stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (1), 181-186 (2007).
  37. Seaberg, R. M., van der Kooy, D. Adult rodent neurogenic regions: the ventricular subependyma contains neural stem cells, but the dentate gyrus contains restricted progenitors. J Neurosci. 22 (5), 1784-1793 (2002).
  38. Jimeno, A., et al. A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development. Mol Cancer Ther. 8 (2), 310-314 (2009).
  39. Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct 'side population' of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).
  40. Miranda-Lorenzo, I., et al. Intracellular autofluorescence: a biomarker for epithelial cancer stem cells. Nat Methods. 11 (11), 1161-1169 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

100

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены