췌장암 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전지 특성 줄기 공부

요약

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

초록

췌장 도관 선암은 (PDAC)는 종양 개시, 전이와 저항 방사선하고 항암 화학 요법을 구동하는 것으로 나타났다 독점적으로 종양 암 줄기 세포 (암줄 기세포)의 부분 집합이 포함되어 있습니다. 여기에서 우리는 앵커리지 독립적 인 상태에서 종양 분야 1 차 인간의 췌장 암줄 기세포를 배양하기위한 특정 방법을 설명합니다. 세포는 더 차별화 된 자손이 생존 및 단일 세포의 파종 다음과 같은 초기 단계에서 증식하지 않지만 암줄 기세포에 대한 풍부하게하기 위해 혈청, 비 접착 조건에서 재배되고 있습니다. 이 분석은 종양 세포 집단에 존재 된 CSC의 비율을 추정하는데 사용될 수있다. 형성된 종양 분야의 모두 (35 ~ 250 마이크로 미터에 이르기까지 다양 할 수 있습니다) 크기와 수는 배양 된 암 세포의 대량 인구 또는 갓 수확 및 소화 종양 ^1,2 중 하나에 숨겨 CSC 활동을 나타냅니다. 이 분석을 이용하여, 우리는 최근에 메트포르민을 선택적으로 절제한다 pancreat 발견IC 암줄 기세포; 이후 추가 만능 관련 유전자 / 표면 마커의 발현 감소를 보여줌으로써 뒷받침과 메트포르민 처리 된 세포의 생체 내 종양 유발 감소했다 발견. 전임상 개발을위한 마지막 단계로 우리는 메트포르민과 설립 종양을 갖는 쥐를 치료​​ 크게 생존을 연장 발견. PDAC 환자 메트포르민의 사용 테스트 임상 연구가 현재 진행되고있다 (예를 들면, NCT01210911, NCT01167738 및 NCT01488552). 기계적으로, 우리는 메트포르민이 활성 산소 종 (ROS) 생성을 강화하고 미토콘드리아 막 횡단 잠재력을 줄여 암줄 기세포에 치명적인 에너지 위기를 유도하는 것으로 나타났습니다. 대조적으로, 비는 메트포르민 CSC 추가 처리에 의해 제거 아니라 가역적 세포주기 정지를 시행하지 않았다. 따라서, 우리의 연구는 잠재적 CSC를 대상 화합물을 식별 스크리닝 도구로서 시험관 구 형성의 성공 가능성에 대한 예로서 기능S는하지만, 이러한 기법은 오류의 발견을 제거하기 위해 시험 관내 및 생체 내에서 추가 검증을 필요로한다.

서문

췌장 도관 선암 (PDAC)는 가장 공격적인 고형 종양 중 하나입니다. 그것은 현재 서구 사회에서 4 ^번째 가장 일반적인 암 관련 사망 및 (~ 전 세계적으로 연간 40 만명 사망) 다음 십 년간 내에서 ² 번째로 가장 흔한 원인으로 본 환자의 진단 90 %의 ³ .At 시간이 증가 할 것으로 예상된다 5 % 미만의 5 년 생존률을 갖는 고급 질환과. 이 생존율은 실망 점점 더 집중적 인 연구 활동 ^4에도 불구하고 지난 50 년 동안 변하지 않게 남아있다. 수술 적 절제를 통해 잠재적으로 '화성'질병을 가진 환자의 나머지 10 % 중 80 %가 5 년 이내에 재발에서 죽을 것이다. 몇 년 동안 고급 질환에 대한 치료의 표준은 젬시 타빈 단독 요법 왔지만, 이것은 단지 한계 생존 장점 ^(5)을 부여. 추가에 의해 달성 된 단기 생존의 작은 개선카페시 타빈 또는 엘로 티니 브 ^{(6) (7)} 그러나 생존 이점 중앙값 생존율 여전히 6 개월 ~와 주 정도이다. 최근, 더 고무적인 결과는 젬시 타빈 / NAB -paclitaxel ⁸ FOLFIRINOX 조합 정권 ^9,10 위해 등장했다. 이 치료는 각각 겸손 2, 4 개월 평균 생존을 향상하지만, 매우 독성 및 장기 생존자는 여전히 드문 예외가 있습니다. 치료 개선을위한 가능성을 제공하지만, 이들은 많은 환자가 응답 또는 단지 전체 생존율의 증가 개선을 보여주지 않는 독성 정권이다. 결과적으로, 현재의 치료법을 보충하기위한 신규 한, 대부분 복합 치료 방법을 개발이 절실히 요구되고있다.

종양의 이질성

그것은 암 이질성이 별개의 진화 서브 클론의 withi에 국한되지 않는다는 것을 점점 더 분명 해지고있다n은 각각 암 ^(11)뿐만 아니라, 각각의 서브 클론 ⁽¹²⁾ 내에서 표현형 및 기능 이질성 및 소성에 의해 구동. 소위 암 줄기 세포 (암줄 기세포) 또는 종양 촉진 세포는 intraclonal 이질성 ^13-16에 대한 책임이 있습니다. 구체적 된 CSC는 각 암의 서브 클론 ⁽¹⁷⁾ 내의 모든 분화 된 자손을 발생함으로써 질병의 루트를 나타내는 것으로, 우리 등이 단일 세포까지, 결정적인 증거를 제공하고있는 암세포의 서브 세트를 나타낸다. 더 중요한 것은,이 세포는 전이성 행동에 필수적이며, 또한 심지어 초기 종양 회귀 (예를 들어, NAB -paclitaxel) ^15,18-20을 유도 할 수있는 비교적 효과적인 약물 치료 다음과 같은 질병 재발의 중요한 소스를 나타냅니다. 그것은 된 CSC 반드시 선의 줄기 세포를 나타내지 않는 않았으며 많은 경우 조직 줄기 세포에서 발생 않도록주의하는 것이 중요하지만, 오히려 그들이 가지고 ACQ줄기 세포의 특정 기능을 uired. 예를 들어, 암줄 기세포가 무기한 자기 갱신 능력은 기존의 화학 요법에 내성 만들기를 갖추고 있으며, 전이성 활동을 촉진 침입 증가 쇼를 위해 이들의 대부분은 기능적, 정의된다.

기능성 암 줄기 세포 표현형

CSC 추가의 작용 성 표현형 각각 직렬 구 형성 및 콜로니 형성 어 세이를 이용하여 시험 관내에서 시험 될 수 자기 갱신하는 능력에 근거한다. 더욱 중요한 것은, 바람직하게는 독점적 인 장기의 종양 유발을 나타내는 일련 이식 동안, 궁극적 인 기능 판독으로 생체 분석에 희석을 제한하여 테스트 할 수있는 생체 내 종양 유발의 자기 갱신 곰 할 수있는 암줄 기세포. 또한, CSC 구획 내의 이질성은 아니라고 전이를 야기 할 수있는 독점적 인 기능을 베어링 암줄 기세포의 고유 한 하위 집단으로,이생체 내 발암 자신의 독점적 인의 직접적인 결과. 실제로, metastastitic 암줄 기세포는 기본 종양을 회피 anoikis 생존 결국 이동시키다 및 보조 사이트를 배정하는 능력을 습득. 이러한 고급 기능적 능력은 전이 분석법을 사용하여 수정 및 침입 분석을 이용하여 생체 내에서 시험 관내에서 시험 할 수있다.

암 줄기 세포를 표적

CSC 타겟팅 전략 ^(21)과 결합하지 않는 한 우리는 다른 사람들이 치료에도 기질 타겟팅 에이전트와 함께 차별화 된 PDAC 세포의 대량 종양에 초점을 맞추고 있다는 설득력있는 증거를 제공하고, 종양 진행과 이후의 결과에 큰 ^{영향이없는, (22).} 따라서, 질병 진행 및 치료에 내성이 된 CSC의 중요한 기능에 따라, 이들 세포는 신규 한 치료 방법 ^{(18, 20)에} 대한 필수 성분을 의미한다, 그러나 더욱 완전한 이해를 요구한다 O암줄 기세포의 규제 기계 F. 암줄 기세포과 더 차별화 된 자손은 유전자 변형에 대하여 동일한 유전 접지 상태를 부담하지만, 암줄 기세포는 별개 때문에 성적으로 결정 유전자 발현이 다 능성 줄기 세포와 공유하는 모듈을 프로필 나타낸다. 생성 유도 만능 줄기 세포 (에 Nanog, Oct3 / 4, Klf4, Sox2이)에 관여하는 유전자의 대부분은 암에 연결되지 않은, 그러나 그들의 표현은 대부분 암줄 기세포 구획으로 제한됩니다. 또한, 암줄 기세포를 표적에 대한 유전 적 도구를 사용하여 손실의 기능 실험을 통해 암줄 기세포의 기능적 관련성은 이제 단단히 여러 암 종류의 ^{23 ~ 25의} CSC의 개념을 설립했다. 이러한 방법의 대부분은 마우스 모델에 기초하고, 따라서 쉽게 클리닉으로 양도없는 동안, 대량의 종양 세포와 결합 된 CSC 타겟팅의 잠재적 임상 관련성 개념 증명을 제공 하나.

바이올렛에서 암 줄기 세포를 공부TRO는 그들의 아킬레스 건을 확인하는

타겟팅 된 CSC 새로운 임상 적용 방법을 식별하기 위해, 그들의 기능은 정기적으로 체외에서 연구되고 구 형성 널리 이러한 맥락에서 사용된다. 원래 자기 갱신 및 분화능 줄기를 포함한 정상적인 세포 생물학을 연구를 위해 개발이 이후의 분석을 시험 관내 연구 된 CSC하도록하고 PDAC ^{(20)로부터} 분리 된 CSC 조사에 사용되었다. 따라서 우리는 그들이 선의의 췌장 암줄 기세포 ^(21)를 포함 나타내는 기본 인간의 PDAC 세포로부터 형성 종양 분야는 암줄 기세포의 모든 별개의 기능을 부담 것으로 나타났습니다. 따라서, 종양 구 분석법은 시험관 내에서보다 효과적인 치료를위한 화면으로 강력한 도구를 나타내지 만, 상기 결과는 생체 내 분석에서보다 엄격한 평가 될 필요가있다. 사실,이 시험 관내 분석으로 생성 된 데이터는 번째로 큰 신중하게 취급되어야한다전자의 분석은 상당한 오류의 대상이 될 수 있습니다. 형성 구체의 자동 계산을 포함한 고도의 표준화 된 프로토콜, 재현 및 예측 데이터를 확인하기 위해 설립되어야한다.

이러한 맥락에서, 우리는 최근 주요 인간 PDACs의 다양한 세트에서 파생 된 췌장 암줄 기세포 화면이 분석을 사용하고이 세포는 항 당뇨병 화합물 메트포르민에 의한 대사 재 프로그래밍에 매우 취약한 것으로 나타났다. 이전에, 메트포르민은 AMP- 활성화 단백질 키나아제 (AMPK) 시그널링 및 단백질 합성이 감소하고 세포 증식 ^27의 결과는 mTOR ^(26)의 후속 억제 간접적 활성화에 의해 암 세포의 확장을 억제하는 것으로 입증되었다. 벌크 종양 모집단 이러한 효과에 더하여, 우리 등은 메트포르민 타겟팅 실제로 유방암, 식도암, 아교 모세포종 및 췌장암 ^{28-31 <같은} 고형 종양의 개수 된 CSC 아군을 제거 할 수 있다는 것을 발견했다/ SUP>. 따라서, 메트포르민은 현재 충족되지 않은 의료 필요에 여러 가지 암에 대한 유망하고 안전한 새로운 치료 전략을 나타냅니다. 또한, 암줄 기세포에 대한 풍부하게하는 방법으로 구 형성을 사용하여, 우리는 췌장 암줄 기세포에 메트포르민의 주요 효과는 AMPK 활성화의 독립적 주로 분명히 일부에 대한 치명적이었다 (복잡한 I의 억제를 통해) 그 겸손 미토콘드리아 독성에 의존였다 암줄 기세포의. 후자의 경우, 우리는 세포 수준에서 독성 약물의 지표로서의 셀룰러 산소 소비 및 미토콘드리아 ROS의 생성을 평가할 수 있었다. 그 후,이 시험 관내 데이터는 임상 마우스 모델에서 검증 실제로 크게 생존 ^(31)을 연장 귀착 될 수있다. 여기에 제시된 방법론은 CSC 대사에 미치는 영향에 대한 연구를 포함하여 암줄 기세포에 대한 약물 감도 프로필의 빠른 생성을 허용. 우리는 지금 사용 COM에 대한 실험 내용을 확장 제공보완 적 생체 외 및 생체 절차.

프로토콜

인간의 PDAC 종양은 서면 동의서 (욱 마드리드, 스페인 (CP CNIO-CTC-11를 얻었다 -. CI 103분의 11-E) 면역 결핍 쥐에 인간의 췌장 종양의 주입은 임상 시험 심사위원회의 승인을 필요로뿐만 아니라 기관 . 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 이종 이식 췌장 종양 마우스 모델의 절차는 기관 및 국가 규정에 따라 실시해야 (, 마드리드, 스페인, 여기 윤리 연구소의 드 건배 카를로스 III위원회 프로토콜 PA 34_2012)를.

1. 문화 미디어

1. 완전 배지를 준비합니다.
   1. 10 % FBS, 100 단위 / ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신 RPMI 배지를 보충합니다. RPMI 500 ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신 (10,000 U / ㎖, 100X)의 열 불 활성화 FBS 55 ml의 6 ml를 추가하세요.
   2. 4 ℃에서 완전 배지를 저장합니다.
2. 암줄 기세포 중간을 준비합니다.
   1. 무 혈청 DMEM / F12의 mediu 보충100 단위 / ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 mM의 글루타민과 M.
   2. 4 ° C에서 CSC 매체를 저장합니다. B27 (1시 50분) 20 NG / ㎖의 bFGF 갓 각 실험 전에 배지에 첨가된다.
      주 : B27의 첨가가 구 종양 형성을 증가시키고 배양 구 ^(32)의 여러 통로를 유지하는 것으로 나타났다. 배지 조성물은 중요한 단계 인 배양과 각 세포 유형에 대해 시험 할 수있다. 우리는 테스트 자기 갱신과 구체의 분화 능력을 권장하고 유동 세포 계측법에 의해 CSC 마커의 발현을 분석 (즉, CD133 +와 CD44 +).
3. 세포 외 유출 분석 중간을 준비합니다.
   1. 이 특정 매체는 비타민, 아미노산 및 기타 보충제를 포함하지만, 글루타민, 포도당, 피루브산과 중탄산염이 부족한 기초 DMEM 5030입니다.
   2. 현재의 분석을 위해, 전체 미토콘드리아 대사 활동에 2 mM의 글루타민, 8 mM의 글루코오스, 2 mM의 피루브산 나트륨을 가진 매체를 보충.
      주 : 배지 정규 함유 중탄산 분석시의 pH 변동을 완충하기 때문에, 중탄산 나트륨의 부재 정확하게 배양에서 성장하는 세포의 세포 외 산성화를 측정하기 위해 필수적이다. 또한, 기초 배지의 사용은 (L 알라 닐 글루타민)을 L - 글루타민 포도당 또는 다른 분석 조건 및 / 또는 애플리케이션에 필요한 피루브산 나트륨 농도의 엄격한 제어를 허용한다.

2. 구 분석 실험 및 분석을 형성

참고 : 모든 조직 배양 프로토콜과 조작 청소, 세제 무료, 멸균 유리를 사용하여 큰 관심과 멸균 기술을 사용하여 수행해야합니다. 37 ° C의 물을 욕조에 사용, 미리 따뜻한 모든 매체 및 솔루션 전 (대안으로, 당신은 매체 및 솔루션을 RT에서 미리 예열을 사용할 수 있습니다). 이전 ²¹ 설명 된대로 인간의 PDAC 종양을 얻습니다.

1. 인간의 PDAC에서 암줄 기세포의 분리 (그림1)
   1. 멸균 바이오 캐비닛 1X 멸균 인산 완충 식염수 (PBS) 1 ㎖를 함유하는 60 X 15mm 배양 접시 PDAC 인간 조직을 옮긴다. 멸균 메스와 집게를 사용하여 - (5 MM 1) 작은 조각으로 종양을 말하다.
   2. 배양 접시에 무균 1X 1 ㎖의 PBS를 추가하고 조직이 완전히 분해 될 때까지 분쇄 단계를 반복, 정기적으로 3 ~ 4 라운드를 필요로한다. 멸균 된 튜브에 (위쪽 1X PBS와 함께 5 ㎖의 최종 부피까지) 조직 현탁액을 전송과 같은 기계적으로 gentleMACS dissociator 함께 균질화.
   3. 콜라게나 균질 조직을 37 ° C에서 60 분간 (2.5 밀리그램 / 1X PBS에서 콜라게나 제의 용액을 사용)하고 900 x g에서 5 분간 원심 분리하여 부화. 뜨는을 가만히 따르다 및 완전 배지 10ml에 세포 펠렛을 재현 탁. 900 × g으로 5 분 동안 40 ㎛의 여과기 및 원심 분리기를 통해 세포 현탁액을 필터.
   4. 뜨는을 가만히 따르다과를 재현 탁적혈구 용해 완충액 5 ㎖ (암모늄, 염화 칼륨, ACK)로 펠렛을 배양하고
   5. 젤라틴 코팅 접시에 암줄 기세포 매체, 판에 펠렛을 재현 탁하고, 1 시간 동안 37 ° C에서 품어. 이 단계는 신속하게 판에 부착 섬유 아세포의 대부분을 제거합니다.
   6. 인큐베이터에서 플레이트를 조심스럽게 제거하고 세포 현탁액을 회수하고 혈구를 이용하여 실행 가능한 (트립 판 블루 음성) 세포 수를 정량화. 이를 위해, 현탁액을 부드럽게 혼합하고 에펜 도르프 튜브로 현탁액 20 μL 피펫. microcentrifuge 관의 세포에 트리 판 블루 (1 비율 1)과 잘 혼합 20 μl를 추가합니다. 피펫 혈구 상 혼합물을 약 10 μL.
   7. 생균 수의 계산 챔버의 네 모서리 사분면 내의 모든 명확한 세포를 계산합니다. 참고 : 세포의 생존과 수율이 종양 표본 사이에 상당히 다를 수 있습니다. PDAC 들어 샘플 생존 정기적 betwe 범위45-70% 도중, 및 (3)의 직경을 갖는 거시적 종양 샘플에서 조직편 - 5 ㎜는 대략 ⁶ × 105 생세포로 수득한다.
2. 구 형성 분석 및 메트포민 치료
   1. 세포의 필요한 수를 취하여 2,000 세포 / ml의 세포 농도를 제조 된 CSC 매체의 적절한 볼륨. 1 시간 이상 더 이상 얼음에 세포 현탁액을 유지하고 도금 아니라 이전에 혼합하지 마십시오.
   2. 매체 증발을 최소화하기 위해 가습 24 웰 플레이트의 처음과 마지막 행에 1X PBS의 500 μl를 추가합니다. 종양 구 배지 1 ㎖ (2,000 세포 / ml)에 웰 당 2000 세포의 밀도에서 매우 낮은 세포 부착 플레이트로 세포를 시드.
      참고 : 종양의 종류에 따라서 다릅니다 종양 구 형성 분석에 사용되는 세포의 수입니다.
   3. 차량 (대조군)과 각각의 할당 처리와 4 우물, 메트포르민의 예. 3 mm의 최소 4 우물을 취급합니다. 경기 수37 ° C로 설정 배양기에서 세포를 에이스 일주일 동안 5 % CO ₂ 세포를 공급한다.
      주 : 배지 종양 분야의 교란 형성을 허용하기 위해 변경되지 않아야하지만, 그들은 배지에서 안정적이지 같이 매일 성장 인자 얹어 수있다.
   4. 다른 모든 일 처리, 각 웰에 메트포르민 또는 차량의 예., 3 mM의를 추가합니다. 큰 구조 (도 2)의 계산을 가능하게하는 자동 세포 계수기를 사용하여도 5 및 / 또는 제 7 일 후 형성된 종양 분야의 수를 평가한다.
      주 : 각각 - - (120 μm의 80)는 적어도 40 ㎛의 만 종양 분야는 고려되어야 작은로 분류 될 수있다 (40 내지 80 μm의) 또는 대형. 결과는 (예를 들면, 셀 2000)의 시드 세포의 초기로 나눈 종양 분야의 비율로서 설명 될 수있다.
3. 1 세대 종양 분야의 직렬과 Passaging
   1. 7 일간 배양 한 후, 40 ㎛의 세포 여과기를 이용하여 종양 분야 수확하고 RT에서 900 XG에서 5 분 동안 원심 분리하여 그들.
   2. 트립신을 사용하여 단일 세포 종양 분야의 펠렛을 해리 한 후 전술 한 바와 같이 다른 칠일 (2.2 참조)를 다시 수득 단세포 세포 현탁액을 확장.

3. 대사 분석 (ROS 생산 및 산소 소비)

1. ROS 생산
   1. 이 활성 산소 검출, 저렴한 빠르고 널리 사용되는 프로브 때문에이 프로토콜에서는, 우리는 활성 산소의 생산을 측정하기 위해 예를 들어 카르복시 - DCFDA 사용했다. 그러나,이 분석에 사용할 수있는 여러 가지 다른 프로브 및 방법이있다.
   2. 시간의 할당 된 금액에 대해 2.2에 기술 된 바와 같이 메트포르민과 종양 분야를 취급합니다. 처리의 끝에서 40 μm의 셀 스트레이너를 사용하여 수확 종양 분야는 5 분 동안 900 XG에서 세포를 원심 분리 tryps 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁인치 37 ° C에서 20 분 동안 인큐베이션.
   3. 세포가 단일화되면 900 XG 원심 분리기 및 2.5 μM DCFDA 카르복시 함유 HBSS에서 세포를 재현 탁. 어둠 속에서 37 ℃에서 20 분 동안 세포를 인큐베이션.
   4. 카르복시 - DCFDA이 사진 산화 거짓 긍정적 인 결과를 제공 할 수있는 분석 유동 세포 계측법에 앞서 빛에서 염색 된 세포를 보호합니다. 분석까지 얼음에 튜브를 놓습니다.
      참고 : (.. 전 488nm, 520nm 사이 EM) 활성 산소와 질소 종의 다양한으로 반응 FL1에서 검출 된 후 카르복시 - DCFDA 형광입니다.
2. 산소 소비량 측정
   1. 이 프로토콜을 위해, 우리는 예를 들어, 해마 생명 과학에서 세포 외 유출 분석기 시스템을 사용합니다. 코트 RT에서 20 분 동안 세포와 조직 접착제 22.4 μg의 / ㎖의 용액을 사용하여 원하는 세포 배양 접시. 세포를 파종하기 전에 3 번 - 물 2 우물을 씻어.
   2. 처리의 마지막에, 수확 종양 구체 4를 사용0 μm의 셀 스트레이너, 원심 분리기에서 5 분 동안 900 XG에 세포 트립신 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 37 ° C에서 20 분 동안 품어.
   3. (150 μL의 최종 부피) 접시 / 웰로 96- 웰 플레이트에 30,000 세포의 밀도로 세포 배양 접시에 세포를 개편. 8 mM의 글루코오스, 2 mM의 피루브산 나트륨을 함유하는 산소 소비 분석법 배지에서 세포를 재현 탁.
   4. 100 XG에 도달 할 때까지 우물의 스핀 원심 분리하여 잘의 바닥에 세포를 원심 분리기 다음 브레이크 오프와 원심 분리기 정지를 할 수 있습니다. 접시의 방향을 반전하여 프로세스를 반복한다. 30 분 동안 _{이산화탄소의} 첨가없이 37 ° C 배양기에 플레이트를 전송합니다.
   5. 한편, 분석 용 카트리지를 준비. 각각의 잘로드 할 4 가지 인젝터 (25 μL / 포트)이 있습니다
      1. 포트 : 메트포르민. 도 3 ㎜의 최종 농도를 얻기 위해 175 것 같은 최종 부피 8X 용액 (24 mm)를 준비μL 포트 A. 주입 후
      2. 포트 B : 메트포르민. 3 mm의 추가도 6 mM의 최종 농도를 얻기 위해, 포트 (B)의 주입 후 200 μL 것 같은 최종 부피 9x의 용액 (27 mm)를 준비
      3. 포트 C : 메트포르민. 3 mm의 추가도 9 ㎜의 최종 농도를 얻기 위해, 포트 C. 주입 후 225 μL 것 같은 최종 부피 10 배 용액 (30 mm)를 준비
      4. 포트 D : 로테 11 μm의는, 잘 (11 배)에 최종 농도 1μM을 얻었다. 주 : 로테 완전히 잔류 미토콘드리아 활성을 억제한다.
   6. 카트리지를 보정하고 세포 배양 플레이트를로드. 혼합 및 측정의 표준 프로토콜 분석을 수행합니다.
   7. (100 %로 설정)로 수득 로테 억제 백분율로서 메트포르민 의해 달성 총 미토콘드리아 호흡의 억제 백분율을 계산한다.

4.Immunocompromised에 마우스에서 인간의 췌장암에 대한 이종 이식 모델

참고 : 주문 실험 ³³ 등 NOD-SCID, SCID-베이지, 또는 핵 공급국 그룹 (NSG)과 같은 여성 무 흉선 누드 또는 다른, 더 면역 마우스 모델의 충분한 수. 실험에 앞서 모든 수술 도구를 압력솥하고 사용하기 전에 실온으로 냉각 할 수 있습니다. 피하 종양을 위해 우리는 8 종양 총 측면 당 하나의 종양 상태 당 4 마우스의 최소값을 사용 하였다.

1. 이종 이식 이식
   1. 인간의 췌장 암 조직 표본에서 종양 조각을 준비한다. 페트리 접시로 옮긴 후 ​​종양 조직을 보유하는 메스와 핀셋을 이용하여 ⁽³ ~ 8mm, 직경 2 mm)를 작은 조각으로 조직을 해부. 젤라틴 단백질 혼합액으로 얻어진 조각을 딥 얼음에 보관.
   2. 3 % 이소 플루오 란 등 inhalative 또는 주 사용 마취제 - 1을 사용하여 마우스를 마취.
      참고 : 어떤 수술 PROC를 시작하기 전에edure, 마우스가 완전히 복부 피부를 자극하여 의식을 분실 또는 가시 집게 한 쌍의 견인했는지 확인하십시오. 건조 함을 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다.
   3. 마취 사항이 적용되면, 방부제 에탄올 함유 피부와 마우스의 뒷면을 닦아주십시오. 부 프레 노르 핀 (0.05 ㎎ / ㎏ BW) 이전에 수술 후 통증을 보장하기 위해 수술을 관리합니다.
   4. 0.7 할, 집게로 다시 피부를 들어 올려 - 멸균 마이크로 가위로 1.0 cm 길이의 절개를하고 퉁명스럽게 환자 유래 췌장암 조직의 일부가 삽입되는 작은 피하 주머니, (~ 8mm ^3)을 준비합니다.
   5. 2 피부 스테이플 - 1을 사용하여 상처를 닫습니다. 칠일 후에 제거합니다. 자신의 새장에 마우스를 반환하고 다시 완전히 활성화 될 때까지 가열 패드 또는 가열 램프 아래에 보관하십시오.
   6. 종양 이식을 따르면, hunche, 종양의 성장 및 주름 장식 모피로 사망률을 발생의 일반적인 징후가 적어도 일주일에 두 번 마우스를 모니터D 자세 및 부동성.
   7. 종양이 200mm ^(3)의 평균 크기에 도달하면, 마우스를 무작위로 각 치료된다. IP 주사 (150 ㎎ / ㎏ BW)를 통해 또는 유사한 치료 효과와 마시는 물 (150 ㎎ / ㎏ BW)를 통해 매일 차량 또는 메트포르민을 관리합니다.
   8. 캘리퍼스를 이용하여 종양 부담을 모니터하고, 종양 부피는 일주일에 한 번 (종양 부피 측정 = 숨 × 폭 × 1/2 길이)를 계산한다.
   9. 종양이 직경 1cm에 도달 한 이상 지정된 마우스는 심한 통증이나 질병의 흔적을 보여주는 시작하면 마우스를 희생.

결과

메트포민은 선택적으로 췌장 암줄 기세포를 표적으로

우리는 먼저 CSC 추가의 시험 관내 자기 갱신 용량에 메트포르민 치료 작용 효과를 조사 하였다. 이를 위해, 우리는 수술 중에 절제 PDAC 조직으로부터 격리 차 인간 췌장암 세포를 사용하여 구 형성 검정을 실시 하였다. 우리는 메트포르민 강하게 형성 구체 (도 1a)의 크기를 감소하는 것이 관찰했다. 이것은 그들이 단지 된 CSC 위해 농축 된 바와 여전히 분야에서 발견 된 세​​포의 대부분을 대표하는 CSC의 자손의 팽창을 억제함으로써 대부분이었다. 사실, 더 이상 구가 할 것이다 더 차별화 된 자손의 더 광범위한 확장을 계대 배양하지 않고 있습니다. 따라서 우리는 크게 C의자가 재생산 능력 강한 억제를 제안 용량 의존적 방식으로 발생하는, 실제의 크기에 상관없이 형성되는 구체의 개수를 감소시키는 메트포르민 발견으로 SC (데이터 미도시). 우리는 3 mM의에서 그 메트포르민은 크게 (그림 1B) 형성 구체의 수를 감소 발견했다. 더 엄격 된 CSC의자가 재생산 능력에 메트포르민의 장기간 효과를 연구하기 위해, 우리는 다음에 2 차 및 3 차 분야에 형성된 기본 분야 계대. 단지 주 분야는 메트포르민으로 치료되었지만, 두 번째와 세 번째의 구체 통로의 형성은 현저하게 증가하고 메트포르민 치료 실제로 역적 된 CSC (도 1C)의 대부분을 제거했다 연루 감소 하였다. 따라서, 우리의 데이터는 기본 췌장 암줄 기세포의자가 재생 능력에 메트포민 상당한 치료 효과를 보였다 따라서 더 기계적인뿐만 아니라 생체 내 연구를 수행하기 위해 우리를 격려했다.

메트포민은 미토콘드리아의 산소 소비를 억제하고 활성 산소의 생산을 유도

metformi 이후n은 부분적으로 복잡한 내가 활동을 억제함으로써 미토콘드리아 독의 역할 나타났다, 우리는 다음 영역에서 파생 된 세포에서 세포의 산소 소비에 메트포르민의 급성 효과를 조사 하였다. 이를 위해, 우리는 두 가지 대표적인 기본 PDAC 종양 유래의 세포를 선택하여 3 밀리미터 메트포르민 (세 주사) 및 1 μM의 로테 논 (하나 주입)의 순차 주사 다음 시간에 걸쳐 산소 소비를 측정했다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, 메트포르민 주입 다른 종양 사이의 상당한 변화 산소 소비의 급속한 및 용량 의존적 감소를 유발. 우리는 완전히 미토콘드리아 산소 소비를 억제 할 수있다 로테 논, I 억제제가 유력한 착체를 주입하여 메트포르민 처리시 잔류 미토콘드리아 활성을 계산 하였다. 용량과 상관 미토콘드리아 산소 소비의 관점에서 메트포민 감도 popu의 평균의 변위로서 정의 ROS 생성을 유도쉽게 (그림 2B, 오른쪽 패널)을 정량화 할 수있다 메트포르민 치료 (그림 2B, 왼쪽 패널), 후 LATION. 예상 한 바와 같이, 산소 소비의 억제에 가장 민감 일차 전지는 메트포르민 치료시 ROS 생산의 강한 증가를 보여 주었다. 따라서, 이러한 대사 생체 외 실험 이후의 미토콘드리아 ROS 생산 증가 및 세포 사멸의 결국 유도 결과, 미토콘드리아 기능에 대한 의존도를 억제함으로써 그 메트포르민 대상으로 암줄 기세포를 보여줍니다.

메트포민 포장 마차 PDAC 진행 생체

우리는 마침내 PDAC와 다른 환자에서 파생 된 조직 이종 이식을 이용하여 생체 내에서 메트포르민의 효과를 연구 하였다. 우리는 대조군에 비해 메트포르민 - 처리 된 마우스에 대한 종양 진행에 상당한 감소를 관찰하지만, 종양 결코 완전히 DISAppeared (그림 3). 이어서, 장기 추적 중에 결국 모든 종양 치료의 초기 위상을 생존 세포의 메트포르민 저항을 제안 재발. 그럼에도 불구하고, 메트포르민 치료는 단일 작용제로서 적용하는 경우에도, 모든 마우스에서 유의하게 생존 기간을 연장.

도 1 메트포민 선택적 된 CSC를 목표로하고있다. (A) 메트포민은 구체의 크기를 감소시켰다. 구체의 대표 이미지를 7 일 (오른쪽 패널)에 대한 메트포르민의 표시된 용량과 처리 후의. 구 크기 (n≥6) (왼쪽 패널)의 정량은, 횡축 축에 표시된 숫자는 각각의 종양을 나타냅니다. (B) 횡축에 칠일 (n≥6), 표시된 숫자의 존재 또는 메트포르민의 부재에서 구 형성 능력축이 개별 종양을 나타냅니다. (C) 주요 췌장암 세포의 2 차 및 3 차 분야에서 CSC 자기 갱신 용량의 대표적인 그래프. 구체는 단지 7 일 총 1 세대 구 형성하는 동안 처리 하였다 (N = 6). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. 메트포민 치료 억제 산소 소비와 유도 ROS 생산. (A) 메트포민의 추가는 구형 유래 세포의 산소 소비량 (OCR)을 억제한다. 두 개의 다른 이차 PDAC 구체 메트포르민으로 치료하고, OCR 변화는 세포 유동 분석에 의해 측정 하였다. 로테 분사 총 미토콘드리아 OCR 소비 대조군으로 사용 하였다.X 축은 각 웰의 단백질 함량에 의해 표준화 산소 / hr의 pmol의 산소의 소비 속도를 나타낸다. 에 사용되는 (B) PDAC 분야는 메트포르민과 8 시간 동안 처리하고, 활성 산소 생산은 카르복시 - DCFDA를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 평가되었다. 플롯 세포 계측법 왼쪽, 대표 흐름. 마우스 오른쪽 단추로, 3 개의 독립적 인 실험 데이터의 요약. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3 생체 내에서 메트포민이 진행 노점 PDAC. 두 개의 상이한 PDAC 이종 이식 조직을 면역이 마우스에 이식하고, 종양 초기 인출이 확인 된 후 처리가 할당되었다. 마우스가 메트포르민 (메트로)로 처리 마시는 물에 첨가 하였다 (150 ㎎ / ㎏ 몸 웨이GHT; 하루에 물 소비) 5 ㎖를 기준으로합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

많은 종양 CSC 개념의 출현 이후 유효성 검사, 약물 개발의 분야는보다 효율적인 암 치료법을 개발하고이어서 질환 재발의 위험을 감소시키기 위해 잠재적으로 새로운 추진력을 얻고있다. 그러나, CSC 필드 이해 CSC 기원과 전파 및 종양 구조를 형성 및 전이를 촉진하는 역할의 관점에서 달성 될 초기 상태보다 여전히 필요하다.

이러한 맥락에서, 재현과 의미있는 CSC 분석의 사용뿐만 아니라 획득 한 데이터의 정보를 해석은 CSC 생물학에 대한 우리의 이해를 증진하기위한 중요한 구성 요소를 나타냅니다. 많은 생물 학적 관점에서, 구 형성은 매우 가치 분석로 떠오르고있다; 그럼에도 불구하고 사용자는 제대로 자신의 실험 결과를 해석하기 위해 그 한계를 알고 있어야합니다. 중요한 측면은 심지어 구 견적을 평가하기 전에 고려해야 할신선한 환자 유래의 시료로부터 수득 된 결과 확립 된 암 세포주로부터 얻은 것과는 상당히 다를 수 기 때문에 데이터는 조사 샘플의 기원이다.

고전 구 형성 ^분석은, 초저 부착 플레이트 클론 밀도로 세포를 파종하고, 표피 성장 인자의 존재 (EGF) 및 / 또는 농축 된 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (b-FGF)의 구 형성을 평가하지만, 무 혈청 배지 ⁽²¹⁾ 것을 포함한다 ^(34). 배지 조성물은 또한 고려해야 할 중요한 문제이다. 우리의 경험에서 우리는 혈청의 부재 B27, bFGF에와 글루타민 보충 DMEM / F12는 미분화 상태에서 CSC를, 성장을 확장하고 유지하기위한 최적의 매체 것을 발견했다. 우리는이 문화 조건 (매체 및 서스펜션)에있는 세포 (CD133 + CD44 +와 CD24 + 포함) 암 줄기 세포 마커의 높은 금액을 표현하고 (CK를 분화 관련 단백질을 발현하지 않는 것을 발견-20과 CK-19).

이러한 분석에 대한 기본적인 가정 중 하나는 각각의 구형 즉, 하나의 구체 단일 줄기 세포의 팽창의 결과, 클론이라는 것이다. 그러나, 구 낮은 시딩 밀도 ^35도 융합하는 경향이 동적 구조는 본질적이다. 세포를 도금하는 프로토콜의 중요한 단계 확실히 응집 문제를 회피 할 수 아니라 하나의 셀 / 밀도이다. 그러나 심지어 전향 정렬 선조, 이것은 정기적으로 인해 낮은 극한 구 형성 활성에 매우 낮은 구 형성에 의한 결과와 같은 희석 효과에 한정 분비 자극에 기인 할 수있다. 우리의 경험에서 우리는 도금 세포의 30 %가 구체를 형성 할 수있는 것을 관찰했다. 우리는 일관되고 재현 가능한 결과를 얻기 위해 잘 적어도 100 세포 / 사용하는 것이 좋습니다.

성장 CSC에 다른 배양 방법은 m에 기초하여, 예를 들면 고체 또는 반고체 차원 배양 (에 기초atrigel, 콜라겐 또는 메틸). 이러한 방법은 세포 이동과 후속 세포 응집 ^(36)를 제한하는 데 사용되어왔다. 그러나, 이들 행렬들 각각은 자신의 한계를 맺는다. 예를 들어, 마트 리겔은 가용성 지하 Engelbreth-홀름 - 백조 (EHS)에서 분리 막 종양과 추출물은 많은 조직에서 발견되는 복잡한 세포 종양 환경과 유사하지만, 종종 기계적인 렌더링 여러 다소 정의 된 성장 인자를 포함하지 매우 어려운 특정 규제 요소에 대한 연구. 고려의 또 다른 점은 구 형성 용량 및 줄기 세포의 기능이 상호 교환 조건 ^(34)이 아니라는 것이다. 특정한 줄기 세포 및 선조 세포를 생체 내 줄기 / 선조 기능을 배제하지 않고 시험 관내에서 구체를 생성 구 형성능 ³⁷ 실패를 나타내는 것으로 도시되었지만. 예를 들어, 정지 줄기 세포는 단순히 의해 제공된 세포 외 큐에 응답하지 않을생체 외 배양 조건에서 선택. 따라서, 시험 관내에서 우선적 일련 계대 동안 정제 된 세포 집단, 생체 자기 갱신 용량 장기 증명 또는 줄기 세포의 기능을 반증하기 위해 평가되어야한다. 이러한 맥락에서, 전향 동시에 줄기 세포 및 선조 세포의 다양한 인구를 전파 할 수있는 능력이 구 형성 분석의 중요한 측면이며, CSC 필드에 대한 분석이 매우 가치를 렌더링; 한 한계 얻어진 데이터의 해석을 염두에 보관되어있다.

스피어 형성 분석은 널리 향적 체외 단일 세포 수준에서의자가 재생과 분화하는 능력에 기초하여 줄기 세포를 식별하기 위해 사용되어왔다. 이들 생체 내 틈새로부터 장래 줄기 세포의 분리 및 그 자손을 허용 마커의 발견은 개체군의 정제 된 기능적 특성을 정의 할 수있다. C구 형성 분석의 ombination 및 외과 고체 조직에서 세포를 분리 또는 문화에 PDAC의 특정 소집단을 풍요롭게하는 성공적인 전략이다. 원래 종양의 이질성을 반영, 자기 갱신, 차별화하고 종양을 시작 예를 들어,는 EpCAM, CD24 및 CD44의 동시 표현은 할 수 암줄 기세포의 모집단을 정의합니다. 헤르만은 등. CD133 + 세포가 증가 된 증식 능력을 보유하고 CSC ^(15)을 갖추고 있음을 보여 주었다. 다른 마커는 CSC 추가의 특성화를 위해 사용되었다 : ALDH- 1 (알데히드 탈수소-1)의 발현이 췌장암 ³⁸ 고도로 종양 세포와 연관되고; DNA 염료 훽스트 33342을 배제 할 수 세포라는 측면 인구 (SP) 세포 종양 ^(39)을 시작하는 입증 된 능력을 가지고있다. 최근에 우리는 세포 내자가 형광 함은 다른 종양 종류에 걸쳐 독점적 인 CSC의 특성과 인간 세포의 고유 한 인구를 특징 짓는 것을 보여 주었다이러한 마커 중에 선택적으로 암줄 기세포의 순수 인구의 특성을 표시하지 않지만 세포의 더 세련 인구를 정화 ^(40)., 마커의 더 복잡한 조합 외과에 사용 될 필요가있다.

많은 질문은 여전히​​ 종양의 기원, 진행, 약물 저항의 암줄 기세포의 정확한 역할에 대해 남아있다. 예를 들어, 단일 CSC는 종양을 시작하는 경우와 방법을 정의 클론 진화의 문제를 해결하는 하나의 방법, 질병의 다른 단계에서, 환자 샘플을 분석하고, 구체적 동안 처리 전후 CSC 추가의 번호를 수행하는 것일 수있다. 이러한 질문에 대답함으로써, 우리는 고형 종양에서 암줄 기세포에 대한 우리의 지식의 의미있는 진전을 궁극적으로 종양의 진행과 재발을 방지하기 위해 약물 치료를 개발할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Counting Chamber/Hemocytometer	Hausser Scientific Co	3200
CASY Cell Counter and Analyzer for proliferation and viability measurement	Roche Innovatis	AG CASY Model TTC 45,60,150 μm
GentleMACS Dissociator	Miltenyi Co	130-093-235
GentleMACS C Tubes	Miltenyi Co	130-093-237
24-well Ultra-low Attachment Plates	Corning	3474
100-mm tissue culture dishes	BD Falcon	353803
Cell strainer	BD Falcon	352350
15-ml polypropylene conical tube	BD Falcon	352097
50-ml polypropylene conical tube	BD Falcon	352070
1.5 ml sterile tubes	Eppendorf	0030 120.086
50 ml centrifuge tubes	Corning	430828
Sterile petri dishes, 10 cm dishes	Corning	353003
26 G needles	BD Falcon	300600
100 ul Hamilton Syringe	Hamilton Syringe Co	81075
Collagenase type IV	Stem Cell Technologies	7909
RPMI Medium 1640	Life technologies	11875-085
Penicillin/Streptomycin solution, 100X	Life technologies	SV30010
Metformin	Sigma	D150959-5G
L-glutamine, 200 mM, 100X	Life technologies	25030-081
D-Glucose	Sigma	G8270
100mM Sodium Pyruvate solution	Life technologies	11360-070
Seahorse Assay medium	Seahorse Bioscience	100965-000
BD Cell-TAK Cell and Tissue adhesive	BD Biosciences	354240
Trypsin solution, 0.05%	Life technologies	25300054
B27 Supplement 50x	Life technologies	17504-044
Basic Fibroblast Growth Factor	Sigma	F0291
Bovine Serum Albumin	Sigma	A9576
Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12	Sigma	D8437
Sterile 1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma	D8537
Trypan Blue	Life technologies	15250-061
Carboxy-DCFDA(5-(and-6)-Carboxy-2',7'-DichlorofluoresceinDiacetate)	Life technologies	C-369
Rotenone	Sigma	R8875
Ethanol 70% (vol/vol)	Sigma	459844
Isofluorane	IsoVet, Braun	571105.8
Matrigel	BD Biosciences	35620
Sterile Cotton tipped applicator	Puritan medical
XF96e FluxPak with cell plates, calibrant and cartridges	Seahorse Bioscience	102416-100
XF96e Extracellular Flux analyzer	Seahorse Bioscience
Incubator with CO2 input
Micro scissors
Curved forceps
Splinter forceps
Caliper