Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Özet

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Özet

Pankreas duktal adenokarsinom (PDAC) tümör başlaması, metastaz ve direnç radyo-kemoterapi ve sürücü gösterilmiştir münhasıran tümörijenik kanser kök hücrelerinin (rulmanları) bir alt kümesini içerir. Burada ankrajdan bağımsız koşullarda tümör küre gibi primer insan pankreas CSCS kültürlenmesi için belirli bir metodoloji tarif eder. Hücreler, bunların daha farklı yavrularıyla hayatta ve tek hücre tohumlama, aşağıdaki başlangıç ​​aşamasında prolifere yok iken CSCS için zenginleştirmek üzere serumsuz yapışmayan koşullarda büyütülür. Bu deney, tümör hücrelerinin bir popülasyon içinde bulunan CSCS yüzdesini tahmin etmek için de kullanılabilir. Oluşan tümör kürelerinin iki (35 ila 250 mikrometre arasında olabilir) boyutu ve sayısı kültürlenmiş kanser hücrelerinin dökme popülasyonları ya da taze hasat edilmiş ve dijeste tümör ^1,2 ya barındırmıştır CSC aktivitesi gösterir. Bu tahlili kullanarak, son zamanlarda, metformin seçici pancreat ablates bulunduic CSCS; Daha sonra daha fazla pluripotense ilişkili genler / yüzey markerlerinin azalmış ekspresyonu gösteren ile doğrulanmıştır ve metformin ile muamele edilmiş hücrelerin in vivo tümöre neden olması indirgendi bir bulgudur. Preklinik gelişim için son adım olarak, metformin ile kurulan tümörleri taşıyan farelerin tedavi ve sağkalımı anlamlı uzamış bulundu. PDAC hastalarda metforminin kullanımının test klinik çalışmalar halen devam etmektedir (örneğin, NCT01210911, NCT01167738 ve NCT01488552). Mekanik olarak, biz metformin reaktif oksijen türleri (ROS) üretimini arttırmak ve mitokondriyal transmembran potansiyeli azaltarak CSCS ölümcül bir enerji krizi indükler bulundu. Tersine,-CSCS metformin tedavisi ile elimine değil, tersine çevrilebilir, hücre siklüs hapsinden geçmiştir değildi. Bu nedenle, bizim çalışmamız potansiyel CSC hedef bileşiklerin belirlenmesi için bir tarama aracı olarak in vitro küre oluşumu potansiyeli için başarılı bir örnek olarak hizmet vermektedirs, ancak bu teknik yanlış keşifler ortadan kaldırmak için in vitro ve in vivo doğrulama de gerektirir.

Giriş

Pankreas duktal adenokarsinom (PDAC) en agresif solid tümörlerin biridir. Şu anda Batı toplumunda ^4. en sık görülen kanser ilişkili ölüm ve (~ dünya çapında yılda 400.000 ölüme) önümüzdeki on yıl içinde ^2. en sık nedeni mevcut hastaların tanısı% 90 ³ Kasza yükselme zamanı tahmin edilmektedir % 5'ten az bir 5 yıllık sağkalım sahip ilerlemiş hastalığı ile. Bu hayatta kalma oranı hayal kırıklığı giderek yoğun araştırma faaliyetleri ⁴ rağmen son 50 yıl içinde değişmeden kalmıştır. Cerrahinin potansiyel 'iyileştirilebilir' hastalığı olan hastaların kalan% 10,% 80 5 yıl içinde nüks ölecek. Uzun yıllar boyunca ilerlemiş hastalık için standart tedavi gemsitabin monoterapisi olmuştur, ama bu sadece marjinal sağkalım avantajı ⁵ bahşeder. Ilavesi ile elde edilmiştir kısa vadeli sağkalım Küçük iyileştirmelererlotinib ⁶ veya kapesitabin ^7, ancak sağkalım avantajı medyan genel sağkalım hala ~ 6 ay ile hafta sırayla olduğunu. Son zamanlarda, daha cesaret verici sonuçlar gemsitabin / nab -paclitaxel ⁸ ve FOLFIRINOX kombinasyonu rejimi ^9,10 için ortaya çıkmıştır. Bu tedaviler, sırasıyla mütevazı 2 ve 4 ay medyan sağkalımı, ama son derece zehirli ve uzun vadeli kurtulan hala nadir bir istisna vardır. Tedavi iyileştirme potansiyeli sunuyor olsa da, bu pek çok hasta cevap veya sadece genel sağkalım içinde artan bir gelişme görünmüyor hangi zehirli rejimler vardır. Sonuç olarak, mevcut tedaviler tamamlamak ve roman, büyük olasılıkla modelli tedavi yaklaşımları geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır.

Tümör Heterojenite

Kanser heterojenlik yalnızca farklı evrimsel altklonları withi sınırlı olmadığını giderek daha belirgin hale geliyorn Her tümör ¹¹ değil, aynı zamanda her bir alt klon ¹² içinde fenotipik ve fonksiyonel heterojenliği ve plastisite ile tahrik. Sözde kanser kök hücreleri (rulmanları) veya tümör teşvik hücreleri intraclonal heterojenite ^13-16 sorumludur. Özellikle, CSCS her kanser alt klon ¹⁷ içindeki tüm farklılaşmış yavru doğuran hastalığın kökü temsil ettiğini, biz ve diğerleri tek hücreden aşağı, kesin kanıt sağlamıştır olan kanser hücresi bir alt temsil eder. Daha da önemlisi, bu hücreler metastatik davranışı için gerekli olan ve aynı zamanda da ilk tümör regresyonu (örneğin, NAB -paclitaxel) ^15,18-20 indükleyebilen nispeten etkili ilaçlar ile tedavi sonrası hastalık nüks için önemli bir kaynağı temsil eder. Bu CSCS mutlaka iyi niyetli kök hücreleri temsil etmemektedir, ne de birçok durumda doku kök hücrelerinden kaynaklanan unutmayın önemlidir, ancak bunun yerine AKA varKök hücrelerin bazı özelliklerini edinilmiş. Örnek CSCS belirsiz kendini yenileme kapasitesi konvansiyonel kemoterapiye karşı dirençli hale donatılmıştır ve metastatik aktivite teşvik invaziv artmış göstermek için Bunların çoğu işlevsel, tanımlanmıştır.

Fonksiyonel Kanser Kök Hücre Fenotipleri

CSCS fonksiyonel fenotipi, sırasıyla bir seri küre oluşumu ve koloni oluşumu tahlilleri kullanılarak in vitro olarak test edilebilir kendini yenileme kabiliyetleri dayanmaktadır. Daha da önemlisi, tercih edilen özel bir uzun süreli tümöre neden olması arasında gösterge seri nakli sırasında nihai fonksiyonel bir okuma olarak in vivo tahliller sınırlayıcı seyreltme ile test edilebilir in vivo tümöre neden olarak kendini yenileme ayı yeteneğine CSCS. Ayrıca, CSC bölmesi içinde heterojenite sadece olmadığını metastaz doğuran özel yetenek taşıyan CSCS ayrı bir ICSI'nin ile vardırin vivo tümorijenisite kendi münhasır doğrudan sonucu. Nitekim, metastastitic CSCS, birincil tümörün kaçmasına anoikis hayatta ve sonunda yerini değiştirmek ve ikincil siteler tohum yeteneği kazanır. Bu gelişmiş fonksiyonel özellikler metastazı tahlilleri kullanılarak modifiye işgali testleri ve in vivo olarak kullanılarak, in vitro olarak test edilebilir.

Kanser Kök Hücreleri Hedefleme

Bir CSC hedefleme stratejisi ²¹ ile kombine sürece biz ve diğerleri tedavileri hatta stroma hedefleme maddeler ile bir arada, farklılaşmış PDAC hücrelerinin toplu tümör odaklanan inandırıcı kanıtlar sağladı, tümör ilerlemesi ve sonraki sonuç üzerinde önemli bir etkisi ^{yoktur, 22.} Böylece, hastalığın ilerlemesi ve tedaviye direnç CSCS kritik fonksiyonları dayanarak, bu hücreler herhangi yeni bir tedavi yaklaşımının ^18,20 için önemli bir bileşeni delalet, ama çok daha anlayışa o gerektirirCSCS düzenleyici makine f. CSCS ve daha farklılaşmış yavrularıyla genetik değişiklikler ile ilgili olarak aynı genetik yere durumları taşıyan, ancak CSCS ayrı ve dolayısıyla epigenetik kararlı gen ekspresyonu, pluripotent kök hücreleri ile bu payı modüllerini profilleri sergilemektedirler. Üreten uyarılmış pluripotent kök hücreler (Nanog, Oct3 / 4, Klf4 Sox2) yer alan genlerin çoğu sadece kanser ile bağlantılı değil, ama onların ifadesi çoğunlukla CSCS bölmeye sınırlıdır. Dahası, CSCS hedefleyen genetik araçlarını kullanarak kayıp fonksiyon-deneyleri ile CSCS fonksiyonel önemi artık iyice çeşitli kanser türleri ^23-25 ​​için CSC konsepti kurduk. Bu yaklaşımların çoğu fare modellerine dayalı ve böylece kolayca kliniğe devredilemez edilirken, toplu tümör hücreleri ile birlikte CSCS hedef potansiyel klinik alaka için kanıt-of-concept sağlarlar.

Vi yılında Kanser Kök Hücreleri incelenmesitro Onların Aşil 'Heel tanımak

CSCS hedefleme için, yeni ve klinik olarak geçerli olan yollarını belirlemek için, bunların özellikleri düzenli in vitro incelenmiştir ve küre oluşumu yaygın olarak bu bağlamda kullanılır. Başlangıçta kendini yenileme ve farklılaşma kapasitesi de dahil olmak üzere, normal kök hücre biyolojisi, eğitim için geliştirilen bu deney daha sonra in vitro CSCS incelemek için adapte edilmiş ve PDAC ²⁰ izole CSCS araştırmak için kullanılmıştır. Bu yüzden, eğer niyetli pankreas CSCS ²¹ içeren gösteren primer insan PDAC hücrelerinden oluşan tümör küreler CSCS tüm farklı özelliklerini taşıyan bulmuşlardır. Bu durumda, tümör küre deney in vitro daha etkin tedavileri için ekran için güçlü bir araç temsil eder, ancak sonuçlar ayrıca in vivo deneylerde daha sıkı olarak değerlendirilmesi gerekir. Nitekim, bu in vitro testi ile oluşturulan veriler inci gibi büyük bir dikkatle tedavi edilmelidirE tahlil önemli hata tabi olabilir. Oluşan küreler otomatik sayımı dahil oldukça standart protokoller, tekrarlanabilir ve öngörü veri sağlamak için oluşturulmalıdır.

Bu bağlamda, son zamanlarda primer insan PDACs çeşitli bir kümesinden türetilen pankreas CSCS taranması için bu tahlil kullanılmıştır ve bu hücreler, anti-diyabetik bir bileşik, metformin metabolik yeniden programlama karşı oldukça hassas olduğu saptanmıştır. Daha önce, metformin AMP-aktive protein kinaz (AMPK) sinyal ve indirgenmiş protein sentezi ve hücre çoğalması ²⁷ ile sonuçlanan mTOR ²⁶ daha sonra inhibisyon, dolaylı aktivasyonu kanser hücresi genişlemesi inhibe ettiği gösterildi edilmiştir. Kütle, tümör uygulanan bu etkilere ek olarak, ve diğerleri, metformin hedef ve aslında bu meme, yemek borusu kanseri, glioblastoma ve pankreas kanseri ^{28-31 katı tümörlerin bir dizi CSCS alt popülasyonu ortadan kaldırmak mümkün olduğunu bulmuşlardır/ Sup>. Böylece, metformin halen karşılanmamış tıbbi ihtiyacı olan birçok kanser için umut verici ve güvenli yeni tedavi stratejisini temsil ediyor. Ayrıca, CSCS zenginleştirmek için bir yol olarak küre oluşumu kullanılarak, pankreas CSCS ilgili metforminin birincil etkileri AMPK aktivasyonunun bağımsız ve daha çok görünüşte alt-grup için öldürücü olduğu, (karmaşık I'in inhibisyonu ile) mütevazı mitokondriyal toksisite dayanıyordu olduğunu gösterdi CSCS sadece. İkincisi biz hücresel düzeyde ilacın toksisite göstergeleri olarak kendi hücresel oksijen tüketimi ve mitokondriyal ROS üretimini değerlendirmek başardık. Daha sonra, bu in vitro veriler, klinik öncesi fare modellerinde doğrulanmıştır ve gerçekten de önemli ölçüde sağkalımı 31 uzamış neden olabilir. Burada sunulan metodoloji CSC metabolizması üzerindeki etkileri üzerine yapılan çalışmalar da dahil olmak üzere CSCS ilaç duyarlılık profilleri, hızlı nesil için izin verir. Şimdi kullanılan com hakkında deneysel ayrıntıları genişletilmiş sağlamaktamamlayıcı görevlerdir in vitro ve in vivo prosedürlerde.}

Protokol

İnsan PDAC tümörler yazılı bilgilendirilmiş onam (Comunidad de Madrid, İspanya (CP CNIO-CTC-11 ile elde edildi -. CI 11/103-E) immün yetmezliği olan farelere insan pankreas tümörlerinin implantasyonu Kurumsal Değerlendirme Kurulu onayını gerektirir yanı sıra Kurumsal . Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) ksenogref pankreas tümörü fare modellerinin usul kurumsal ve ulusal düzenlemelere uygun olarak yapılmalıdır (; Madrid, İspanya, burada Etik Instituto de Salud Carlos III Komitesi Protokolü PA 34_2012).

1. Kültür Medya

1. Komple Orta hazırlayın.
   1. % 10 FBS, 100 ünite / ml penisilin / streptomisin ile RPMI ortamı Supplement. RPMI, 500 ml penisilin / streptomisin (10,000 U / ml, 100X) ısı ile inaktive edilmiş FBS 55 ml 6 mL ekleme için.
   2. 4 ° C'de komple ortam saklayın.
2. CSCS Orta hazırlayın.
   1. Serumsuz DMEM / F12 Mediu'yu Ek100 birim / ml penisilin / streptomisin ve 2 mM glutamin ile m.
   2. 4 ° C'de CSC orta saklayın. B27 (01:50) ve 20 ng / ml bFGF, taze her bir deney öncesi ortamına ilave edilir.
      NOT: B27 eklenmesi tümör küre oluşumunu arttırmak ve küre kültürlerin ³² çeşitli pasajlar sürdürmek için gösterilmiştir. ortam bileşimi çok önemli bir adımdır ve kültür, her hücre tipi için test edilmesi gerekir. Biz test kendini yenileme ve kürelerin farklılaşma kapasitesinin tavsiye ve flow sitometri CSC belirteçlerin ifadesini analiz (yani, CD133 + ve CD44 +).
3. Ekstrasellüler Flux Assay Orta hazırlayın.
   1. Bu özel ortam vitaminler, aminoasitler ve diğer takviyeleri içeren, ancak glutamin, glikoz, pirüvat ve bikarbonat eksik bazal DMEM 5030 olduğunu.
   2. Mevcut deneyi için, tam bir mitokondrial metabolik aktivite 2 mM glutamin, 8 mM glikoz ve 2 mM sodyum piruvat ile orta tamamlar.
      Not: Normal ortamı ihtiva eden bikarbonat tahlil sırasında pH varyasyonları tampon çünkü sodyum bikarbonat bulunmaması doğru kültüründe büyüyen hücre dışı asitleşme ölçmek için gereklidir. Buna ek olarak, bir bazal ortamın kullanımı (L-alanil-glutamin gibi) L-glutamin glikoz, ya da farklı deney koşulları ve / veya uygulamalar için gerekli olan sodyum piruvat konsantrasyonunun sıkı bir kontrol sağlar.

2. Küre Testi ve Analiz Şekillendirme

Not: Bütün doku kültür protokolleri ve manipülasyonlar, temiz, deterjan içermeyen ve steril cam kullanılarak büyük bir dikkat steril teknikler kullanılarak gerçekleştirilmesi gerekir. 37 ° C su banyosunda kullanımı öncesi sıcak tüm orta ve çözüm öncesinde (alternatif olarak, size orta ve çözümleri oda sıcaklığında önceden ısıtılmış kullanabilirsiniz). Daha önce ²¹ ayrıntılı olarak İnsan PDAC tümörleri edinin.

1. İnsan PDAC gelen CSCS izolasyonu (Şekil1)
   1. Steril bir biyo-güvenlik kabini steril 1X fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1 ml ihtiva eden bir 60 x 15 mm kültür çanağı insan PDAC doku aktarın. Steril bir neşter ve forseps kullanarak - (5 mm 1) küçük parçalar halinde tümörün kıyma.
   2. Kültür çanak steril 1X PBS 1 ml ekleyin ve doku tamamen ayrışmış kadar toz haline getirme adımı tekrarlayın, düzenli olarak bu 3-4 mermi gerektirir. Steril bir tüpe (üst 1X PBS ile 5 ml'lik bir nihai hacme kadar) doku süspansiyonu aktarın ve mekanik olarak gentleMACS bir ayrıştırıcı ile homojen hale getirilir.
   3. Kolajenaz ile homojenize doku 37 ° C'de 60 dakika boyunca (2.5 mg / 1X PBS içinde kolajenaz ml kullanın) ve daha sonra 900 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj inkübe edin. Süpernatant boşaltacaktır ve tam ortam, 10 ml hücre pelletleri tekrar süspansiyon. 900 x g'de 5 dakika boyunca 40 um süzgeç ve santrifüj yoluyla bir hücre süspansiyonu süzün.
   4. Süpernatant Durusu ve tekrar süspansiyonkırmızı kan hücre parçalama tamponu, 5 ml (amonyum-klorid-potasyum, ACK) ile pelet ve inkübe
   5. Jelatin kaplı tabak üzerine CSCS orta plaka pelet yeniden süspanse edin ve 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Bu adım hızla plaka takmak fibroblast hücrelerinin çoğu kaldıracaktır.
   6. Inkübatörden plakasını çıkarın ve dikkatlice hücre süspansiyonu kurtarmak ve hemasitometre kullanarak canlı (tripan mavi-negatif) hücrelerin sayısını ölçmek. Bu amaç için, hafifçe süspansiyonu karıştırmak ve bir Eppendorf tüpüne süspansiyon 20 ul pipetle. Mikrosantrifüj tüpü içinde hücreler tripan mavisi (1 oranında 1) ve iyice karıştırın 20 ul ekle. Pipet hemasitometre üzerine karışımın yaklaşık 10 ul.
   7. Canlı hücre sayımı için sayım odasının dört köşe kadran içindeki tüm açık hücreleri saymak. Not: Hücrelerin canlılığı ve verim tümör örneklerinin arasında önemli ölçüde değişebilir. PDAC için numuneler canlılığı düzenli betwe aralıkları45-70%, en-3 arasında bir çapı olan bir makroskopik tümör örneğinden doku parçaları - 5 mm, yaklaşık 5x10 ⁶ canlı hücrelere vermelidir.
2. Küre Oluşumu Testi ve Metformin Tedavisi
   1. Hücrelerin gerekli sayısı almak ve 2000 hücre / ml'lik bir hücre konsantrasyonuna hazırlamak için CSCS ortamın uygun hacimde ekleyin. 1s daha uzun süre buz üzerinde hücre süspansiyonu tutmak ve kaplama için önce iyice karışık etmeyin.
   2. Orta buharlaşmasını en aza indirmek için, nemlendirme için 24 oyuklu plaka ilk ve son satır 1X PBS içinde 500 ul ekle. Tümör küre orta 1 ml (2.000 hücre / ml) içinde oyuk başına 2000 hücre yoğunluğunda, ultra düşük bağlanma hücreleri plakalara hücreleri tohumu.
      Not: tümör tipleri arasında değişebilir, tümör küre oluşumu deneyleri için kullanılan hücre sayısı.
   3. Aracın (negatif kontrol) ile ayrılmış her tedaviden 4 kuyu, metformin, örneğin., 3 mM ile en az 4 kuyu tedavi edin. Pl37 ° C'ye ayarlanmış bir inkübatör hücrelerin As ve bir hafta boyunca% 5 _CO2 ile hücreleri kaynağı.
      NOT: Orta tümör küre rahatsız oluşumunu sağlamak için değiştirilmemesi gerektiğini, ancak kültür ortamında stabil değil gibi günlük bazda büyüme faktörleri ile tepesinde olabilir.
   4. Her gün tedavi bölümlerinin her birine metformin ya da araç, örneğin., 3 mM ekleyin. Daha büyük yapılar (Şekil 2) sayımı için sağlayan otomatik bir hücre sayacı kullanılarak 5 ve / veya 7 gün sonra oluşan tümör küreler sayısını değerlendirmek.
      Not: sırasıyla, -, - (120 um 80), en az 40 um olan, sadece tümörlü küreler dikkate alınmalıdır ve küçük olarak kategorize edilebilir (40 80 um) ya da büyük. Sonuçlar (örneğin, 2,000 hücre) tohumlanmış hücrelerinin ilk sayısına bölünmesiyle elde edilen tümör kürelerin yüzdesi olarak tasvir edilebilir.
3. Birinci Nesil Tümör Küreler seri Pasajlanması
   1. Kuluçkalamadan 7 gün sonra, bir 40 mikron hücre süzgeci kullanılarak tümör küreler hasat ve oda sıcaklığında 900 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj.
   2. Tripsin kullanılarak tek hücre tümör kürelerin pelet ayrıştırmaları, ve daha sonra yukarıda tarif edildiği gibi başka bir 7 gün boyunca (2.2) yeniden elde edilen tek bir hücre süspansiyonu hücreleri genişletme.

3. Metabolizma Analizi (ROS üretimi ve Oksijen Tüketimi)

1. ROS üretimi
   1. Bu ROS tespiti için bir, uygun fiyatlı, hızlı ve yaygın olarak kullanılan sonda olduğundan bu protokolde, ROS üretimini ölçmek için bir örnek olarak karboksi-DCFDA kullandık. Bununla birlikte, bu deney için kullanılabilecek çeşitli başka problar ve yöntemler bulunmaktadır.
   2. Zaman ayrılan miktar için 2.2 açıklandığı gibi metformin ile tümör küreler davranın. Tedavinin sonunda, 40 mikron hücre süzgeci kullanılarak hasat tümör küreler, 5 dakika boyunca 900 x g'de santrifüj hücreleri ve tryps 1 ml pelletiniiçinde. 37 ° C'de 20 dakika süreyle inkübe edin.
   3. Hücreler singularized sonra, 900 xg'de santrifüj ve 2.5 uM karboksi-DCFDA içeren HBSS hücreleri tekrar süspansiyon. Karanlıkta 37 ° C sıcaklıkta 20 dakika boyunca inkübe hücreleri.
   4. Karboksi-DCFDA fotoğraf okside yalancı pozitif sonuç veren olabilir gibi akış sitometri analizine önce ışıktan lekeli hücreleri koruyan. Analize kadar buz üzerinde tüpler yerleştirin.
      Not: (. Ör. 488nm, Em 520 nm) reaktif oksijen ve azot türlerinin çeşitli reaksiyon FL1 tespit edildikten sonra karboksi-DCFDA floresan.
2. Oksijen Tüketimi Ölçümü
   1. Bu protokol için, bir örnek olarak, Denizatı Biosciences'den elde Ekstraselüler Akı Analyzer sistemi kullanacak. Kat, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca bir hücre ve doku yapıştırıcı 22.4 ug / ml solüsyonu ile, istenen hücre kültürü plakası. Hücrelerin ekim öncesi 3 kez - su ile 2 kuyu durulayın.
   2. Tedavi sonunda, hasat tümör küre 4 kullanılarak0 um hücre filtresi, santrifüj, 5 dakika boyunca 900 x g'de hücreleri ve tripsin 1 ml pelletini. 37 ° C'de 20 dakika süreyle inkübe edin.
   3. (150 ul son hacim), Sac /, bir 96 yuvalı plaka için 30,000 hücre yoğunluğunda hücre kültürü plakasının hücreleri singularized. 8 mM glikoz ve 2 mM sodyum piruvat içeren oksijen tüketimi deney ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
   4. 100 xg ulaşılıncaya kadar kuyuların spin santrifüj kuyunun dibinde hücreleri Santrifüj ve daha sonra fren kapalı olan santrifüj durmasına izin. Plaka yönünü tersine çevirmek ve işlemi tekrarlayın. 30 dakika boyunca _CO2 ilavesi olmaksızın 37 ° C inkübatör plaka aktarın.
   5. Bu arada, deney için kartuşu hazırlayın. Her iyi yüklemek için 4 farklı enjektörler (25 ul / port) vardır:
      1. Liman A: metformin. Içinde 3 mM nihai konsantrasyon elde etmek için, 175 olacak nihai hacim olarak 8x çözeltisi (24 mM) hazırlanmasıul bağlantı noktası A'ya enjeksiyonundan sonra
      2. Liman B: metformin. 3 mM ekleyin ve iyice 6 mM'lik bir son konsantrasyon elde etmek için, bağlantı noktası B'ye enjeksiyonundan sonra 200 ul olacak nihai hacim olarak 9 x çözeltisi (27 mM) hazırlanması
      3. Liman C: metformin. 3 mM ekleyin ve iyice 9 mM nihai konsantrasyon elde etmek için, bağlantı noktası C arasında, enjeksiyondan sonra 225 ul olacak nihai hacim olarak 10 kat çözeltisi (30 mM) hazırlanması
      4. Port D: rotenone 11 uM, kuyu (11x) nihai konsantrasyon olarak 1 mikrona elde etmek. Not: rotenone tamamen herhangi bir kalıntı mitokondriyal aktivitesini inhibe eder.
   6. Kartuşu kalibre ve hücre kültürü plakasını yükleyin. Karıştırma ve ölçüm standart protokolü ile tahlil gerçekleştirin.
   7. (% 100 olarak ayarlanmış) rotenone elde edilen inhibisyon yüzdesi olarak metformin ile elde edilen toplam mitokondriyal solunumun inhibisyon yüzdesi hesaplanır.

4.İmmün Farelerde İnsan Pankreas Kanseri için Xenograftlarında Modeli

NOT: Sipariş deneyler ³³ için böyle NOD-SCID, SCID-Bej veya NSG olarak dişi atimik çıplak ya da diğer, daha immün sistemi baskılanmış fare modellerinin yeterli sayıda. Deneyden önce tüm cerrahi aletler Otoklav ve onları kullanımdan önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Deri altı tümörleri için biz 8 tümörlerin toplam kanadını başına bir tümörü olan koşul başına 4 fare az kullanılır.

1. Xenograftlarında Nakli
   1. İnsan pankreas kanseri doku örneklerinde tümör parçalarını hazırlayın. Petri kabı içine tümör aktarın ve doku tutmak için bir neşter ve forseps kullanarak (~ 8 mm ^3, çapı 2 mm) küçük parçalar halinde doku teşrih. Jelatinimsi bir protein karışımı, elde edilen çözelti içine parçaları Dip buz üzerinde tutuldu.
   2. % 3 isofluorane veya diğer inhalatif veya enjeksiyon anestezikler - 1 kullanarak fareleri anestezisi.
      NOT: Herhangi bir cerrahi proc başlamadan önceedure, fareler tamamen karın cildi uyararak bilincini kaybetti ya da kıymık forseps bir çift ile tows emin olun. Kuruluğunu önlemek için göz merhemi sürün.
   3. Anestezi etkisi almıştır kez antiseptik etanol içeren cilt ile farelerin arkasını silin. Buprenorfini (0.05 mg / kg BW) önce post-operatif analjezi sağlamak için ameliyat uygulayınız.
   4. 0.7 yapmak forseps geri cilt kaldırın - steril mikro makas ile 1.0 cm uzunluğunda bir kesi ve daha sonra açık açık bir hastada elde edilen pankreas kanseri dokusu bir parça sokulduğu küçük bir deri altı cep, (~ 8 mm ³⁾ hazırlanması.
   5. 2 cilt zımba - 1 ile yara kapatın. 7 gün sonra bunları çıkarın. Kafeslerine fareler dönün ve tekrar tam olarak aktif olana kadar bir ısıtma yastığı veya bir ısıtma lambası altında saklayın.
   6. Tümör implantasyonu sonrası hunche, tümör büyümesi ve kırışık kürk morbidite kaynaklanan genel işaretler için en az iki haftalık fareler izleyecekd duruş ve hareketsizlik.
   7. Tümörler, 200 ^mm3'lük bir ortalama boyuta ulaştığında fareler, ilgili tedaviler için randomize edilmiştir. Ip enjeksiyonları (150 mg / kg BW) ile veya benzer tedavi etkileri ile içme suyu (150 mg / kg BW) ile günlük araç veya metformin yönetme.
   8. Bir kumpas kullanarak tümör yükünü Monitör ve tümör haftada bir kez hacmi (tümör hacminin ölçümü = genişliği × nefes × 1/2 uzunluk) hesaplayın.
   9. Tümörler çapı 1 cm ulaşmış ya da yukarıda belirtildiği gibi fareler şiddetli ağrı veya hastalık herhangi bir belirti gösteren başladıktan sonra fareler Kurban.

Sonuçlar

Metformin seçerek Pankreas CSCS Hedefler

Biz ilk CSCS in vitro kendini yenileme kapasitesine metformin tedavisinin fonksiyonel etkilerini inceledik. Bu amaçla, ameliyat sırasında rezeke PDAC dokulardan izole edilen primer insan pankreas kanseri hücreleri kullanılarak küre oluşumu deney gerçekleştirilmiştir. Biz metformin kuvvetle oluşan küreler (Şekil 1A) boyutunu azaldığını gözlemledik. Bu sadece CSCS için zenginleştirilmiş olarak hala alanlarda bulunan hücrelerin büyük bir kısmını temsil eden CSC progeny'lerinden, genişleme inhibe ederek büyük olasılıkla oldu. Nitekim, uzun küreler olacak daha farklılaşmış progenlerinin daha kapsamlı genişleme Pasajlanması olmadan kültür. Bu nedenle önemli ölçüde C kendini yenileme kapasitesi güçlü inhibisyonunu gösteren doza bağımlı bir şekilde meydana gelen, aslında kendi boyutuna bakılmaksızın oluşturulan kürelerin sayısını azaltmak için, metformin bulunduSC'ler (veriler gösterilmemiştir). Biz 3 mM'de bu metformin anlamlı (Şekil 1B) oluşan kürelerin sayısı azaldı bulundu. Daha sıkı CSCS kendini yenileme kapasitesine metforminin uzun vadeli etkilerini incelemek amacıyla, biz sonradan ikincil ve üçüncül küreler haline getirilir birincil küreler pasajlanmağa. Sadece primer küreler metformin ile muamele edilmiş olmasına rağmen, ikinci ve üçüncü geçitlerde küreler oluşumu büyük ölçüde ve giderek metformin gerçekten geri dönüşümsüz CSCS (Şekil 1C) çoğunluğu ortadan kaldırmış karıştığı, indirgenmiştir. Böylece, veri primer pankreatik CSCS kendini yenileme kapasitesine metformin önemli tedavi edici etkiler göstermiştir ve böylece daha fazla mekanik yanı sıra in vivo çalışmalar yapmak için bizi teşvik etti.

Metformin Mitokondriyal Oksijen Tüketimi engeller ve ROS Üretim İndükler

Metformi yanaN, kısmen kompleks I aktivitesini inhibe ederek mitokondriyal zehir olarak hareket gösterilmiştir, bir sonraki küre türetilmiş hücrelerde hücresel oksijen tüketimi metformin akut etkilerini inceledik. Bu amaçla, iki temsili primer PDAC tümörlerinden türetilmiş hücreler seçilir ve 3 mM metformin (üç enjeksiyon) ve 1 uM rotenone (bir enjeksiyon) sıralı enjeksiyonunun ardından zaman içinde oksijen tüketimi ölçülmüştür. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, metformin enjeksiyonu farklı tümörlere arasında önemli farklılık, oksijen tüketiminde de hızlı ve doza bağlı bir azalmaya neden. Tamamen mitokondriyal oksijen tüketimini inhibe edebilen rotenon, I inhibitörü güçlü bir kompleks, enjekte edilerek, metformin işlenmesi üzerine kalıntı mitokondriyal aktivite hesaplanır. Kapasiteli korelasyon mitokondriyal oksijen tüketimi açısından metformin duyarlılık populasyona arasında ortalama bir değiştirmesi olarak tarif ROS üretimini indüklediğiKolayca (Şekil 2B, sağ panel) ölçülebilir metformin tedavisi (Şekil 2B, sol panel), sonra lation. Beklendiği gibi, oksijen tüketimi, inhibisyona en duyarlı olan primer hücreler de metformin tedavisi üzerine ROS üretiminin güçlü bir artış göstermiştir. Bu nedenle, bu metabolik in vitro deneyler, bir sonraki mitokondriyal ROS üretiminin artması ve apoptoz indüksiyonu, sonunda sonuçlanır mitokondriyal fonksiyon bağımlılığını inhibe ederek bu metformin hedefleri CSCS göstermektedir.

Metformin kabinleri PDAC ilerlemesinde Vivo

Biz nihayet PDAC farklı hastalardan elde edilen doku xenografts kullanılarak in vivo metformin etkilerini inceledi. Bu, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, metformin ile tedavi edilen farelerde, tümör ilerlemesinde önemli bir azalma gözlenmiştir, fakat hiçbir zaman tam tümörler DISAppeared (Şekil 3). Daha sonra, uzun süreli izlem tüm tümörlerin sırasında, sonunda tedavinin erken fazını kalan hücrelerin metformin direncini düşündüren nüks. Bununla birlikte, metformin, tek bir madde olarak uygulandığı zaman bile, önemli ölçüde tüm fareler hayatta kalma genişletilmiş.

Şekil 1. metformin seçici CSCS Hedefleri. (A) metformin kürelerin boyutunu azaltmıştır. Kürelerin Örnek resim 7 gün sonra (sağ panel) için metformin belirtilen dozlarda ile muamele edildikten sonra elde edildi. Bilyeler (n≥6) (sol panel) miktarının, abscissas ekseni içinde belirtilen sayılar, tek tek tümör temsil etmektedir. (B) Apsislerdeki 7 gün (n≥6), belirtilen numaralar için varlığı veya metformin yokluğunda Küre formasyonu kapasitesieksen bireysel tümör temsil etmektedir. (C) primer pankreas kanser hücrelerinin ikincil ve üçüncül alanlarda CSC kendini yenileme kapasitesinin Temsilcisi grafiği. Küreler sadece 7 gün olmak üzere toplam ilk nesil küre oluşumu sırasında tedavi edildi (n = 6). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2. Metformin Tedavisi İnhibe Eder Oksijen Tüketimi ve İndükler ROS üretimi. (A) metformin ilave küre kökenli hücrelerin oksijen tüketimini (OCR) inhibe eder. İki farklı PDAC sekonder küreler metformin ile muamele edildi ve OCR değişiklik hücre dışı akı analizi ile ölçülmüştür. Rotenone enjeksiyonu, toplam mitokondriyal OCR tüketimi için bir kontrol olarak kullanıldı.X-ekseni her kuyuya protein içeriği ile normalize oksijen / saat pmol oksijen tüketim hızını temsil eder. A (b) 'PDAC küre metformin ile 8 saat süre ile muamele edildi ve ROS üretimi karboksi-DCFDA kullanılarak akış sitometrisi ile değerlendirildi. Araziler sitometri Sol, temsili akışı. Doğru, üç bağımsız deneyler gelen verilerin özeti. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3. In Vivo Metformin Stalls PDAC İlerleme. İki farklı PDAC ksenogref dokular immün sistemi baskılanmış farelere implante edildi ve ilk tümör almak doğrulandı sonra tedaviye tahsis edildi. Fareler, metformin (Met) ile muamele içme suyuna ilave edildi (150 mg / kg vücut Weight; günde su tüketimi) 5 ml dayanarak. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Birçok tümörler için CSC kavramının ortaya çıkışı ve sonraki doğrulama, ilaç geliştirme alanında daha etkin kanser tedavileri geliştirmek ve daha sonra hastalık nüks riskini azaltmak için potansiyeli olan, yeni bir ivme kazanmıştır. Ancak, CSC alan anlayışı CSC Kalkış ve yayılma ve tümör mimarisini şekillendiren ve metastaz teşvik rollerinden açısından elde edilecek bir erken devlet ve daha fazla ihtiyaçları halen.

Bu bağlamda, tekrarlanabilir ve anlamlı CSC testlerin kullanılması yanı sıra elde edilen verilerin yorumlanması bilinçli CSC biyoloji anlayışımızı ilerletmek için önemli bir bileşeni temsil eder. Birçok biyolojik açılardan, küre oluşumu son derece değerli bir tahlil olarak ortaya çıkmıştır; yine de kullanıcıların düzgün bir şekilde deney sonuçlarını yorumlamak için kendi sınırlarının farkında olmalıdır. Önemli bir yönü bile küre forma değerlendirilmesi önce dikkateTaze bir hastada elde edilen örneklerde elde edilen sonuçları ortaya kanseri hücre çizgileri elde edilenlerden önemli ölçüde farklı olabilir çünkü tion veriler, incelenmiş numunenin çıkış noktasıdır.

Klasik küre oluşum ^analizleri, ultra-bağlanma plakalar içinde klonal yoğunlukta tohum hücreleri ve epidermal büyüme faktörü mevcudiyetinde (EGF) ve / veya zenginleştirilmiş bazik fibroblast büyüme faktörünün (b-FGF) küre oluşumunu değerlendirmek ama serum içermeyen aracı madde ²¹ barındırır ^34. kültür ortamı bileşimi de dikkate alınması gereken önemli bir konudur. Bizim deneyim biz serum yokluğunda B27, bFGF ve glutamin içeren DMEM / F12 farklılaşmamış koşullarda CSC, büyümek genişletmek ve korumak için optimal ortam olduğunu öğrendim. Biz bu kültür durumuna (orta ve süspansiyon) hücreler (CD133 +, CD44 + ve CD24 + dahil) kanser kök hücre belirteçleri yüksek miktarda ifade ve (CK farklılaşma ilişkili proteinleri ifade etmezler bulundu-20 Ve CK-19).

Bu tahliller için temel varsayım biri her bir küre yani, bir küre, bir tek kök hücre genişlemesi sonucu, klonal olmasıdır. Ancak, küreler düşük ekim yoğunluğu ^35, hatta sigorta eğilimli dinamik yapılar özünde vardır. Hücreleri Kaplama protokolde önemli bir adımdır ve kesinlikle toplama sorunu aşmak olabilir iyi bir hücrenin / yoğunluğudur. Ancak daha da ileriye dönük kriteri progenitörleri, bu düzenli, düşük intrinsik küre oluşum aktiviteleri için çok düşük bir küre oluşumu ile sonuçlanır ve aynı zamanda seyrelme etkisi nedeniyle sınırlı otokrin uyarılmasına bağlanabilir. Bizim deneyim biz kaplama hücrelerin sadece% 30 küreler oluşturmak mümkün olduğunu gözlemlemiştir. Biz tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için iyi en az 100 hücre / kullanmanızı öneririz.

Büyüme CSC diğer kültür yöntemleri m göre, örneğin, bir katı ya da yarı katı 3D kültürleri (dayanmaktadıratrigel, kolajen ya da metilselüloz). Bu yöntemler, hücre hareketliliği ve daha sonra hücre toplanmasını ³⁶ sınırlamak için kullanılmıştır. Ancak, bu matrislerin her birinin kendi sınırlamaları taşımaktadır. Örneğin, matrigel çözünebilir bodrum Engelbreth-Holm-Swan (EHS) izole zar tümördür ve özü birçok dokuda bulunan kompleks hücre dışı tümör ortamını andıran rağmen, genellikle mekanik işler birden fazla veya daha az tanımlanmış büyüme faktörleri içermiyor çok zor özgü düzenleyici elemanları çalışmaları. Dikkate başka nokta küre oluşturan kapasitesini ve kök hücre fonksiyonları değiştirilebilir terimler ³⁴ olmamasıdır. Bazı kök ve projenitör hücreleri, in vivo olarak, kök / progenitör fonksiyonu dahil etmez, in vitro olarak küreler üretmek için bir küre-oluşturucu özelliği ^37, başarısızlık sergiledikleri gösterilmiş olmasına rağmen. Örneğin, sessiz kök hücreler sadece tarafından sağlanan dışı ipuçlarına yanıt vermeyebilirBu in vitro kültür koşullarında seçilir. Böylece, in vitro ve tercihen seri Pasajlanması sırasında saflaştırılmış hücre popülasyonlarının, in vivo kendini yenileme kapasitesi, uzun vadeli, kanıtlamak ya da kök hücre fonksiyonunu çürütmek için değerlendirilmelidir. Bu bağlamda, ileriye dönük ve aynı zamanda kök ve progenitör hücrelerin farklı kesimlerinden yaymak için yeteneği küre oluşturan testinin önemli bir yönüdür ve CSC alan için son derece değerlidir, bu testte vermektedir; sürece sınırlamaları elde edilen verilerin yorumlanması için akılda tutulmalıdır gibidir.

Küre oluşturan deneyleri yaygın retrospektif in vitro tek hücre düzeyinde kendini yenileme ve farklılaşma kapasiteleri dayalı kök hücreleri tanımlamak için kullanılmıştır. in vivo niş potansiyel kök hücrelerin izole edilmesini ve bunların soyu izin işaretlerinin bulunması saflaştırılmış popülasyonlarının fonksiyonel özellikleri tanımlanmasına izin verir. cküre oluşumu testinin ombination ve FACS katı doku hücreleri izole veya kültürde PDAC belirli alt popülasyonlar zenginleştirmek için başarılı bir stratejidir. Orijinal tümör heterojenitesini yansıtan kendini yenileme, farklılaştırmak ve bir tümör başlatmak: Örneğin, EpCAM, CD24 ve CD44 eşzamanlı ifadesi mümkün CSCS gösteren bir alt tanımlar. Hermann et al. CD133 + hücreleri artar çoğalma kapasitesi sahip ve CSC ¹⁵ özellikleri olduğunu gösterdi. Diğer belirteçler CSCS karakterizasyonu için kullanılmıştır: ALDH- 1 (aldehit dehidrojenaz-1) ifadesi, pankreas kanseri ³⁸ derece tümörijenik hücreler ile ilişkilidir; DNA boya Hoechst 33342 dışlamak mümkün hücreler adlı yan nüfus (SP) hücreleri, tümörleri ³⁹ başlatmak için sertifikalı kapasitesine sahiptir. Son zamanlarda, bir alt hücresel otofloresan bölmesi farklı tümör tipleri üzerinde özel bir CSC özellikleri ile insan hücrelerinden farklı bir popülasyonunu karakterize gösterdiBu markerlerin yok seçici CSCS saf bir nüfus karakterize görünse de hücrelerin daha rafine popülasyonları saflaştırmak ^40., Belirteçlerin daha karmaşık kombinasyonları FACS için kullanılabilir olması gerekir.

Birçok soru hala tümörlerin kökeni, ilerlemesi ve ilaç direnci CSCS kesin rolü hakkında kalır. Örneğin, tek bir CSC bir tümör başlatır ve nasıl tanımlamak için klonal evrim sorusunu çözmek için tek yol, hastalığın farklı evrelerinde hasta örnekleri analiz ve özellikle tedavi sırasında ve sonrasında CSCS numaralarını takip etmek olabilir. Bu sorulara cevap, biz katı tümörlerde CSCS bilgimizin anlamlı ilerleme ve sonuçta tümör ilerlemesi ve nüks önlemek için ilaç tedavilerine gelişebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Counting Chamber/Hemocytometer	Hausser Scientific Co	3200
CASY Cell Counter and Analyzer for proliferation and viability measurement	Roche Innovatis	AG CASY Model TTC 45,60,150 μm
GentleMACS Dissociator	Miltenyi Co	130-093-235
GentleMACS C Tubes	Miltenyi Co	130-093-237
24-well Ultra-low Attachment Plates	Corning	3474
100-mm tissue culture dishes	BD Falcon	353803
Cell strainer	BD Falcon	352350
15-ml polypropylene conical tube	BD Falcon	352097
50-ml polypropylene conical tube	BD Falcon	352070
1.5 ml sterile tubes	Eppendorf	0030 120.086
50 ml centrifuge tubes	Corning	430828
Sterile petri dishes, 10 cm dishes	Corning	353003
26 G needles	BD Falcon	300600
100 ul Hamilton Syringe	Hamilton Syringe Co	81075
Collagenase type IV	Stem Cell Technologies	7909
RPMI Medium 1640	Life technologies	11875-085
Penicillin/Streptomycin solution, 100X	Life technologies	SV30010
Metformin	Sigma	D150959-5G
L-glutamine, 200 mM, 100X	Life technologies	25030-081
D-Glucose	Sigma	G8270
100mM Sodium Pyruvate solution	Life technologies	11360-070
Seahorse Assay medium	Seahorse Bioscience	100965-000
BD Cell-TAK Cell and Tissue adhesive	BD Biosciences	354240
Trypsin solution, 0.05%	Life technologies	25300054
B27 Supplement 50x	Life technologies	17504-044
Basic Fibroblast Growth Factor	Sigma	F0291
Bovine Serum Albumin	Sigma	A9576
Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12	Sigma	D8437
Sterile 1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma	D8537
Trypan Blue	Life technologies	15250-061
Carboxy-DCFDA(5-(and-6)-Carboxy-2',7'-DichlorofluoresceinDiacetate)	Life technologies	C-369
Rotenone	Sigma	R8875
Ethanol 70% (vol/vol)	Sigma	459844
Isofluorane	IsoVet, Braun	571105.8
Matrigel	BD Biosciences	35620
Sterile Cotton tipped applicator	Puritan medical
XF96e FluxPak with cell plates, calibrant and cartridges	Seahorse Bioscience	102416-100
XF96e Extracellular Flux analyzer	Seahorse Bioscience
Incubator with CO2 input
Micro scissors
Curved forceps
Splinter forceps
Caliper