Батарея моторных испытаний в неонатальных мышей модели церебральным параличом

Резюме

Presented is a concise battery of mouse neonatal motor tests. Using these tests, neonatal motor deficits can be demonstrated in a variety of neonatal motor disorders. By having a standardized set of tests, results from different studies can be compared, allowing for better and accurate reporting between groups.

Аннотация

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, standardized battery of neonatal mouse motor tests. These tests can validate injury or disease models, determine treatment efficacy and/or assess motor behaviors in new transgenic strains. This paper presents a series of neonatal motor tests to evaluate general motor function, including ambulation, hindlimb foot angle, surface righting, negative geotaxis, front- and hindlimb suspension, grasping reflex, four limb grip strength and cliff aversion. Mice between the ages of post-natal day 2 to 14 can be used. In addition, these tests can be used for a wide range of neurological and neuromuscular pathologies, including cerebral palsy, hypoxic-ischemic encephalopathy, traumatic brain injury, spinal cord injury, neurodegenerative diseases, and neuromuscular disorders. These tests can also be used to determine the effects of pharmacological agents, as well as other types of therapeutic interventions. In this paper, motor deficits were evaluated in a novel neonatal mouse model of cerebral palsy that combines hypoxia, ischemia and inflammation. Forty-eight hours after injury, five tests out of the nine showed significant motor deficits: ambulation, hindlimb angle, hindlimb suspension, four limb grip strength, and grasping reflex. These tests revealed weakness in the hindlimbs, as well as fine motor skills such as grasping, which are similar to the motor deficits seen in human cerebral palsy patients.

Введение

Разработка новых моделей детской травмы или болезни с помощью грызуны часто затруднено из-за удивительной способности крыс и мышей, чтобы быстро оправиться от неврологического повреждения. Поэтому для того, чтобы подтвердить любую новую модель педиатрической заболевания, тщательного изучения клеточных и молекулярных изменений должны идти рука об руку с поведенческими последствиями. Во многих отношениях, функциональное поведенческая восстановление может быть более важным, чем лежащих в основе клеточных изменений с точки зрения терапевтического или трансляционной релевантности. Как исследователи узнать больше о травмы у взрослых и новорожденных, то ясно, что их ответы очень разные, и не могут быть экстраполированы между ними. Например, неонатальные мыши обнаруживают различные уровни фактора роста нервов, мозгового нейротрофического фактора, нейротрофином-3 и глиальной клеточной линии нейротрофического фактора после повреждения спинного мозга ^1,2. Кроме того, новорожденные имеют значительную утечку Гематоэнцефалический барьер после инсульта ^3, Demonstrate корковой нейрон перегруппировку после травмы периферических нервов ^4, и имеют замедленное или замедляли астроглиоза после повреждения спинного мозга и гипоксии-ишемии ^5,6. Поэтому важно , чтобы поступательные педиатрические исследования используют онтогенетически эквивалентные модели , и что эти модели оцениваются как для клеточных молекулярных изменений / и соответствующих возрасту поведенческих тестов.

Церебральным параличом (CP) представляет собой расстройство двигатель, который затрагивает 3: 1000 живорожденных в год (NIH). У детей с СР проявлять ряд симптомов и сопутствующих заболеваний, в зависимости от тяжести заболевания. Трудности с движением и координации являются наиболее общие признаки, наряду с задержками в достижении моторных вех развития. Другие признаки включают ненормальное тонус мышц (либо увеличивать или уменьшать), уменьшенный мелкую моторику, трудности при ходьбе, чрезмерное слюнотечение и глотания, и задержки речи (NIH). Основная причина CP, как полагают,недостаток кислорода и / или притока крови к мозгу во время предварительного или перипартальной периода, или до одного года после родов. Кроме того, воспаление теперь полагают, является ключевым компонентом в развитии СР.

В большинстве случаев СР связаны с белым повреждением вещества вокруг желудочков, известный как перивентрикулярном лейкомаляции (ПВЛ). Это неврологическое отличительным признаком предполагает, что начальная обида приводит к СР происходит в период развития мозга, когда олигодендроциты наиболее уязвимы для оскорблений. Период быстрого роста олигодендроцитов в организме человека, а также период, когда олигодендроциты являются наиболее восприимчивы к травмам, составляет от 24 - 32 недель гестации. В грызуна, эквивалентный период постнатальные дни 2 - 7 ^7, и когда СР индуцируется в этой модели.

Неонатальный мышиную модель CP, которая была использована для проведения испытаний, описанных здесь, сочетает в себе гипоксию и ишемию с воспалением, чтобы создать INJURY, что лучше имитирует нейродегенеративные видел в человеческом CP. Эта модель рассматривает некоторые из основных недостатков, выявленных в других животных моделях CP, которые испытывают недостаток различных дефицитов моторных, что напоминает пациентов CP человека, а также отчетливый белый повреждение вещества. Предыдущие исследования соавтора с использованием той же модели показали , что добавление воспаления усиливает повреждение белого вещества, таким образом , лучше эмулировать PVL видели у детей с ДЦП ^8. Основываясь на предыдущих данных, этот документ представляет собой всеобъемлющую батарею неонатальных испытаний двигателя для того, чтобы оценить изменения в поведении двигателя по мере старения животных.

протокол

Примечание: Все операции на животных были проведены в соответствии с отделом Темпл университета улар и политики IACUC и процедур. C57BL / 6 плотин и кобели были приобретены у Charles River Laboratories и были размещены в садки с 12 ч циклом свет / темнота (свет на 7:00 - 19:00) со свободным доступом к пище и воде. гнездящихся пар производится плодовитостью от 5 - 10 щенков.

1. церебральным параличом Индукционная хирургия

1. Примечание: детский церебральный паралич был вызван использованием послеродового день (PND) 6 щенков мыши, как описано выше ^8,9 (http://www.jove.com/video/1951/mouse-models-of-periventricular-leukomalacia).
2. Поместите щенка в стеклянной миске на льду с лабораторией протирать, чтобы защитить кожу щенка. Проверьте наличие соответствующего анестезиологического плоскости стопы щепоткой и отсутствие движения. Перемещение щенка проложенном льда для хирургии.
3. Стерилизовать кожу щенка с использованием 70% этанола. При сухой, используйте # 11 стерильную хирургическую бла вде и сделать 1 см разрез в области шеи.
4. Использование стереоскопических операционного микроскопа, изолировать правой общей сонной артерии с небольшим крюком и прижигают с помощью портативного ручного cauterizer. Визуально подтверждают, что артерия окклюзии. Шам операция включает в себя визуализацию и выделение общей сонной артерии без прижигания.
5. Выровняйте кожу и закрыть с помощью шовного клея (н-бутил) Цианоакрилат.
6. Поместите щенка на C грелку 34 ^O в течение 30 мин , чтобы следить за спонтанного дыхания и нормального движения.
7. Возвращение щенка (ов) к плотине в течение 30 мин.
8. Поместите щенков на грелку или другого устройства , согревающей установлен на уровне 34 ^° С внутри гипоксия камеры , установленной на 6% кислорода в течение 35 мин. Кислород заменяется азотом. Тесно контролировать уровень камеры кислорода и температуры для получения стабильных результатов травмы.
9. Удалить щенкам из гипоксия камеры и вернуть их в грелку.
10. Внутрибрюшинно вводят lipopolyсахарид разводили в стерильном физиологическом растворе при концентрации 1 мкг / кг и вернуть детеныша к плотине. Sham инъекции являются инъекции только физиологический раствор.

2. Тесты Новорожденных Моторные

Примечание: На PND 8, 48 ч после индукции СР, щенками мыши проверяются на нейроповеденческого развития. Щенков тестируют в течение 4 ч блока в первой половине дня, чтобы исключить время дня различий в поведении. Детенышей удаляются из плотины не более чем на 15 мин, в то время, чтобы предотвратить быструю потерю тепла тела вопросов и голода / разделения. Кроме того, щенков разрешается отдыхать между тестами, так что максимальные усилия будут быть выявлены на каждом испытании. Основу неонатальных испытаний двигателя выполнен с использованием батареи Фокса тестов ^10,11 и адаптации Wahlsten по тестам Фокс ^12, а также НПРО-Считать и другое поведение публикаций (как отмечено в тексте для каждого теста). Батарея Фокса испытаний подходят для PND 2 - 21. Из испытаний Фокса, жидкое тестоу присутствующих здесь включает в себя: рефлекс выпрямления, хватательный рефлекс, отрицательные geotaxis (так называемый вертикальный кинопробы в батарее Фокса) и четыре конечности силы хвата (редактировался Фокс и Wahlsten в экран альпинистских тестов). Здесь, вставание, прочность на передние конечности, и прочность задних конечностей также испытываются, чтобы отличить рефлексивный поведение двигателя между мнимым и CP мыши мышат. Для устранения улучшений на тестирование из-за обучения, тесты были ограничены максимум 3 испытаний, где отмечено. Все другие испытания имели только одно исследование на одно животное.

1. Передвижение (Рисунок 1) (адаптировано из протокола крысы ^13):
   Примечание: Ползучая является поведение разработана в начале детеныша мыши между PND 0 - 5, после чего мышей начинают переходить к ходьбе, от 5 - 10 дней ^14. На PND 8, тест вставание воспользовался преимуществом этого переходного времени, конечно. Передвижение, однако, может быть забит в течение всей жизни мыши и может быть определено в любом возрасте.Поскольку не существует потенциал для обучения, тест вставание может быть повторен столько раз, сколько необходимо по ходу эксперимента.
   1. Место мышей в светлом корпусе, где мыши, которые видны сверху, а также сбоку. Используйте нежный подталкивании прикосновением хвост щенка, чтобы мотивировать щенка ходить.
   2. Оценка ходьбу в течение 3 мин, используя следующую шкалу: 0 = нет движения, 1 = кишит асимметричного движения конечностей, 2 = медленного ползания но симметричного движения конечностей и 3 = быстро ползет / ходьба.
      Примечание: Здесь, симметричное движение конечностей описывается где hindpaws отвечают frontpaws на каждом этапе, и каждый шаг плавно переходит к следующему шагу. Мышь отображения асимметричный движение конечностей имеет неустойчивый размещение лапой и переходы от одного шага к другому не являются гладкими.

Рисунок 1. Переход отОбход к ходьбе может быть Отличаясь Наблюдая за заднюю лапу, а также голова и хвост. (A) Во время ползать, вся спина лапу, от пальцев к пятке, касается земли , когда ambulating, как обозначено звездочкой (*). Взрослых ходьбе картина наблюдается , когда только пальцы ног и передней части задней лапы касаются земли (пятка поднята, deonoted на [**]). (B) Голова и хвост ползет мыши низко к земле. Голова начинает расти при переходе от ползания к ходьбе. Переход завершен , когда и голова и хвост подняты и только передняя часть задней лапы касается земли. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

2. Угол для ног задних конечностей (рисунок 2)
   Примечание: Существует очевидное изменение развития в позе задних конечностей, как Меморандумые созревает от ползания к ходьбе, где задние конечности располагаются под телом при ходьбе и угол между задних ног меньше, чем угол видели в ползет. Даже если угол задних конечностей нога меняется с течением времени, можно сравнить мыши щенков одного и того же возраста с различными заболеваниями или травмой. Аналогично испытанию способность к передвижению (3.1), не существует потенциал для обучения. Таким образом, тест угол задней конечности нога может быть повторен столько раз, сколько необходимо по ходу эксперимента.
   1. Либо в прозрачном ящике открытом поле или закрытом помещении, смонтировать видеокамеру снизу или сверху, соответственно, чтобы записать детеныша, как она движется по всему полю. Используйте нежный подталкивании прикосновением хвост щенка, чтобы мотивировать щенка ходить. Запись в течение двух минут.
   2. С помощью видеозаписи, измерения угла ножной щенкам, рисуя линию от конца пятки / голени до кончика самого длинного (среднего) пальца. принимать только измерение, когда щенок выполняет полный шагпо прямой и обе ноги плашмя на землю. Не проводить измерения в то время как щенок находится в неподвижном состоянии или в то время как щенок поворачивается.
   3. Мера от трех до пяти наборов углов стопы и вычислить средний угол для каждого детеныша испытания.

Рисунок 2. Угол для ног задних конечностей может быть использовано для определения походки ненормальности. Угол стопы может быть измерена с помощью нарисованной линии от середины пятки через средний ( самый длинный) цифрой. Раненые животные имеют больший угол стопы по сравнению с нормальным (см Представитель Результаты, Foot угол). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

3. Поверхность восстанавливающее (рисунок 3):
   Примечание: рефлекса выпрямления является способность двигателя для щенком мышь, чтобы иметь возможность перевернуть на ноги из положения лежа на спине. Средний возраст для рефлекса выпрямления появляться у грызунов НПР 5 с диапазоном от PND 1 -. 10 ¹⁵ Как этот тест рефлекс, нет никакого обучения компонент , и он может быть повторен в течение всего периода эксперимента.
   1. Поместите щенков на спине на хлопок листа или скамейке площадку и удерживать в нужном положении в течение 5 секунд.
   2. Отпустите щенкам и записать время, которое требуется щенку, чтобы вернуться в лежачем положении, а также направление выпрямления (влево или вправо). В общей сложности в одном мин дается для каждого испытания, если это необходимо.
   3. Повторить в общей сложности трех испытаний.

Рисунок 3. Поверхность восстанавливающее. Этот тест необходим контроль соединительных линий и может испытать для постуральной дисбалансов. Пациенты человека CP может иметь дефицит в их ядре.e.com/files/ftp_upload/53569/53569fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

4. Отрицательный Geotaxis (Рисунок 4)
   Примечание: Средний возраст для отрицательного geotaxis рефлекса появляться у грызунов PND 7 с диапазоном от PND 3 - 15 ¹⁵ Тест отрицательный geotaxis оценивает координацию движений у молодых мышей.. Мышей помещают лицевой стороной вниз по склону и, благодаря вестибулярных репликами тяжести, щенками повернуться лицом вверх по склону. Реакция на стимул, или такси, врожденное поведение.
   1. Поместите щенка с его головы указывая вниз на 45 ^о наклонной поверхности и удерживайте ее в течение 5 сек.
   2. Отпустите детеныша и записывать время и направление щенку поворачивается лицом вверх. Общее время тестирования составляет 2 мин.
   3. Повторить в общей сложности трех испытаний. Мыши, которые падают вниз по наклонной поверхности или не свою очередь, может быть повторно проверены, устранены, или дают нулевой балл.
      Примечание: Это решение лEFT к экзаменатору, а иногда щенками будет катиться вниз по наклонной поверхности из-за сонливости, а не слабости. После того, как принято решение о том, как забить щенков, которые падают вниз по наклонной поверхности, следует отметить, в методах и должны быть согласованы на протяжении тестирования всех субъектов.

Рисунок 4. Отрицательный Geotaxis. Двигатель и вестибулярный вход необходим для мыши , чтобы признать свою ориентацию на склоне и развернуться. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

5. Передняя подвеска конечностей (рисунок 5) ^16; адаптировано из ^{17, 18:}
   Примечание: подвеска передней конечности проверяет прочность передних конечностей крысят, в том числе руки и силы лапой. Tего тест не рекомендуется для щенков в возрасте до PND 10 ^15. Pups разрешается схватить провод натянут через стабильный объект и повесить на провод с обоими лапами. Область тестирования через проложенный зону. Тест может обнаружить правый / левый различия боковой силы. Изучение и отсутствие отрицательного подкрепления может привести к увеличению неучастия. Мыши сразу падают, когда выпустили или неспособность понять при размещении на проводе свидетельствуют о непричастности.
   1. Держите щенят крепко тела и дать им возможность понять провод с обеими передними лапами.
   2. Отпустите детеныша. С помощью таймера или секундомера, записывать общее время падать, а также лапа слабость.
      Примечание: лапа слабость определяется, если щенок последовательно падает из проволоки с одной лапе перед другим, а не выпуская из проволоки с обеих лап одновременно.
   3. Повторите тест в общей сложности три раза.

Рисунок 5. Передняя подвеска Лимб. Это испытание подвески вызывает напряжение в конечностями до мышечной усталости. При таком подходе исходная сила в конечностями установлены. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

6. Подвеска задних конечностей (рисунок 6):
   Примечание: Этот тест подвески определяет прочность задних конечностей. Это тест , разработанный специально для новорожденных и первоначально использовалась на животных между PND 2 - 12 ^19,20, но может быть адаптирована для мышей до PND 14. Этот тест может обнаружить правый / левый задней конечности различия прочности, а также нервно - мышечной функции. Стандартный 50 мл коническую используется, проложенный с лабораторными салфетками. Подобный тест подвески передней конечности, этот тест может быть изучено, особенно грехсе не существует негативное последствие к падению. Таким образом, увеличение неучастие, как видно на мышах падения, как только выпустили или отказ остаться при размещении на краю трубы, можно отметить.
   1. Используя 50 мл коническую, место щенком осторожно лицевой стороной вниз в трубу с ее задние ноги висели над краем.
   2. Отпустите детеныша. Обратите внимание на положение задних конечностей.
   3. Оценка осанки в соответствии со следующими критериями.
      Примечание: 4 балла указывает на нормальное разделение задних конечностей с хвостом поднятой; оценка 3 означает слабость очевидна и задние конечности ближе друг к другу, но они редко прикасаются друг к другу; 2 балла указывает на задние конечности расположены близко друг к другу и часто трогательная; 1 балл показывает слабость очевидна, и задние конечности почти всегда в сложенными положении с хвостом поднятой; оценка 0 указывает на постоянную обхватив из задних лап с хвостом опущенном или неспособности удерживать на трубке в течение какого-либо периода времени.
   4. Граф тянет, если это необходимо. Тянуть качеманьяков, когда щенок пытается поднять свое тело с помощью своих задних конечностей в подвешенном на стороне конической трубки.
   5. С помощью таймера или секундомера, записывать латентность падать.
   6. Повторить весь тест в трех экземплярах.

Рисунок 6. Подвеска задних конечностей. (А). Это испытание подвески вызывает напряжение в задних конечностей до усталости мышц. Базовый уровень прочности и позы в задних конечностей установлены. (B). Подсчет очков. Обратите внимание на приведенные выше цифры репрезентативных мышей , демонстрирующих возможный балл осанку. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

7. Возьмитесь Сила (рисунок 7):
   Примечание: Этот тест исследует лапу Strength всех четырех лапах одновременно. 16 × 18 стекловолокна экран провод используется. Средний возраст для грызуна , чтобы быть в состоянии понять горизонтальный экран является НПР 8 с диапазоном от PND 5 - 15 ¹⁵ Фокс использовали тест экрана по горизонтали на четыре конечности от PND 2 -.. 21 ¹⁰ Этот тест является модификацией стандартного горизонтального Тест экрана; здесь экран медленно поворачивается из горизонтального в вертикальное положение, чтобы бросить вызов схватывание всех четырех конечностей ^21; адаптировано из Корти S ^16. Если мышь держит на экран сетки, когда перевернутый на 180 °, запись латентность падать. Кроме того, обратите внимание на вес тела. Висячий импульс может быть вычислена как [вес (г) х задержки падения (сек)], отражающий силу, необходимую, чтобы противостоять гравитации.
   1. Используя кусок проволочной сетки, поместите щенка на экране. Дайте щенку, чтобы приспособиться к этой среде в течение примерно 5 секунд.
   2. Переверните экран медленно до 180 градусов. Записывают приблизительную Anglе экрана, когда щенок падает.
   3. Повторить в общей сложности трех испытаний и усреднить испытания.

Рисунок 7. Возьмитесь прочность. Мышей необходимы для поддержания мышечного напряжения во всех четырех конечностях , как гравитационные сила возрастает. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

8. Хватательный рефлекс (рисунок 8)
   ПРИМЕЧАНИЕ: хватательный рефлекс , как правило , появляется у грызунов на PND 7 с диапазоном от PND 3 - 15 ¹⁵ Каждую лапу проходят индивидуально, таким образом , тест может выявить фронт- или задних конечностей вопросы, а также вопросы односторонности.. Как это рефлекс, этот тест может повторяться до тех пор, пока не появится рефлекс. Он не склонен к обучению. В качестве важной оговоркой, этот тест не различает схватив силу, только способность, и должны быть проверены до 15-дневного возраста, когда малолетние мышей начинают осознавать за страха ответа.
   1. Держите мышь от шкирку, подобно тому, как щенком мыши осуществляется с помощью плотины. Это заставляет держать щенка, чтобы стать инстинктивно неподвижна и расслаблены, что позволяет для удобства тестирования.
   2. Инсульт каждая лапа детеныша с тупой, закругленный сторону лезвия бритвы.
   3. Проверьте каждую лапу по отдельности и записывать наличие или отсутствие хватания и оценка 1 очко за лапу, с которой мышь схватывает.
      Примечание: Подсчет очков правого предпочтения лапа 100% для правого предпочтения лапой, - - -100% для левого предпочтения лапой, 50% для обеих лап хватания, и 0% в течение не лап ОХВАТИТЬ. Уравнение для определения этих чисел [(правая лапа - левая лапа) / (правая лапа + левая лапа + обе лапы)] х 100%.

/53569/53569fig8.jpg "/>
Рисунок 8. хватательный рефлекс. Поскольку у новорожденных мышей не имеют сильный реакцию страха, этот тест строго определяет подошвенной / ладонной рефлекс. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

9. Клифф Отвращение (рисунок 9):
   Примечание: Клифф тесты неприятия рефлексы лабиринта, а также силы и координации и может быть использован для тестирования щенков от PND 1-14 ^22. Предварительно душистые коробку (ящик, где минимум 5 мышей было позволено свободно перемещаться) с плоской повышенной уступа используется и щенок помещается с цифрами только их передними лапами и их морды, расположенной над краем. Подсчет очков производится путем подсчета общего времени, которое требуется щенку отворачиваться от скалы и перемещать свои лапы и морду подальше от края. Если ответ не виден через 30 сек, испытание прекращают.Если щенок падает с края, одно дополнительное испытание может быть выполнено.
   1. Используя вид сбоку, поместите щенка на краю предварительно душистый коробки, убедившись в том, что передние лапы, цифры и морда являются единственными частями через край.
   2. Отпустите детеныша и начать таймер.
   3. После того, как морда и лапы были удалены от края, остановить время таймера и записи.
   4. Повторите тест в общей сложности 3 испытаний. Если щенок не двигается от скалы в течение 30 секунд, оценка не дается.
      Примечание: Определение щенку, является ли, не участвующее в сравнении с необесцененная оставлено на усмотрение экзаменатора. Высота скалы может быть скорректирована с учетом возраста щенка, чтобы обеспечить безопасность щенка. Меньшая высота может быть использован с черным "пол", чтобы эмулировать большую высоту.

Figurе 9. Клифф Отвращение. Вестибулярные дисбалансы измеряется с использованием теста скалы отвращение. Здесь глаза щенка все еще закрыты , так страх не движущим фактором отворачиваться от края скалы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

3. Статистическая значимость

1. С помощью статистического программного обеспечения анализа результатов. Экспресс данные в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (SEM). Тесты являются параметрическими и, таким образом, изучить данные, используя Т-тест анализа.
   Примечание: Эксперименты не были предназначены для проверки гендерных различий. Различия считаются статистически значимыми при р <0,05.

Результаты

Мыши были протестированы с Р7 (24 ч после операции) на Р13 (1 неделю после операции), с использованием различных мышей для каждой временной точки, так что обучение парадигму тестирования не была Поразительным переменной. Р8 был выбран в качестве репрезентативных результатов, как мыши показали наибольший дефицит в этот момент времени.

Переход от ползания к ходьбе задержится в CP неонатальной мышей

Пациенты человека CP имеют походка аномалий, начиная от схождения ходьбы до разрезана походки. В этой модели CP отображает походки дефицита похожи на людей, вставание оценивали. Мыши были забиты на походки симметрии и движения конечностей во время лапой прямой ходьбы. В 48 ч после операции (PND 8), CP мыши имели меньше движения симметричны лимбе и "ползет" походку по сравнению с их аналогами фиктивным (средний балл Ambulation: CP 1,083 ±0,6337, п = 12 против мнимого 1.639 ± 0.4859, п = 9; р <0,05, рисунок 10). На одну неделю, как СР и мнимые мышей перенесенных в ходьбе (данные не показаны).

Рисунок 10. CP Mouse Pups не передвигаться, а также Шамс. Sham мышей (черная полоса) имеют средний балл 1.639 ± 0.4859 (п = 9), имея в виду их амбулаторного развитие падает между асимметричной движение конечностей и медленным ползком. CP мышей (серая полоса) получают средний балл 1,083 ± 0.6337 (п = 12), то есть их способность к передвижению менее развит и как правило, имеют асимметричный движение конечностей. Данные выражены в виде среднего значения ± SEM; * Р <0,05. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Hindlimb ног Угол увеличивается в СР

В дополнение к передвижению, задних конечностей футов угол был оценен. Восемь-дневных щенков фиктивный мыши ходить с их hindpaws лицом вперед, по сравнению с мышами полунатурного, которые растопыренными hindpaws при ходьбе по прямой линии (рис 2, средний угол: CP 77,48 ± 9.848, п = 9, против фиктивным 54,54 ± 8,043, п = 11; р <0,0001, рисунок 11). Этот увеличенный угол коррелирует с походки нестабильности, в том, что щенкам необходимо увеличить угол их задних лап, чтобы стабилизировать их походку и помогать с балансом и координацией.

Рисунок 11. CP Mouse Pups Splay их Hindpaws при ходьбе. Мышей CP (черные столбики) имеют средний угол между их задних ног 77,48 ± 8.043 (п = 11), в то время как фиктивный мышей (серый б АРС) имеют средний угол 54,54 ± 9.848 (п = 9). Данные выражены в виде среднего значения ± SEM; **** Р <0,0001. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

CP Мыши не показывают , когда бюджетный дефицит поверхности восстанавливающее

Тест поверхности восстанавливающих был включен в некоторые пациенты CP имеют нарушенную контроль соединительных линий (Heyrman и др., 2013). Кроме того, вестибулярная система необходима для выявления потребности в восстанавливающих и есть вестибулярные дефицит в некоторых CP пациентов ^23. CP мыши не показывают значительного дефицита, когда восстанавливающее по сравнению с мнимым контролем (данные не показаны).

CP Мыши выполняют ту же , как Sham в отрицательном тестирования Geotaxis

т "ВОК: Keep-together.within-страницу =" 1 "> Отрицательный geotaxis используется для проверки двигательной координации у молодых щенков Мышей оспорены быть местом на спуске с наклонной поверхности Задержка или отказ сориентировать в гору может указывать на дефицит.. в координации, равновесия, или вестибулярный вход. CP мышей не обнаруживают дефициты, когда вызов с отрицательным geotaxis по сравнению с мнимым мышей (данные не показаны). Кроме того, CP мышей не показывали для того чтобы повернуть в одну сторону по сравнению с другой, когда Переориентация ,

Front-Limb подвески Тест подходит для мышей старше 10 дней

больных ПРС снижение мышечного тонуса и дефицит в тонких моторных навыков, таких как захватывая. Чтобы проверить слабость в этой модели мыши, мы использовали тест подвески передних конечностей. Кроме того, эта модель использует односторонние ишемического повреждения и односторонней Бытийность может быть определено с помощью этого теста подвески. Этот тестлучше для мышей старше 10 дней ^15. На 8 дней, через два дня после травмы, не было никаких существенных различий между СР и мнимого мышей (данные не показаны).

Прочность задних конечностей уменьшается в CP мышей

Пациенты человека CP часто нуждаются в фигурные скобки или вспомогательные устройства для ходьбы из-за отсутствия контроля двигателя и силы. Для того, чтобы сравнить CP модели грызуна для человека, прочность задних конечностей оценивали с помощью теста задних конечностей подвески. Когда приостановлено со стороны конической трубки, CP мышей показали задних конечностей слабость, о чем свидетельствует снижение висит счет (задних конечностей висит оценка: CP 3,468 ± 0,5561, п = 13, против фиктивным 3,891 ± 0,1329, п = 13; р < 0,05, Рисунок 12). Никаких различий не наблюдалось в задней конечности времени приостановки (данные не показаны). Таким образом, похоже на больных ХП человека, CP мышей демонстрируют hindlММБ (нога) слабость.

Рисунок 12. Sham Мыши немного , но значительно сильнее в их задних конечностей , чем CP мышей. На средний балл подвешивание 3.891 ± 0.1329 (п = 13), фиктивный мышей (черная полоса) показывают более разделение задних конечностей, и , следовательно , более сильную позицию задних конечностей, когда висит на краю трубы, чем CP мышей (серая полоса) со средним баллом подвешивание 3.468 ± 0.5561 (п = 13). Данные выражены в виде среднего значения ± SEM; * Р <0,05. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Возьмитесь Сила уменьшается CP Травма Этот

Схватив со всеми четырьмя лапами имеет важное значение для грызуна вусловия восхождения и перебегая неровной поверхности. Возьмитесь требует значительных устойчивой силы, а не ловкостью или линейной силы, главным образом , в цифры и лапками ^24. Мыши были обязаны держать их вес тела на перевернутом экране из проволочной сетки. CP мыши были не в состоянии поддерживать свою власть и эти мыши упали при значительно меньших углах (четыре конечности средний угол: CP 75,627 ± 24,48, п = 11, против фиктивным 96,57 ± 10.836, п = 9; р <0,05, рисунок 13). Эти данные показывают, что существует значительный дефицит силы захвата в CP мышей.

Рисунок 13. CP Мыши имеют более слабый захват , чем Шамс. Sham мышей (черная полоса) может ухватить к среднему перевернутого угла от 96,57 ± 10.836 (п = 9). CP мышей (серый бар) можно достичь только перевернутую угол 75.627 ± 24,48 (п = 11). Данные выражены в виде среднего значения ± SEM; * Р0; 0.05. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Хватательный рефлекс Дефициты Видимое в CP мышей

Наряду с грубыми дефицитов двигателя, мелкие движения двигателя также нарушается у пациентов CP ^25,26. Хватательный рефлекс у человека присутствует при рождении и исчезает около 5 - 6 месяцев. Тем не менее, изменения в хватательный рефлекс, такие как преувеличенной скорости или силы хватания, неспособности понять, или возрождение в хватательный рефлекс после 6-месячного возраста, все указывают на повреждение нервной системы. Для сравнения захватывая в модели СР, рефлексивные дефициты схватив были определены.

Через 48 ч после травмы, CP мышей демонстрируют снижение хватательный рефлекс (средний лапами схватилв 48 часов: CP 2,429 ± 0,9376, п = 14, против фиктивным 3,214 ± 0,8018, п = 14; р <0,05, рис , 14А). Был небольшой, но не значительное увеличение правого предпочтение лапы в передних лапах (данные не показаны). Был значительное предпочтение правой лапой в hindpaws (CP 75,0 ± 42,74, п = 14, против фальши 17,86 ± 54,09, п = 14; р <0,005, рис , 14Б). Через неделю после травмы, CP мышей показывают хватательные дефицит ( в среднем лапами хватался за 1 неделю: CP 2.75 ± 1.035, п = 8, против фальши 3,80 ± 0.6325, п = 10; р <0,05, рис 14C), без заметного предпочтения лапой ,

Рисунок 14. CP Мыши имеют захватывая дефицитов в Hindpaws, контралатеральной травмирован мозга региона. (А) 48 ч после травмы (PND 8), CP мышей (серая полоса) схватить палку с, в среднем меньше , чем лапами мнимого анимыLs (черная полоса). (B) CP мышей (серая полоса) отображать предпочтение захватывая с правой задней лапы (контралатеральной травмы) в отличие от использования левой задней лапы (ипсилатерального к травмам). Sham мышей (черная полоса) не показывать это право предпочтение лапу. Право предпочтение лапа рассчитывается как ([правую лапу - левая лапа] / [правую лапу + левую лапу + обе лапы] * 100) (C) Через одну неделю после травмы, CP мышей (серая полоса) до сих пор показывают захватывая дефицит по сравнению с. Шамс (черная полоса). Данные выражены в виде среднего значения ± SEM; * Р <0,05, ** р <0,005. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

CP Мыши отвернуть от края Во время Клифф Отвращение

Испытание скалы Неприятие опирается на присущие страх мышей, чтобы превратить AWAу с крутого обрыва и головой к безопасности. Хотя некоторые пациенты CP имеют вестибулярные трудности, а также нарушенное управление двигателем, мышей CP не показали каких-либо дефицита на этом тесте.

Обсуждение

Использование животных моделей для изучения заболеваний человека актуальна только при наличии совпадения между клеточной и молекулярной реакции между человеком и грызунами и что поведенческие тесты, проведенные имеют непосредственное отношение к человеческим симптомов. Одной из основных проблем, с изучением педиатрических заболеваний является то, что многие исследователи используют взрослых грызунов для создания модели, а также для взрослых грызунов поведенческой оценки, без учета различий в области развития, которые могут быть важны для процесса заболевания. Из - за этих проблем, важно , что исследования по использованию детской болезни не только соответствующая скорректированная развития временных точках (например, развитие человеческого потенциала ЦНС в возрасте 28 - 32 недель эквивалентно послеродового день 2 - 7 дней с грызунами) ^7, но и поведенческие тесты, которые будут исследовать соответствующий двигатель, сенсорными или рефлексивные поведения в области развития. Таким образом, как каждая новая модель заболевания у новорожденных развивается, то она должна быть тщательно протестированы, чтобы гарантировать, что клеточныйи поведенческие реакции обеспечит наиболее подходящие переводимые данные между грызунами и человеком.

Церебральный паралич является двигательным расстройством, которые сохраняются в зрелом возрасте. Одна из проблем со многими церебральным параличом моделей, доступных на сегодняшний день является отсутствие повторяемой, стандартизированное тестирование двигателя, который может коррелировать с дефицитом наблюдаются в педиатрических больных. В этой новой модели, которая сочетает в себе гипоксия, ишемия и воспаление в неонатальном мыши, двигательное поведение оценивали с помощью батареи тестов, специфичных для новорожденных мышей. Для того чтобы уменьшить субъективность и увеличить количественный отчетности, несколько тестов, которые были изменены, чтобы включать в себя очень специфический, но легко оценить меры, которые могут быть стандартизированы. Кроме того, в передней и задней конечности оценки могут быть выполнены по отдельности, и влево / вправо различия могут быть определены. Данная аккумуляторная батарея тестов является специфическим для новорожденных мышей до двух недель.

Эта модель демонстрирует CPТрудность в ходьбе (ходьбу, угол задних конечностей стопы), а также конечности специфические слабость (подвеска четыре конечности, подвеска задних конечностей), и дефициты в развитии рефлексов (хватательный рефлекс). Хотя в данном исследовании, был рассмотрен только один временной точки, эти дефициты могут быть отслежены в течение долгого времени.

Есть и другие батареи тестов , которые могут быть использованы на новорожденному, такие как батареи лисы испытаний или оценки Гейзер о Этапы развития ^15. Тем не менее, эти тесты сравнить новорожденного к взрослым, чьи ответы не могут быть одинаковыми, так как новорожденные все еще развивается. Батарея Фокса и Assement тесты Гейзер полагаются на наблюдательной субъективной информации с дихотомичной (да или нет) оценки, а не объективных данных (угол, поза на основе силы и т.д.). Из-за субъективности этих испытаний, многие ученые адаптировали, добавляют или удалены критерии, тем самым делая их результаты несравнимые с другими и пределИНГ полезность данных с точки зрения установления базового дефицита для конкретного заболевания или расстройства. Установив один набор стандартизированных тестов двигателя, которые являются качественными и специально разработаны для тестирования новорожденных, результаты отдельных исследовательских групп могут быть точно и достоверно сообщали и сравнивать.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	Charles River Laboratories	STRAIN CODE: 027	C57BL/6NCrl is the exact strain we use
Anesthesia Dish, PYREX™ Crystallizing Dish	Corning Life Sciences Glass	3140125	Capacity: 25.03 oz. (740ml); Dia. x H: 4.92 x 2.55 in. (125 x 65mm). However, any small round glass container will work. A 2 cup capacity pyrex food storage bowl with flat bottom will also work and is much cheaper (Pyrex model number: 6017399).
Covered lead ring	Fisher Scientific	S90139C	Lead ring for stablizing flasks in a water bath. It is used inside the anesthesia dish.
Scalpel Blade #11	World Precision Instrucments, Inc.	500240
Small Vessel Cauterizer	Fine Science Tools	18000-00
Micro Hook	Fine Science Tools	10064-14
Vetbond Suture Glue	3M	1469SB	n-butyl cyanoacrylate adhesive
Lipopolysaccharide	Sigma Life Science	L4391	Lipopolysaccaride from E.coli 0111:B4, gamma irradiated
12 x 12 inch opaque box	Acrylic Display Manufacturing: A division of Piasa Plastics	C4022	Colored Acrylic 5-Sided Cube, 3/16" Colored Acrylic, 12"W x 12"D x 12"H;  http://www.acrylicdisplaymfg.com/html/cubes_19.html
Camera/camcorder	JVC	GC-PX100BUS	Any camcorder that works well in low light and can be imported and edited. We use the JVC GC-PX100 Full HD Everio Camcorder.
Covidien Tendersorb™ Underpads	Kendall Healthcare Products Co	7174
WypAll L40	Kimberly-Clark Professional	5600	Any surface with moderate grip will do
Surface at 45 degree incline			We use a cardboard box.
Thin wire from a pipe cleaner	Creatology	M10314420	Any pipe cleaner from any craft store will work.
50mL conical tube	Falcon	352070
Fiberglass Screen Wire	New York Wire  www.lowes.com	14436	Any supplier can be used as long as their screen is 16 x 16 or 18 x 16
Razor blade	Fisherbrand	12-640	A wooden stick applicator or wooden part of a cotton-tipped swab will also work.
OPTIX 24-in x 4-ft x 0.22-in Clear Acrylic Sheet to make Clear Acrylic Walkway	PLASKOLITE INC	1AG2196A	Clear acrylic (1/8" thick) with sides and a top to limit exploration. We bought a sheet of acrylic from a local hardware store and had them cut it to size. (2) 2" x 2"; (3) 2" x 18"; (1) 2" x 15.5"; (1) 2" x 3". Using clear tape, tape all sides together, with the 15.5" piece on top. Tape the 3" piece to the end of the 15.5" piece to create a flap/entryway for the mice. Alternatively, part or all of the walkway can be glued together, and only taping on the top pieces. This design will allow for the walkway to be opened for easy cleaning.
Protractor	Westscott	ACM14371