Протокол Выделяя мыши Круг Уиллис

Резюме

We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.

Аннотация

Церебральный артериальный круг (circulus артериальный Cerebri) или круг Уиллис (КПС) является кровеносной анастомоза окружающих зрительных нервов и гипоталамус, который поставляет кровь к мозгу и окружающих структур. Он был вовлечен в несколько цереброваскулярных расстройств, в том числе церебральной амилоидной ангиопатии (ВГА) -associated васкулопатии, внутричерепного атеросклероза и внутричерепных аневризм. Изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе этих заболеваний для идентификации новых мишеней для лекарственных средств для их профилактики требуют животных моделей. Некоторые из этих моделей может быть трансгенными, в то время как другие будут включать в себя изоляцию спинно-сосудистую систему, в том числе метод CoW.The, описанный здесь, пригоден для изоляции коровой в любой линии мыши и обладает значительным потенциалом для скрининга (экспрессию генов, продуцирования белка, посттрансляционные модификации белков, secretome анализ и т.д.) исследования на крупных сосудах cerebro- мышиваскулатура. Он также может быть использован для исследований бывших естественных условиях, путем адаптации системы органов ванны , разработанной для изолированных мыши обонятельных артерий.

Введение

Церебральный артериальный круг (circulus артериальный Cerebri), также известный как круг Уиллис (КПС), петля Willisor Уиллис полигона) впервые был описан Томас Уиллис в 1664 Это кровеносная анастомоза, расположенных вокруг зрительных нервов и гипоталамус, который может рассматриваться в качестве центрального узла подачи крови в мозг и окружающих структур. Кровь входит в эту структуру через внутреннюю сонных и позвоночных артерий и она течет из круга с помощью внутренней средней и задней мозговых артерий. Каждая из этих артерий имеет левую и правую ветви по обе стороны круга. Базилярная, пост проходная и переднего общения артерии полный круг (рисунок 1 и рисунок 2). Риск нарушения кровотока в любом из выводных артерий сведено к минимуму путем слияния крови, поступающей в круг из сонной и церебральных артерий, тем самым гарантируя, что достаточное количество крови подают в бдождь. Эта структура также служит в качестве основного маршрута для коллатерального кровотока в тяжелых окклюзионных заболеваниях внутренней сонной артерии.

Несколько типов цереброваскулярных расстройств имеют свое происхождение в корове. Наиболее распространенными являются церебральной амилоидной ангиопатии (САА) -associated васкулопатии, внутричерепная атеросклерозе и внутричерепных аневризм. ^{1, 2, 3} Эти нарушения могут привести к недостаточной перфузии вследствие вазодилатации, и внутримозговые и / или субарахноидальных кровоизлияний в конечном счете , переводя в ишемических или геморрагических инсультов или , в лучшем случае, транзиторная ишемическая атака. Последние достижения в области диагностических процедур, в том числе нейровизуализации, возможно, в сочетании с ангиографией, позволили диагностировать эти основные цереброваскулярных заболеваний клинически, без необходимости проведения биопсии мозга. Тем не менее, эффективные и конкретные методы лечения (фармакологические или эндоваскулярные) в настоящее время не хватает, и поэтому существует необходимость определить новыемолекулярные мишени.

Идентификация новых мишеней для лекарственных средств для профилактики этих заболеваний у людей потребует животных моделей и способов выделения спинно-сосудистую систему, включая корове. Такие модели должны предоставить доказательства и улики для конкретных изменений, в том числе воспалительных изменений, происходящих в стенках крупных сосудов в животных моделях аневризмы внутричерепных артерий, САК или внутричерепного атеросклероза. ^{4, 5, 6}

Мы создали метод выделения мыши коровой для облегчения исследования воспаления сосудов при болезни Альцгеймера (AD) и связанных с ним заболеваний, таких, как САК. Этот метод выделения корове мыши был разработан для оценки воспалительного экспрессии гена цереброваскулярных во время прогрессирования заболевания. Вместе с обнаружением бета-амилоида осаждения в стенках лептоменингиальной и пиальных артерий, этот метод мог бы сделать его легче удерживатьмина возможная взаимосвязь между воспалительными экспрессии генов в спинно-сосудистой стенки и накопления Ар-пептида. Сосудистая сеть головного мозга, в том числе лептоменингиальной и пиальные в субарахноидальное пространство, является продолжением крупных артерий, образующих круг Уиллиса. Описанный здесь метод может быть использован для выделения корове любого рода мыши и может быть использован для всех типов скрининга (например, экспрессии генов, продуцирования белка и посттрансляционных модификаций белка) на больших сосудах мыши спинно-сосудистую систему .

протокол

Все процедуры были выполнены в соответствии со стандартами Европейского Сообщества по уходу и использованию лабораторных животных, с одобрения местным комитетом по этике для экспериментов на животных (Иль-де-Франс-Париж-комитета, выдача разрешений 4270).

1. Анестезия

1. Настаивать смертельную дозу фенобарбитала (до 1 мг / 10 г веса тела) внутрибрюшинно (27-го калибра иглы и 1 мл шприц) в взрослых мышей до операции.

2. Судно Перфузия

ПРИМЕЧАНИЕ: Там нет необходимости применять ветеринара мазь для глаз во время перфузии сосудов. Эта процедура является быстрой (5-10 минут) и заканчивается в смерти животного. Подтвердите отсутствие реакции с пальца щепоткой.

1. С помощью ножниц радужной оболочки глаза, сделать надрез, длиной около 4 см, в брюшную стенку и брюшину, чуть ниже грудной клетки.
2. Сделайте небольшой надрез (несколько миллиметров длинной) в диафрагме, а затем Continuе разрез диафрагмы по всей длине грудной клетки подвергать плевральной полости.
3. Поднимите грудину прочь и зажать кончик грудины с кровоостанавливающего; поместите кровоостанавливающего на шее. Аккуратно обрежьте жировой ткани, соединяющей грудину к сердцу.
4. Пропускают 15 калибра перфузионного иглу через левый желудочек в верхушке сердца.
5. И, наконец, использовать ножницы, чтобы вырезать одну из долей печени, чтобы создать выход.
   Примечание: альтернативный выход может быть создан с помощью ножниц радужной оболочки глаза, чтобы создать надрез в правое предсердие.
6. Заливать животное с 25 до 50 мл фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) с насосом, работающей со скоростью 2,5 мл / мин. Печень должна бланшируют в крови заменяется PBS.
7. Примерно через пять минут после того, как жидкость из печени совершенно ясно, остановить перфузию.
8. Если иммунное или регулярное окрашивание планируется, заливать животное с 50 мл параформальдегида(ПФА; 4% в PBS) в течение 15 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно, PFA газы являются токсичными. Перфузия животного с ПФА следует проводить в вентилируемом вытяжном шкафу.

3. Выделение мозга и Круг Уиллис

1. Выделение головного мозга
   1. Снимите головку с парой хирургических ножниц.
   2. Сделайте срединный разрез с ирисами ножницами, по коже от шеи до носа.
   3. Срезать кожу, чтобы выставить череп и удалять любые остаточные мышц и жировой ткани с ирисами ножницами.
   4. Поместите острый конец радужки ножниц в затылочного отверстия с одной стороны, и аккуратно сдвиньте их вдоль внутренней поверхности черепа до наружного слухового прохода (также известный как ушной канал).
   5. Воспроизведите разрез, описанный в 3.1.4 на контралатеральной стороне и сделать среднюю линию, разрезанной вдоль внутренней поверхности между теменной кости к началу стреловидного шва.
   6. Завод радужкуножницы в лобной кости, прямо между глаз, в стреловидного шва, а затем открыть их, чтобы разделить череп на две части.
   7. Вынуть мозг, захватывая обонятельные луковицы и используя ирис ножницы, чтобы отрезать нервные соединения на его вентральной поверхности.
   8. Удалить мозг и поместить его в 60-мм чашки Петри, содержащей ледяной PBS для изоляции коровой. Полностью погрузить мозг в PBS. Если мозг фиксировали 4% PFA (для последующего секционирования и иммунное окрашивание или регулярное окрашивание), держать его в ванну с 4% PFA при 4 ° С в течение 24 ч.
2. Выделение круга Уиллис
   Примечание: рассекает микроскоп необходим для изоляции коровой. Мозг должен храниться при температуре 4 ° С на протяжении всей процедуры.
   1. Помещенный мозг с ног на голову (то есть, на его спинной поверхности) , чтобы визуализировать корове.
   2. Используйте маленькую щипцов, чтобы захватить передней мозговой артерии (АКА) у основания обонятельных долей ( а, рис 1) и оказывают давление , чтобы отделить их от континуума сосуда. Используйте ту же процедуру , чтобы отрезать средней мозговой артерии (MCA) в б (рисунок 1).
   3. Используйте острые концы щипцов, чтобы поднять и удалить основные артерии, образующие корове от коры.
   4. Поднимите начало задних передачи артерий (PCA), чтобы отключить их от мозга, сжимания средней мозговой артерии (MCA) с пинцетом. Поднимите передние артерии (АКА и MCA) и вытащить их мягко по хиазмы в передне-дорсальный направлении. Для того, чтобы не допустить срыва корове, прервать процедуру рассмотрения других артерий.
   5. Повторите шаги 3.2.2 и 3.2.3 для верхней и задней мозжечковой артерии (SCA) / (PCA) (с, рис 1) и основной артерии (БА) (D, рисунок 1), потянув их в dorsal- передний направление. Остановка в конце процедуры, описанной Iп 3.2.4.
   6. Удалите всю коровой, осторожно потянув с щипцами. Поместите коровой в 60-мм чашке Петри заполнены ледяной PBS и удалить все оставшиеся прикрепленную ткани мозга с двумя щипцами, держа коровой на месте с небольшими контактами.
   7. Хранить заготовленную корове при -80 ° С для последующей обработки для очистки РНК (РНК урожайности экстракции больших количеств РНК - приблизительно 500 нг) или экстракции белка.
      Примечание: корове можно поддерживать ех естественных условиях в течение 24 ч, путем адаптации системы органов ванны , разработанной для изолированной мыши обонятельной артерии ^7.

Рисунок 1: Принципиальная схема вентральный Вид мозга мыши Подсветка корове корове формируется из двух внутренних сонных артерий (MCA), которые являются производными от двух передних мозговых артерий (АКА);. базилярнойартерия (BA) разветвляется на задней (PCA) и высшего (SCA) церебральных артерий, а также две позвоночные артерии (VA).

Результаты

PBS-перфузии мыши был убит, а корове выделен, как описано в разделе 3.2 протокола. Когда рассечение выполняется правильно, то КПС должен выйти из одного куска и должен быть слегка прозрачным из-за отсутствия остаточной крови в сосудистой системе.

Обсуждение

Мы опишем здесь воспроизводимый протокол для выделения круга Уиллис. Наиболее распространенными цереброваскулярные нарушения, вовлекающие коровой являются CAA-ассоциированной васкулопатии, внутричерепное Атеросклероз и внутричерепных аневризм, все из которых влияют на стенки артер...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11295-51
Hardened Fine Iris Scissors	Fine Science Tools	14090-11
Scissors - Straight / Sharp / Sharp   16.5 cm	Fine Science Tools	14002-16
Dumont #7b Forceps	Fine Science Tools	11270-20
Stereoscopic Zoom Microscope	Nikon	SMZ745T
CellBIND Surface 60mm Culture Dish	Corning	#3295
Peristaltic Pump - MINIPULS 3	Gilson	M312
Pentobarbital Sodique	Ceva Santé Animale	FR/V/2770465 3/1992