Инновационная ходовое колесо на основе механизма для повышения производительности Rat Training

Резюме

Данное исследование представляет собой инновационный ходовое колесо на основе системы подвижности животных для количественной оценки эффективной тренировки активности у крыс. Крыса дружественный Подопытный построен, используя предопределенный адаптивную кривую ускорения, а также высокая степень корреляции между эффективной скоростью физической нагрузки и объема инфаркта предполагает потенциал Протокола для экспериментов по профилактике инсульта.

Аннотация

Данное исследование представляет собой систему подвижности животных, оснащенный позиционирования ходовое колесо (PRW), как способ количественной оценки эффективности физической активности для снижения тяжести последствий инсульта у крыс. Эта система обеспечивает более эффективное обучение животных упражнения, чем коммерчески доступных систем, таких как беговые дорожки и моторизованных ходовых колес (МРО). В отличие от MRW, который может достичь скорости менее 20 м / мин, крысы разрешено работать на стабильной скорости 30 м / мин на более просторные и высокой плотности каучука беговой дорожки, поддерживаемой шириной 15 см акрилового колеса с диаметр 55 см в этой работе. Используя предопределенную адаптивную кривую ускорения, система не только снижает возможность ошибки оператора, но и обучает крыс бегать настойчиво до заданной интенсивности пока не будет достигнута. В качестве способа оценки эффективности тренировок, в режиме реального времени положение крысы обнаруживается четырьмя парами инфракрасных датчиков, развернутых на ходовое колесо. После того,Адаптивная кривая ускорения инициируется с использованием микроконтроллера, то данные, полученные с помощью инфракрасных датчиков, автоматически регистрируют и анализируют на компьютере. Для сравнения, 3 недели обучение проводится на крысах с использованием беговая дорожка, MRW и ​​PRW. После того, как хирургическим путем индукции окклюзия средней мозговой артерии (МСАО), были проведены модифицированные неврологической оценки степени тяжести (mNSS) и тест на наклонной плоскости для оценки неврологического повреждения у крыс. PRW Экспериментально подтверждено, как наиболее эффективным среди таких систем подвижности животных. Кроме того, эффективность упражнений мера, основанная на анализе положения крыс, показали, что существует высокая отрицательная корреляция между эффективной реализации и объема инфаркта, и могут быть использованы для количественной оценки обучения крысы в ​​любом типе экспериментов по снижению повреждения головного мозга.

Введение

Непрерывно существуют Strokes в качестве финансового бремени для стран всего мира, в результате чего огромное количество пациентов физически и умственно отсталых детей ^{1, 2.} Существует клинические данные позволяют предположить , что регулярные физические упражнения могут улучшить регенерацию нерва и укрепить нервные связи ^{3, 4,} и это также показано , что физические упражнения могут снизить риск заболевания ишемических инсультов ^5. При любом беговой дорожке или ходовое колесо в качестве упражнения системы обучения, грызунов, таких как крысы, служить в качестве прокси - сервера для людей для проверки эффективности упражнений в подавляющем большинстве клинических экспериментов ^{6 - 8.} Система тренировки обычно включает в себя обучение крысу в течение определенного периода времени, в течение которого крыса работает на определенной скорости. Таким образом, интенсивность тренировки , как правило , рассчитывается в зависимости от скорости и продолжительности упражнений ^{6 - 8.} Такой же подход применяется коценить количество упражнений, необходимое для нейрофизиологических защиты. Однако экспериментальные упражнения иногда оказывается неэффективным, например, когда крыса спотыкается, падает, или захватывает рельсы , когда они не в состоянии догнать беговой скорости колеса ^{9 - 11.} Само собой разумеется, случаи неэффективного упражнения значительно снижают пользу физических упражнений. Несмотря на то, что нет какой-либо общепризнанной подход в настоящее время для количественного определения эффективных упражнений для уменьшения повреждения головного мозга, уровень эффективных упражнений по-прежнему выступает в качестве объективной оценки для клинических исследований, чтобы проиллюстрировать преимущества упражнения в дисциплине нейрофизиологии.

Там существует ряд ограничений на коммерчески доступных систем мобильности животных , используемых в современных экспериментах по снижению повреждения головного мозга ^12. В случае, беговая дорожка, крысы вынуждены работать с помощью электрошока, вызывая тяжелейшие психологическиестресс на животных и , таким образом , вмешательство в конечном нейрофизиологических результатов испытаний ^{8, 13, 14.} Запуск колеса можно разделить на два типа, а именно: добровольные и принудительные. Добровольные ходовые колеса позволяют крыс бегать , естественно, создавая чрезмерную изменчивость из - за различий в физических качеств и способностей ¹⁵ крыс, в то время как моторизованные ходовые колеса (МРО) используют мотор для того чтобы повернуть колесо, заставляя крыс бегать. Несмотря также является формой принудительного обучения, МРО накладывает меньше психологического стресса на крыс , чем беговые дорожки ^{13, 16, 17.} Тем не менее, эксперименты с использованием МРО сообщили , что крысы , иногда прерывать упражнение, захватывая рельсы на колее и отказываясь работать на скоростях , превышающих 20 м / мин ^9. Эти примеры показывают, что системы подвижности животных, доступных в настоящее время имеют неотъемлемое недостаток, что препятствует эффективной тренировки. Дляобъективные цели обучения крысы, разработка высокоэффективной системы подготовки, но с низким уровнем помех поэтому рассматривается как актуальный вопрос для нейрофизиологических экспериментов физических упражнений.

Данное исследование представляет собой высокоэффективную систему ходовое колесо для экспериментов по снижению тяжести последствий инсульта ^11. В дополнение к уменьшению числа факторов помех во время процесса обучения, эта система обнаруживает рабочее положение крысы с использованием инфракрасных датчиков, встроенных в колеса, обеспечивая тем самым более надежную оценку эффективной реализации деятельности. Психологический стресс накладывается традиционными беговыми дорожками и частые упражнения перерывы в МРО как искажают объективность получаемых оценок физических упражнений. Система позиционирования ходовое колесо (PRW), представленные в данном исследовании разработана в попытке свести к минимуму нежелательные помехи, обеспечивая при этом надежную модель обучения для количественной оценки эффективного ехеrcise.

протокол

Заявление по этике: Экспериментальные процедуры были одобрены этическим комитетом животных Южного тайваньского университета науки и технологии лабораторного центра животноводства, Национального научного совета Китайской Республики (Тайнань, Тайвань).

1. Построение структуры ходовое колесо

Примечание: Все акриловые должны быть прозрачными. Промыть разобранном колесо с водой, а затем использовать спирт для того чтобы протереть резиновую дорожку и акриловые листы после каждого использования.

1. Получают акриловый ходовое колесо, чтобы быть 55 см в диаметре и 15 см в ширину.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это колесо больше , чем традиционное ходовое колесо (диаметр = 35 см, ширина = 12 см) (F igure 1А).
2. Используя резак, вырезать отверстие в четверть круга в одну сторону ходовое колесо , чтобы действовать как вход и выход, а для крыс (рис 1B). Поместите слой с высоким коэффициентом трения резиновой дорожки на внутренней стороне ACRилова колеса (рис 1B).
3. Поместите железный стержень с подшипниками для подключения ходовое колесо (рисунок 1В). Поместите два акриловых треугольной колонны по обе стороны от ходовое колесо , чтобы действовать в качестве опорной рамы (Фиг.1В).
4. Приложить толщиной 1 мм полукруглый, прозрачный акриловый лист на внешних сторонах двух треугольных колонн с помощью винтов. Используйте этот лист для развертывания инфракрасных датчиков. Убедитесь, что акриловые листы примерно 3 см от каждой стороны ходовое колесо.

2. Развертывание инфракрасных датчиков и определение эффективного для занятий спортом

Примечание: Примите во внимание размер ходовое колесо и длину крысы в ​​разработке инфракрасной системы. Крысу срабатывает только одного датчика за один раз. В этом эксперименте у крыс длиной от 20 до 23 см.

1. Просверлите отверстие в акриловых листов каждые 45 ° (дуги интервал = 21 см), с расстояниеммежду двумя отверстиями быть примерно равно длине теста на крысах. Сделайте отверстия того же размера, что и инфракрасные датчики (рис 2А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для традиционных МРО, просверлить отверстие каждые 70 ° (интервал дуги = 21 см, рис 2В).
2. Во время эксперимента PRW, поддерживать крыс при устойчивом состоянии работать в диапазоне от 0 ° до 135 °.
   Примечание: Таким образом, определить эту область в качестве эффективной площади упражнения, в то время зрения все остальные разделы, как неэффективные областей упражнений. Для традиционных МРО, определить эффективную зону тренировки в качестве части от 0 ° до 140 ° (рис 2В).

3. Вождение ходовое колесо

1. Используйте бесщеточный двигатель постоянного тока и привод двигателя для приведения в ходовое колесо.
2. Установите диаметр резиновый диск 10 см на центральной оси двигателя (рис 1В).
3. Используя железный каркас и пружины, чтобы поддержать двигатель, подключить резиновый диск изцентральная ось вращения двигателя на внешней стороне ходовое колесо.
   Примечание: Пружины должны сотрудничать с винтами, чтобы обеспечить регулировку высоты динамического двигателя и предотвратить резиновый диск отсоединение на беговой дорожке колеса из-за свободных пружин.
4. Эксплуатировать двигатель для привода диаметр резиновый диск 10 см с помощью микроконтроллера, и наблюдать колесо вращается за счет трения между резиновым диском и взлетно-посадочной полосы колеса, создавая моторизованный ходовое колесо платформы.
5. Крепление четыре инфракрасных датчиков последовательно между 0 ° до 135 ° (фиг.2А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для традиционных МРО, крепление датчиков в диапазоне от 0 ° до 140 ° (рис 2В).
6. Подключение четыре пары инфракрасных датчиков, установленных в обоих акриловых листов к общим штифтами микроконтроллера с использованием одножильных кабелей, тем самым формируя систему позиционирования ходовое колесо.

4. Построение адаптивной Acceleratiна кривой

1. За три дня до начала официальной 3-х недельного обучения упражнения, тренировки крыс вручную в действие ходовое колесо.
   Примечание: Цель состоит в том, чтобы позволить крысы, чтобы ознакомиться с управлением окружающей средой, и, чтобы проверить, может ли каждая крыса выдержать пробег в 20 м / мин.
   1. Во время ручного обучения, постепенно ускорить скорость движения до тех пор, пока крыса не в состоянии идти в ногу. Когда это происходит, уменьшите скорость до тех пор , пока крысы вновь обретает устойчивый темп бега, а затем постепенно увеличивать скорость снова до тех пор , крыса не достигнет 20 м / мин (пунктирные линии на рисунке 3). Учебное пособие включает в себя семь крыс построить тренировочные кривые.
2. Используя численное уравнение , чтобы соответствовать измеренные данные на 3 -й день ручного тестирования, вычисления ускорения кривых можно ближе к ручного обучения (кривая с кругами, рисунок 3). Fit Уравнение 1 к необработанным данным, где C _INI = 8, C _{плавника} = 20 и τ = 30 представляют начальную скорость, конечную скорость и постоянную времени, соответственно).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это уравнение адаптируется к условию тела крысы. Поэтому обратитесь к расчетной кривой в качестве адаптивной модели ускорения-обучения.
   (1)
3. Используйте уравнение 1 для 1-й недели формального обучения.
4. В течение нескольких недель 2 и 3 тренинга, настроить параметры уравнения 1, то есть, изменить от 12 до 22, чтобы обеспечить скорость достигнет 30 м / мин.

5. Управление программой Software

Примечание: Исключительно разработать код для микроконтроллера на основе работы двигателя и для передачи сигналов от инфракрасных датчиков к компьютеру для последующего анализа данных.

1. С помощью языка программирования C, чтобы написать программу управления программное обеспечение, содержащее одну основную программу и две процедуры прерывания обслуживания для таймера вмикроконтроллер ^18.
   1. Убедитесь в том, что основная программа инициализирует регистр микроконтроллера и строит модель адаптивной кривой ускорения в памяти микроконтроллера.
   2. Использование прерывания обслуживания рутина таймера 0, чтобы активировать адаптивный кривую ускорения и вычислить всю продолжительность обучения.
   3. Использование прерывания обслуживания рутина таймера 1 для извлечения данных сигналов от инфракрасных датчиков и передавать данные на компьютер.
   4. Используйте основную программу , чтобы записать положение 0 ^O для регулировки скорости бега колеса.
2. После того как датчик приема ИК при 0 ° срабатывает, интерпретировать его как падения заболеваемости, который накапливается основной программой. В тот момент, встречаемости времен падения числа случаев попадает 10% порог числа обнаружений позиции крысы, deaccelerate запущенную колесо автоматически в качестве меры безопасности для обученных крыс. Примечание: Скорость ое ходовое колесо уменьшается до тех пор , крыса не может вернуться в безопасную зону (0 ^о до 135 ^о) и поддерживать стабильное состояние выполнения для меры безопасности.

6. Эксплуатация ходовой системы позиционирования колеса

1. Включите микроконтроллер и ждать оператора нажать на кнопку, чтобы начать модель обучения каждой недели.
   1. Нажмите кнопку "Пуск", чтобы начать модель обучения для Недели 1.
      Примечание: Двигатель автоматически ускоряется на основании адаптивной кривой ускорения до тех пор, пока не достигнет 20 м / мин, и автоматически останавливается через 30 мин.
   2. Нажмите кнопку "Пуск", чтобы начать модель обучения для 2-й неделе.
      Примечание: Двигатель автоматически ускоряется на основании адаптивной кривой ускорения до тех пор, пока не достигнет 30 м / мин, и автоматически останавливается через 30 мин.
   3. Нажмите кнопку "Пуск", чтобы начать модель обучения для Недели 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Двигатель автоматически AcceleraTES, основанные на адаптивном кривой ускорения до тех пор, пока не достигнет 30 м / мин, и автоматически останавливается через 60 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всего процесса подготовки, передачи данных сигнала, принимаемого от инфракрасных датчиков к компьютеру без проводов.
2. С помощью компьютера, анализировать данные о местоположении, чтобы получить эффективную меру упражнений для всего процесса тренировки ( ). См Уравнение 2.
   (2)
   Примечание: EEE, ПЕД и СВУ представляют собой эффективное осуществление мер, эффективные и неэффективные продолжительности упражнений, соответственно.

7. Обучение Rats

1. Случайным образом разделить взрослых самцов крыс Sprague-Dawley крыс на пять групп (п = 9 для каждой группы): на бутафорских, контроль, беговой дорожке, МРО и Prw групп.
2. Проведение обучения упражнения 3 недели для трех групп упражнений, т.е. трeadmill, MRW и ​​Prw группы, в то время как не для притворства и контрольных групп.
   Примечание: 3 недели упражнений тренировки для каждой группы упражнений составляет 20 м / мин в течение 30 мин в течение Недели 1, 30 м / мин в течение 30 мин в течение Недели 2 и 30 м / мин в течение 60 мин в течение 3-я неделя.

8. Животное и ход поршня Модель

1. Как указано в п. 7.1, случайным образом разделить всех вовлеченных взрослых самцов крыс Sprague-Dawley крыс весом от 250-280 г, на 5 групп.
2. Взвешивание всех животных, чтобы обеспечить точные расчеты дозы препарата. Обезболить крыс с помощью пентобарбитала натрия (25 мг / кг, внутрибрюшинно [IP]), и смесь, содержащую кетамином (4,4 мг / кг, внутримышечно [им]), атропин (0,02633 мг / кг, [им]) и ксилазина (6,77 мг / кг, [им]).
   1. Оценка глубины анестезии путем мониторинга частоты дыхания (нормальный 70-115 вдохов / мин), ритм, глубина дыхания, слизистых цвета мембраны и регулярное тестирование рефлексов, например , ног пинч, хвост щепотку, веко / наращивание ресници глазная.
3. Вставьте температурный датчик в прямую кишку, и поддерживать ректальные температуры в диапазоне от 37 до 37,5 ° C с использованием отдельных нагревательных ламп.
4. Индуцируют фокальной ишемии, переходные окклюзия средней мозговой артерии (МСАО), вставляя нити во внутреннюю сонную артерию , чтобы закупоривать отверстие средней мозговой артерии с помощью подход ¹⁹ артерии внешней сонной.
   1. Выполните те же оперативные процедуры о ложнооперированными животных, а не вставить нить во внутреннюю сонную артерию. Поддерживать очаговой ишемии головного мозга в течение 1 часа, удалите нить, закройте надрез, а затем оставить 1 см нейлоновой нити, выступающую которые могут быть сняты, чтобы позволить реперфузии.
5. Администрирование подкожной (SC) инъекции обезболивающего средства (бупренорфин (0,05 мг / кг, подкожно)), в животных для анальгезии два раза в день в течение 3-х дней.

9. Оценка Neural повреждения

1. Evalхать неврологические и моторные функции, соответственно, неврологического балла тяжести (mNSS) ²⁰ и испытания наклонной плоскости ^21.
   Примечание: mNSS представляет собой совокупность двигателя (состояние мышц, неправильное движение), сенсорных (зрительных, тактильных и проприоцептивной) и рефлекторных тестов. Дайте одно очко за невыполнение задания. Оценить неврологическое функции по шкале 0-18 (нормальный балл = 0; максимальное количество баллов = 18 дефицит).
2. Оценка всех крыс с точки зрения поведенческой производительности за день до и ежедневно в течение промежутка времени 7 дней после операции.
3. Измерьте заднюю конечность силы сцепления крысы с помощью наклонной плоскости.
   1. Поместите крыс на наклонную альпинистской аппарата на ежедневной основе, и акклиматизации крыс к устройству и условиям тестирования, за 1 неделю до тестирования.
   2. Поместите каждую крысу на аппарат и поощрять крыса, чтобы подняться на платформу, пока в верхней части аппарата в течение периода акклиматизации.
   3. Поместите крысу вв верхней части аппарата с головкой вниз во время тестирования. Убедитесь в том, что ось тела обследуемого пребывания крыс вдоль до 20 х 20 см ² резиновой ребристой поверхностью на на наклонной плоскости , начиная под углом 25 °.
   4. Увеличение угла динамически используя шариковый винт, соединенный с шаговым двигателем, чтобы определить максимальный угол, при котором животное может удерживать до плоскости. Увеличение угла наклона наклонной плоскости постепенно, пока мышь не удалось удержать на наклонной плоскости, а затем обнаружить сползания событие. Базовая степень наклонной плоскости составляет 25 ° в начале.
   5. Попросите двух наблюдателей (не подозревая о том, что лечение крыс было дано), чтобы самостоятельно изучить и забивать все поведенческие тесты, то есть среднее значение из левой и правой боковых максимальных углов.
4. Жертвоприношения у всех животных на 7-й день после МСАО. Заливать сердца животных при глубокой анестезии (фенобарбиталом натрия 100 мг / кг, внутрибрюшинно) с физиологическим раствором ²² . Удалить , а затем погрузить мозговую ткань в холодной солевой раствор в течение 5 мин, который затем разрезают на корональных секций 2,0 мм с использованием слайсер ²² ткани.
5. Погрузите свежие срезы головного мозга в 2, 3, 5-трифенилтетразолинхлорида хлорид (ТТС) при 37 ° С в течение 30 мин, а затем перенести ломтики до 5% раствором формальдегида для фи xation при температуре 4 ° С в течение 24 ч. Поместите окрашенные срезы мозга на держателе плексигласа.
6. Фотографирование ТТС-окрашивали срезы с калиброванной шкалой с использованием ПЗС-камеры, связанный с персональным компьютером, загруженного с программным обеспечением для обработки изображений. Используйте полуавтоматическую систему анализа изображений , а также для оценки инфарктом площадь (мм ²⁾ от каждого TTC-окрашенного среза мозга ^23.
7. Рассчитать общий объем инфаркта для каждого среза путем суммирования инфарктом площадей всех срезах мозга. Отметьте неокрашенными область (ишемический мозг) отдельно на каждой стороне ломтики толщиной 2 мм, а затем рассчитать объем инфаркта и среднее значение.
8. рассчиты ваютсяпоздно скорректированный объем инфаркта (CIV), как
   CIV = {ЛТ (RT- RI)} d (3)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Где LT и RT обозначены области левого и правого полушарий в мм ^2, соответственно, RI является инфаркту площадь в мм ^2, и d = 2 мм толщина среза.

Результаты

Этот раздел посвящен сравнения, сделанные через 1 неделю после операции, на объем инфаркта партитур mNSS, результаты испытаний наклонной плоскости и мозга между пятью группами. Рисунок 4A и 4B представлены средние оценки mNSS и среднее значение результато...

Обсуждение

Этот протокол описывает высокоэффективную систему ходовое колесо для уменьшения тяжести последствий инсульта у животных. В качестве крысиного дружественный испытательный стенд, эта платформа разработана, а таким образом, что стабильная скорость движения может поддерживаться крыс н...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brushless DC motor	Oriental Motor	BLEM512-GFS
Motor driver	Oriental Motor	BLED12A
Motor reducer	Oriental Motor	GFS5G20
Speedometer	Oriental Motor	OPX-2A
Treadmill	Columbus Instruments	Exer-6M
Infrared transmitter	Seeed Studio	TSAL6200
Infrared Receiver	Seeed Studio	TSOP382
Microcontroller	Silicon Labs	C8051F330
CCD camera	Canon Inc.	EOS 450D
Image processing software	Adobe Systems Incorporated	ADOBE Photoshop CS5 12.0
Image analysis	Media Cybernetics	Pro Plus 4.50.29
Sodium pentobarbital	Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA)	SIGMA P-3761
Ketamine	Pfizer (Kent, UK)	1867-66-9
Atropine	Taiwan Biotech Co., Ltd. (Taoyuan, Taiwan)	A03BA01
Xylazine	Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA)	SIGMA X1126
Buprenorphine	Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA)	B9275