G Белково-селективные GPCR Конформации Измеряется с использованием FRET датчиков в прямом эфире клеточной суспензии Флуорометр Пробирной

Резюме

Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, Fӧrster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.

Аннотация

Fӧrster резонансный перенос энергии (FRET) основе исследования становятся все более распространенными в исследовании сигналов GPCR. Наша исследовательская группа разработала внутримолекулярной датчик FRET для обнаружения взаимодействия между Gα субъединиц и GPCRs в живых клетках после агонистом стимуляции. Здесь мы подробно протокол для обнаружения изменений в FRET между β ₂ адренергического рецептора и С-концевого пептида Gαs после обработки 100 мкМ изопротеренол гидрохлорида , как ранее характеризовался ^1. Наш датчик FRET представляет собой единый полипептид, состоящий поочередно из полнометражного GPCR, лобзиком акцепторного флуорофора (mCitrine), ER / K СПАЗМЫ (систематическое сродство белка сила модуляции) линкер, донор FRET флуорофор (mCerulean) и Gα C терминальный пептид. Этот протокол будет подробно подготовка клеток, условия трансфекции, установки оборудования, выполнение анализа и анализа данных. Этот экспериментальный дизайн обнаруживает небольшой чAnges в FRET свидетельствует о белок-белковых взаимодействий, а также могут быть использованы для сравнения силы взаимодействия через лигандов и ХВГФ-G белка спариваний. Для того, чтобы усилить сигнал-шум в наших измерениях, этот протокол требует повышенную точность на всех этапах, и представлена ​​здесь для того, чтобы воспроизводимый исполнение.

Введение

G-белками рецепторы (GPCRs) семь-трансмембранные рецепторы. Один только геном человека содержит около 800 генов, кодирующих GPCR,, которые активируются различными лигандами, включая свет, отдушек, гормонов, пептидов, лекарственных средств и других небольших молекул. Около 30% всех лекарственных средств в настоящее время на целевом рынке GPCRs , потому что они играют большую роль во многих болезненных состояний ^2. Несмотря на десятилетия обширной работы, проделанной по этому семейству рецепторов, остаются значительные нерешенные вопросы в этой области, в частности в отношении молекулярных механизмов, которые управляют GPCR-эффекторных взаимодействий. На сегодняшний день только одна кристаллическая структура с высокой разрешающей способностью были опубликованы, обеспечивая представление о взаимодействии между β ₂ адренергического рецептора (β ₂ -АР) , и белок Gs ^3. Вместе с обширные исследования в течение последних трех десятилетий, он повторяет один конкретный структурный компонент, который имеет решающее значение в этомВзаимодействие: The Gα субъединицей С-концевом участке. Эта структура имеет важное значение как для G активации белка путем выбора белка GPCR ⁴ и G ^5-6. Следовательно, Gα С-конец обеспечивает важную связь между лигандом стимуляции GPCR и селективной активации белка G.

Исследования, проведенные за последнее десятилетие показывает, что GPCR, заселить широкий конформационные пейзаж с лиганд-связывающим стабилизирующим подмножеств GPCR конформации. В то время как несколько методов, в том числе кристаллография, ЯМР и флуоресцентной спектроскопии и масс - спектрометрии можно исследовать конформационные ландшафт GPCR, существует недостаток подходов к выяснению их функциональное значение в выборе эффекторной ^7. Здесь мы очертить подход Fӧrster -На резонансный перенос энергии (FRET) для обнаружения белка G-селективных GPCR конформации. FRET зависит от близости и параллельной ориентации двух флуорофоров с перекрытием выбросов (доноров) аго возбуждения (акцептор) спектры ^8. В качестве донора и акцептора флуорофоров сближаются в результате либо конформационных изменений в белке или белок-белкового взаимодействия, лада между ними увеличивается, и может быть измерена с помощью ряда методов ^8. FRET на основе биосенсоров широко используются в области GPCR ^9. Они использовались, чтобы исследовать конформационные изменения в GPCR, вставив донора и акцептора в третьем цикле внутриклеточного и GPCR С-конца; Датчики были разработаны для исследования GPCR и эффекторных взаимодействий по отдельности мечения GPCR и эффектор (G белковых субъединиц / arrestins) с FRET пары ^10; некоторые датчики также обнаружить конформационные изменения в белке G ^11. Эти биосенсоры позволили поле , чтобы задать множество нерешенных вопросов , в том числе конформационных изменений в GPCR и эффектора, кинетика взаимодействия GPCR-эффекторов и аллостерических лигандов ^12. Наша группабыл особенно заинтересован в создании биосенсоров, которые могли бы обнаружить белок G-специфический GPCR конформации под агонистом приводом условиях. Этот биосенсора основывается на недавно разработанной технологии под названием СПАЗМЫ (систематическое сродство белка сила модуляции) ^13. СПАЗМЫ включает привязывать взаимодействующих доменов белка с использованием ER / K компоновщик, который контролирует их эффективные концентрации. Обрамление линкер с FRET пары флуорофоров создает инструмент , который может сообщать о состоянии взаимодействия между белками ^12. Ранее ¹ модуль СПАЗМЫ был использован для привязывать к Gα С-концом к GPCR и контролировать их взаимодействие с FRET флуорофоров, mCitrine (далее в данном протоколе его широко известный вариант, желтый флуоресцентный белок (YFP), возбуждение / пик излучения при 490/525 нм) и mCerulean (далее в настоящем протоколе его широко известный вариант Cyan флуоресцентный белок (CFP), возбуждение / пик излучения 430/475 нм). От N- к С-концу, тего генетически кодируемых отдельный полипептид содержит: полная длина ХВГФ, лада акцептор (mCitrine / YFP), 10 нм ER / K компоновщик, лада донор (mCerulean / СФП), а Gα С-конец пептида. В этом исследовании, датчики сокращенно GPCR-линкер длиной Gα пептида. Все компоненты разделены неструктурированной (Gly-Ser-Gly) ₄ линкера , который позволяет свободное вращение каждого домена. Подробная характеристика таких датчиков была ранее выполнена с использованием двух прототипические GPCRs: β ₂ -АР и опсина ^1.

Этот датчик трансфицированы в НЕК-293Т и флуорометре на основе экспериментах с клеточными мера спектров флуоресценции пары FRET в произвольных единицах число импульсов в секунду (CPS) в присутствии или в отсутствие лиганда живого. Эти измерения используются для вычисления соотношения FRET между флуорофоров (YFP _макс / CFP _макс). Изменение в FRET (ΔFRET) рассчитывается путем вычитания среднего отношения FRETнеочищенных образцов из соотношения лада лиганда образцах, обработанных. ΔFRET можно сравнить между конструкциями (β ₂ -АР-10 нм-Gαs пептида по сравнению с не & beta ; _2--AR 10 нм не пептид). Здесь мы подробно протокол, чтобы выразить эти датчики в НЕК-293Т живых клеток, следить за их выражение, а установка, выполнение и анализ Флуорометр на основе живых клеток FRET измерения для необработанных клеток по сравнению условий наркотиков лечение. В то время как этот протокол является специфическим для β ₂ -АР-10 нм-Gαs пептидной датчика обрабатывали 100 мкМ изопротеренол битартрат, она может быть оптимизирована для различных пар ХВГФ-Gα и лигандов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. ДНК Приготовление

1. Датчик Проектирование конструкций с использованием модульной схемы клонирования. Пожалуйста , ссылки конструкция датчика β ₂ -АР подробно ранее ^1.
2. Готовят ДНК в соответствии с протоколом коммерческого набора Минипрепарат и элюции в 2 мМ раствора Трис-HCl, рН 8, при концентрации ≥ 750 нг / мкл, _260/280 1,7 - 1,9, _260/230 2,0 - 2,29.

2. Культура клеток Приготовление

1. Культура НЕК-293Т-FLP-N клеток в среде DMEM, содержащей 4,5 г / л D-глюкозы, дополненной 10% ФБС (инактивированной нагреванием) (об / об), 1% L-глютамин добавка, 20 мМ HEPES, рН 7,5 при 37 ° C в увлажненной атмосфере при 5% СО _2. Обрабатывать клетки в биологической безопасности для колпака последующих шагов.
2. Разрешить клеткам расти до сливающийся монослой , прежде чем пассажей в шесть-луночных блюд. Время достижения слитности зависит от начальной плотности металлизации. Используйте пластины, которыеприйти к сплошности в течение 1 - 2 дней обшивки в течение шести-хорошо металлизированный. Сливающийся 10 см тканевой культуры обработанных блюдо имеет плотность клеток примерно 4 × 10 ⁶ клеток / мл. На рисунке 1 изображение роста клеточной культуры.
3. Вымойте клеток с 10 мл PBS и Trypsinize с 0,25% трипсина (см Обсуждение, пункт 2). Пластина 8 х 10 ⁵ клеток / лунку в 2 мл среды в тканевой культуре обработанные шесть также блюда и позволяют придерживаться в течение 16 - 20 часов.

3. Трансфекция условия

1. Зигзагом трансфекций для конструкций, которые могут потребоваться разное количество времени для достижения оптимального выражения (между 20 - 36 ч). Синхронизировать условия для единого времени эксперимента. Также имеют нетрансфицированные управления скважиной при эквивалентной плотности клеток, которые будут использоваться для фонового шума и вычитанием рассеяния при анализе.
2. Доведите реагенты трансфекции до комнатной температуры: уменьшенные сыворотки носитель, ДНК трансфекции реагента.
3. ВБиологическое защитный кожух сочетают реагенты в стерильной микроцентрифужных трубки в следующем порядке: смешать 2 мкг ДНК с 100 мкл сыворотки восстановленных средств. Шип 6 мкл реагента для трансфекции в смеси носитель / ДНК, не касаясь поверхности смеси или сторону трубки. Установить одну реакцию трансфекции на лунку. условия Трансфекция могут быть оптимизированы (1 - 4 мкг ДНК, 3 - 6 мкл реагента для трансфекции), чтобы достичь устойчивых уровней экспрессии. В Таблице 1 более Оптимизиирует.
4. Выдержите смесь при комнатной температуре в биологической Защитный кожух 15 - 30 мин. Не используйте реакцию, если оставить инкубировать в течение более 30 мин.
5. Добавить реакцию клеток в каплям образом через хорошо и осторожно встряхните шесть хорошо, чтобы обеспечить тщательное смешивание. Добавьте одну реакцию на каждую лунку.
6. Через 20 ч экспрессии, монитор флуоресценции с использованием тканевой культуры флуоресцентного микроскопа. Оценка экспрессии населения с 10-кратным объективных и белка локализации в клетке на 40Х. ObsЭрве для экспрессии белка в плазматической мембране (ПМ). Если существенная интернализации отмечается, следить за трансфекцию, пока значительное выражение не будет обнаружен в ПМ.

4. Реагент и оборудование Подготовка

1. Подготовьте 100 мМ запасы лекарственных средств и хранят при -80 ° C: изопротеренол битартрат (100 мМ в дН ₂ O , содержащего 300 мМ аскорбиновой кислоты). Сделайте на льду / в холодном помещении, а также флэш-немедленно заморозить. Порции могут быть получены и использованы до одного года.
2. Приготовьте Cell Buffer (~ 2 мл / состояние) и хранить в C водяной бане при 37 °. Сделать свежий каждый день. Справочная таблица 2 для мобильных буферных компонентов.
3. Готовят Drug буфер (10 мл) и хранят при комнатной температуре. Справочная таблица 2 для Buffer Drug компонентов.
4. Кислотная промывка кюветах с использованием концентрированной HCl. Нейтрализовать со слабым основанием (1 М КОН), и тщательно промыть кюветах с дН ₂ O.
5. Подготовьте рабочую станцию ​​вокруг флуорометре с несколькимикоробки 10, 200 и 1000 мкл пипеток, таймером , установленным с 10 мин обратный отсчет времени, в доступной вакуумной линии с наконечниками для очистки кювет, деликатных салфетками задач, и впрыскивают бутылка с сверхчистого H ₂ O.
6. Тепло внешней водяной бани для флуорометр и тепловой блок до 37 ° C.
7. Включите флуорометре; установить программу сбора флуоресценции для сбора CFP к возбуждению 430 нм, полоса пропускания 8 нм; Дальность выброса 450 нм - 600 нм, полоса пропускания 4 нм. Для сбора YFP только в качестве контроля датчика (см Обсуждение) множество возбуждения на длине волны 490 нм, полоса пропускания 8 нм, диапазон излучения 500 - 600 нм, полоса пропускания 4 нм. Настройки сбора CFP будут использоваться для получения спектра FRET в этом эксперименте.
8. Поместите двенадцать 1,5 мл микроцентрифужных труб в тепловой блок , как показано на рисунке 2. Эти трубки являются держателями для клеток аликвотных трубок (500 мкл микропробирок.) Поместите небольшой кусочек ткани в держателях 1 и 7, чтобы смягчить кюветки помещенные здесь.
   Примечание: Используйте отдельные кюветы для необработанного состояния и состояния лекарственного средства для предотвращения перекрестного загрязнения.

Рисунок 2. микроцентрифужных трубки Настройка и Положение Ссылка в тепловой блок кювете для необработанных образцов находится в положении 1. ячейки аликвоты трубы находятся в положениях 2 - 6. Кювета для фармацевтических образцах, обработанных в положении 7; ячейки аликвоты трубы находятся в рабочем положении 8 - 12. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

9. Заполните держатели 2 - 6 и 8 - 12 с ~ 750 мкл воды для создания мини-C на водяной бане 37 °.
10. Поместите десять 500 мкл микроцентрифужных пробирок для клеточных аликвоты в мини-водяные бани (держатели 2 - 6, 8 - 12). Каждая трубка будет индивидуальное повторение условия (5 untreateд, 5 лекарственное лечение).
11. Монитор клеток для экспрессии (см шаг 3.6).

5. Эксперимент и сбора данных

Рисунок 3. Экспериментальная Схема. Подробный пошаговый гид для экспериментальной установки и исполнения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

1. Для экспериментальной схемы Reference Рисунок 3. Когда клетки готовы быть собраны, на основе экспрессии белка обнаруженного с флуоресцентным микроскопом (см Обсуждение, пункт 4): в биологическом защитном кожухе, осторожно удалить ~ 1 мл сред, ресуспендирования клеток в их культуре с P1,000 и передать взмучивания в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
   Примечание: Избегайте использования трипсина, как это может переварить N-конец и /или связывающего кармана датчика GPCR.
2. Граф клеток, чтобы обеспечить надлежащую плотность клеток в взмучивания. Оптимизация объема ресуспендирования для 4 × 10 ⁶ клеток / мл.
3. Спин клетки в Бакет центрифуге при комнатной температуре, 290 мкг в течение 3 мин. Удалить супернатант после центрифугирования.
4. ДЖЕНТЛИ ресуспендирования клеток в 1 мл клеточной буфера (хранится при 37 ° C) и повторить шаг 5.3. Во время второго спина, собрать 100 мМ препарат запаса аликвоты от -80 ° C. Сделайте разведение 1: 100 в буфере для лекарственных средств 1 мМ рабочего запаса и держать при комнатной температуре.
5. После второго центрифугирования, удаления надосадочной жидкости и осторожно ресуспендирования клеток в 1 мл клеточной буфера (4 × 10 ⁶ клеток / мл). Мера OD ₆₀₀ образца в спектрофотометр с использованием 1 мл клеток , и 1 мл клеточной буфера в виде заготовки. Разлить клетки в одноразовую пластиковую кювету и передать обратно в микроцентрифужных трубку сразу после спектрофотометрии.
6. Для управления нетрансфецированной челл состояние спектра, мягко ресуспендирования нетрансфецированные клеток в 1 мл клеточного буфера с P1,000 пипетку, добавьте 90 мкл клеток в кювете и приобрести FRET спектра при возбуждении 430 нм, полоса пропускания 8 нм, эмиссия 450 - 600 нм, полоса пропускания 4 нм. Соберите 3 - 5 спектров повторных со свежими 90 мкл клеток. Хранить запас клеток при 37 ° С между спецификациями, осторожно ресуспендируют с P1,000 между каждой пробы аликвоту, и прополоскать кювету с сверхчистой H ₂ O между выборками.
7. Для условий эксперимента, аликвотные 90 мкл трансфицированных клеток в каждую из 500 мкл трубок в держателях 2 - 6, 8 - 12 в тепловом блоке. Аккуратно ресуспендирования запас клеток с P1,000 пипеткой между каждой аликвоты.
8. После того, как клетки аликвоты добавляют 10 мкл буфера лекарственных средств в пробирки 2 - 6 для необработанных образцов состояния.
9. Начало эксперимента путем добавления 10 мкл 1 мМ раствора лекарственного средства в трубку 8, запустить таймер на обратный отсчет времени от 10 минут и аккуратно перемешать трубку с P200 пипеткой. Закрыть трубки и возврат к 37° тепла блок C.
10. Сразу возьмите трубку 2, осторожно перемешать с P200 (используйте новый наконечник), добавьте 90 мкл суспензии клеток в необработанном состоянии кювете, и место в флуорометре.
11. Приобретать FRET спектра при возбуждении 430 нм, полоса пропускания 8 нм, эмиссии 450 - 600 нм, полоса пропускания 4 нм.
12. В 9 мин - 10 сек, шип трубки 9 с 10 мкл раствора лекарственного средства 1 мМ, осторожно перемешать с P200 (используйте новый наконечник), и возвратная трубка к теплу блок.
13. Повторите шаги 5.10 - 5.11 с трубкой 3 и 5,12 с трубкой 10.
14. Повторите шаги 5.10 - 5.13 с интервалом в 1 минуту (08:10, 07:10 и т.д.) до тех пор , пока спектры собираются для всех необработанных образцов состояния, и препарат был добавлен для всех образцов состояния лекарственного средства. Используйте свежий наконечник для каждого шага, чтобы предотвратить пипетки перекрестного загрязнения.
15. В 5 мин - 10 сек, начинают смесительная трубка 8 (состояние лекарственного средства) осторожно P200 пипеткой, добавляют 90 мкл клеточной суспензии в отдельной кювете для наркотиков обработанного образца и место в флуорометре.
16. Приобретать FRET спектр (см шаг 5.11 для настройки).
17. Повторите шаги 5.15 - 5.16 с интервалом в 1 минуту (04:10, 03:10 и т.д.) для остальных образцов состоянии наркотическими средствами (трубы 9 - 12).
18. После завершения эксперимента, сохраните файлы проекта, тщательно промыть кюветах с сверхчистого H ₂ O, и повторно запаса труб для следующего состояния. Позаботьтесь, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение в стадии промывки. Изменение наконечник на бутылке H ₂ O, а также на вакуумной линии между промывками.

Анализ 6. Данные

1. Сохранение и файлы экспорта данных в SPC формате, который будет использоваться для анализа. Программы анализа доступны для загрузки с веб-сайта публикации Сиварамакришнан Lab.
2. Создание файлов пути для программного обеспечения для анализа, которые включают программы анализа (V9, V15), нетрансфецированные образцы файлов (шаг 5.6 для нетрансфецированной сбора клеток спектра), файл выходных данных и значений, разделенных запятыми (CSV-файлы) для ввода данных.
3. Введите следующую информациюв CSV - файл (см образец в таблице 3) и назначают соответствующие условия для каждого образца, в том числе:
   Имя файла - отдельные SPC граф файлы
   Рецептор - тестировался Назначенный который GPCR конструкцию (например, Β2)
   Связующее вещество - Назначенный , который был испытан пептидный вариант конструкции (например, S) ,
   Агонист - обозначают необработанной (N) или наркотиков лечение (D) условия
   Directory - папка, в которой путь SPC файлы сохраняются, как правило, организованы по дате
   OD - записывается оптическая плотность образца из спектрофотометра
4. Введите имена файлов для нетрансфецированной образцов (шаг 5.6) вычесть буфер и рассеяние шума из образцов.
5. Введите условия в программу анализа.
6. Запуск программ для анализа образцов в рамках индивидуальных условий (v9) и через условия (v15).
7. Исключить файлы примеров, которые являются очевидными выпадающие в наборе данных, или настроить для вычитания путем увеличения или уменьшения значения ОП Indiviдвойные файлы.
8. Экспорт данных в выходной файл для доступа к вычисленным FRET соотношения (525 нм / 475 нм).
9. Вычислить ΔFRET путем вычитания среднего отношения FRET для необработанного состояния от индивидуальных FRET соотношений для обработанных условий (наркотиков).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Обобщенная схема эксперимента установить и исполнение подробно описана на рисунке 3.

Для того, чтобы обнаружить изменение FRET в узком динамическом диапазоне датчика, важно придерживаться нюансы системы привалировать. Качество клетки является обязательным для ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Плотный динамический диапазон измерений FRET в этой системе усиливает необходимость чувствительного контроля качества на каждом этапе этого протокола. Наиболее важные шаги для обеспечения успешного эксперимента FRET являются: 1) для культивирования клеток, 2) трансфекцию 3) экспрессии бе?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
B2-AR-10 nm-Gas peptide sensor	Addgene	47438	https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Fermentas/Fisher Sci	FERK0503	Elute in 2 mM Tris elution buffer
HEK-293T-Flp-n cells	Life Technologies	R78007
Trypsin (0.25%)	Life Technologies	25200056
DMEM- high glucose	Life Technologies	11960-044	Warm in  37 °C water bath before use
FBS, certified, Heat inactivated, US origin	Life Technologies	10082147
Glutamax I 100x	Life Technologies	35050061
HEPES	Corning	MT25060CL
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	Reduced serum media; Bring to RT before use
XtremeGene HP transfection reagenet	Roche	6366236001	Highly recommended for its consistency. Bring to RT before use
FluoroMax 4	Horiba		Use with FluorEssence V3.8 software
3-mm path length quartz cuvette	Starna	NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5)	May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna
Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump	Fisher Scientific	13-874-826	Warm to 37 °C before use
Thermomixer Heat Block	Eppendorf	22670000	Warm to 37 °C before use
Ultrapure DNA/RNAse free water	Life Technologies	10977015	Use at RT
D(+)-glucose, anhydrous	Sigma	G5767
aprotinin from bovine lung	Sigma	A1153
leupeptin hemisulfate	EMD	10-897
L-ascorbic acid, reagent grade	Sigma	A0278
(-)-isoproterenol (+)-bitartrate	Sigma	I2760	Use fresh aliquot each experiment