Пространственная количественного определения наркотиков в поражении туберкулезом легких лазером захватить Microdissection жидкость хроматографии масс-спектрометрия (LCM-LC/МС)

Резюме

Здесь мы описываем протокол, с помощью лазерного захвата microdissection наряду с анализом LC/MS поддается пространственно-дистрибутивов наркотиков в течение туберкулеза гранулемы. Этот подход имеет широкую применимость для количественного определения концентрации препарата в тканях при высоких пространственных деталей.

Аннотация

Туберкулез по-прежнему является основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Срочно требуются усовершенствования существующих получающим и развитие Роман терапии. Способность дозированная Противотуберкулезных препаратов и стерилизовать бактерий в плохо васкуляризированной некротические регионов (caseum) легких гранулемы имеет решающее значение для успешного терапевтического вмешательства. Поэтому эффективные терапевтические схемы должны содержать наркотиков с благоприятным caseum проникновения свойствами. Текущий LC/MS методы для количественного определения уровень препарата в биологических тканях имеют ограниченные возможности пространственного разрешения, что делает его трудно точно определить абсолютное наркотиков концентрации в секциях малых ткани например, в рамках Некротические гранулемы. Здесь мы представляем протокол, сочетая лазерного захвата microdissection (LCM) регионов патологически различных тканей с квантификацией LC/MS. Этот метод обеспечивает абсолютную количественного определения наркотиков в пределах caseum гранулемы, окружающих клеточных поражений и посторонним легочной ткани и, таким образом, точно определяет, достигаются ли бактерицидные концентрации. Помимо исследования туберкулеза техника имеет множество потенциальных приложений для количественного определения пространственно решена наркотиков в пораженной ткани.

Введение

Способность пространственно решить и количественно оценить уровень препарата является важным требованием для определения, является ли противотуберкулезных препаратов достичь бактериальных субпопуляций в легких поражений в стерилизации концентрации¹. Особое значение, является определение проникновение наркотиков в ядро некротические поражения (так называемый caseum), который обычно содержит наибольшее количество бацилл и могут быть плохо доступны наркотиков из-за отсутствия васкуляризации.

Традиционные методы оценки поражения проникновения, которые включают гомогенизации подакцизным легких повреждений следуют жидкостной экстракции и жидкостной хроматографии масс-спектрометрия (LC/МС) анализа, весьма чувствительны и селективного для препараты интерес. Однако эти методы предлагают бедных пространственной информации, ограничивается размер оригинального гомогенизированные ткани. Массы спектрометрии-подходы на основе изображений, например при содействии матрицы лазерной десорбции ионизации (MALDI)^2,3, десорбции электроспрей ионизации (Дези)⁴ или жидкость повышенной поверхностной добычи^{5, 6} предлагают весьма пространственно решена изображений возможностей, но прямой количественной оценки может быть чрезвычайно сложным или невозможным из-за гетерогенных ионных подавления эффекты и различные эффективность извлечения аналита из различных ячейки или ткани типа⁷. Кроме того наиболее прямым ткани MS изображений подходы являются по своей природе менее чувствительны, чем LC/МС из-за отсутствия хроматографического разделения видов эндогенные, конкурирующих за ионизации и снижению эффективности жидкостной экстракции препарата из ткани.

Лазерная захвата microdissection (LCM) в сочетании с LC/MS анализ обычно применяется для изоляции и характеризуют собственный ткани регионов для протеомических исследований^8,9 и недавно использовали для количественного определения наркотиков в дозированной ¹⁰животных тканей. Здесь мы представляем оптимизированный протокол, применяя LCM, в сочетании с анализом LC/мс (LCM-LC/МС) для количественного определения Противотуберкулезных препаратов в течение различных гранулемы отсеков. В процессе лазерной microdissection захвата УФ лазер направлена через микроскоп цель на разделе ткани, который режет и изолирует области желаемого ткани, следуя пути определяется пользователем. Для гравитации помощь LCM (техника, используемая для этого исследования), в разделе ткани монтируется на тонкой полимерной мембраны слайд (PET или пера) и ткани захватывается в коллекции трубка Крышка, расположенного ниже слайд. Препараты извлекаются из подакцизным ткани и количественно с помощью стандартных подходов LC/MS. Количество ткани, должны быть собраны в конечном итоге определяется от ожидаемой концентрации препарата в ткани и чувствительность метода LC/MS. Для большинства анализ наркотиков дозированной на терапевтических уровней и анализируются с помощью обычной тройной квадрупольным масс-спектрометром, 3 миллиона мкм² (3 мм²) ткани площадь поверхности является достаточным.

Этот протокол описывает мощной комбинацией пространственного профилирования и полной количественной оценки предлагаемых LCM-LC/MS, обеспечивая абсолютную наркотиков концентрации в течение всех отсеков ТБ гранулемы. Техника может также применяться для определения концентрации наркотиков во многих различных больной тканях, предоставление жизненно наркотиков открытие и разработка информации.

протокол

Все исследования на животных были проведены в соответствии с руководством для ухода и использования лабораторных животных национальных институтов здравоохранения с одобрения от институциональный уход животных и использование Комитета NIAID (НИЗ), Бетесда, штат Мэриленд.

1. животных экспериментов и коллекции тканей

Этот раздел протокола описывает животных процедуры и проб в условиях биобезопасности уровня 3 (BSL3). Подробные протоколы микобактерии аэрозоля инфекции процедуры и наркотиками администрации протоколы в кролики были описаны ранее^11,12.

1. Заразить Новой Зеландии белый кролик (мужчин и женщин в 4-5 месяцев) с HN878 микобактерий туберкулеза с помощью носа только аэрозольные системы, как описано ранее¹¹.
2. Администрирование через предпочтительный маршрут выбранного препаратами (этамбутол в примере представлено здесь) и усыпить животных на 2, 6 и 24 ч после приема. Во-первых анестезировать кролика внутримышечно кетамина в 35 мг/кг и ксилазина на 5 мг/кг. Подождите 10 минут и подтвердить надлежащее анестезии, щипать хвост и осторожно касаясь глаза. Если нет никакой реакции, усыпить путем внутривенного введения Пентобарбитал и фенитоин (см. Таблицу материалы) в 1 мл/4,5 кг в 2 мл стерильного физиологического раствора.
   Примечание: Эти timepoints являются оптимальными для покрытия фармакокинетические профиль этамбутол и могут потребовать корректировки/оптимизация для других исследование кала.
3. Используя щипцы, ножницы и/или скальпелем, удалить легкие из грудной полости, иссечения биопсии легких, содержащих большие некротические гранулемы, встроенных в окружающих посторонним легочной ткани (как описано ранее³). Появляться некротические гранулемы в бежевый цвет и обычно немного выступают из окружающих легких красный/розовый. Чтобы облегчить легко cryosectioning, убедитесь, что биопсия не больше, чем 2 х 1,5 х 1,5 см.
4. С помощью щипцов, место биопсии на предварительно помечены cryomold поднос с желаемой режущей поверхности в непосредственном контакте с базой лотка. После замораживания, это обеспечит ровную поверхность, из которого будут сокращены cryosections.
5. Заморозить биопсии в пара жидкого азота. Заполните контейнер из пенопласта на глубину 2 дюйма с жидким азотом и место металлической решетке трубки. Стойки должны выступать над поверхностью жидкого азота, обеспечивая ровную поверхность, на которой размещены лотки ткани. Установите крышку обратно на контейнере пенополистирола и оставить ткани за 10 минут, чтобы полностью заморозить.
6. Удаление ткани лотки, быстро обернуть в фильме алюминия и место в отдельности помечены закрывающейся полиэтиленовых пакетов и печать. Переезд в морозильной камере-80 ° C для хранения.
   Примечание: Шаги 1.1-1.6 выполняются в BSL3 условиях (включая все животные работы и обработки инфицированных органов и тканей). Гамма облучение биопсии легких на 3 Megarads, чтобы включить обработку вне BSL3 сдерживания. Лазерная захвата microdissection нестерилизованных ткани могут проводиться в течение BLS3, Фонд если утвержденных протоколов безопасности находятся в месте. Однако оставшаяся часть настоящего Протокола описывает обработке в объекте BSL-2.

2. ткань секционирование

1. Установите криостата желаемого резки температуру. Передать криостата биопсии легких гамма облучению от-80 ° C для хранения и оставить на 30 минут, чтобы сбалансировать температуры тканей. Примечание: -20 до-22 ° C является оптимальным для ТБ поражения биопсии.
2. С помощью пинцета, исправьте биопсии для криостата Чак, используя небольшое количество оптимального раскроя Температура клея (OCT) присоединиться база ткани для патрона. Ориент ткани, так что плоской поверхности (который был в контакте с базы cryomold) является подвергаются поверхности для резки. Убедитесь, что центр развертывания Office не загрязнять поверхность ткани, как это может помешать с анализа последующих масс-спектрометрии.
3. Вырезать трех разделах ткани на 25 мкм толщина и смонтируйте на PET мембраны слайды. Нежно коснуться мембраны в разделе ткани и удалить. Если слишком много давления применяется, тонкая мембрана может порваться.
   1. Избегайте чрезмерной обработки слайдов до монтажа, как это приведет к PET мембраны, став заряженных и плохой адгезии разделах ткани. Убедитесь, что мембрана слайд хранится при комнатной температуре для включения оттепель монтаж и успешных адгезии ткани, мембраны.
4. Удалить слайд из криостата и дать высохнуть в течение 3 минут. Если не будет немедленно выполнена LCM-LC/MS/MS, печать слайд в герметичном герметичные мешочек и передачи на хранение-80 ° C до тех пор, пока требуется для вскрытия.
5. Вырежьте смежные секции на 10-12 мкм и оттепель гора на слайде стандартного стекла для гематоксилином и эозином (H & E) пятная и ссылки. Дополнительные разделы могут быть сокращены в настоящее время для других желаемых гистохимии пятна (например, Ziehl-Niellsen для визуализации микобактерии туберкулеза (MTB)).

3. Microdissection

1. Удалить запечатанный пакет, содержащий слайд от-80 ° C для хранения и позволяют достичь комнатной температуры за 5 минут.
   Примечание: Если холодной слайд немедленно подвергается воздействию атмосферы лаборатория, ткани будет осаждаться конденсации и пространственная целостность препарата может быть нарушена.
2. Включите микроскоп и лазер (лазер требует 5-10 минут разминки перед началом резки). Загрузить с плоским Кап 0.20 мл ПЦР пробирок в держатель.
3. Удалить слайд из мешка и принимать оптический образ раздела ткани на PET слайд с помощью планшетного сканера.
4. Поместите слайд слайд держатель (ткань лицевой стороной вниз) и назначить конкретные гранулемы регионы интереса, используя микроскоп программного обеспечения раздельного сбора трубок. Как правило, это будет «посторонним легких,» «сотовой гранулемы,» и «caseum» (Некротический центр), но может варьироваться в зависимости от конкретной патологии биопсии гранулемы.
5. Сосредоточиться на ткани, используя 5 X микроскопом цели. Это увеличение должно обеспечивать хороший обзор ткани, содержащие обе области сотовой и некротические гранулемы. В программном обеспечении выберите места для «caseum» для перемещения его в положение под ткань трубки.
6. Введите параметры желаемого рассечение. Типичные параметры для 25 µm толщиной легких секции являются мощность лазера 30, скорость 15 и диафрагмы 35 (условные единицы). Однако они будут отличаться, в зависимости от Микроскоп используется и потенциал снижения мощности из-за возраста лазера.
7. Выберите инструмент «свободного рисования» и с помощью мыши или сенсорного пера, наметить нужного региона для рассечения. Площадь региона будет отображаться в программном обеспечении. Сохраните выбранные регионы под 500 000 мкм² (0,5 мм²) для облегчения легче рассечение. Повторите рассечение 3 миллиона мкм² (3 мм²) было собрано в общей сложности в крышку трубки.
   1. По случаю расчлененный региона могут застрять в окружающие мембраны (например, из-за статических притяжения) и не попадают в коллекции Кап. Удалите эти регионы из накопительного площадь всего, выбирая и удаление вручную в программное обеспечение.
8. Установите крышку для «клеточных поражений» и собирать 3 миллиона мкм² ткани, используя такой же процесс, как указано в шаге 3.7.
9. Установите крышку для «посторонним легких» и собирать 3 миллиона мкм² ткани, используя такой же процесс, как указано в шаге 3.7. Обратите внимание, что посторонним легочной ткани содержит много бронхиол и альвеол запрещено. Обратите особое внимание, чтобы исключить эти определенные ткани регионов для рассечения.
10. Снимите колпачок держателя и тщательно unclip, уплотнение и маркировать каждую пробирку. Защитите расчлененных тканей от окружающего воздуха расстройства (например срыв потока воздуха от открытия двери). Анализировать расчлененных ткани немедленно, или хранить при температуре-80 ° C и оттепели до обработки и анализа LCMS.

4. Добыча и анализ LCMS

1. Подготовьте экстракции раствор 1:1 Ацетонитрил/метанола, содержащие d-10 внутренний стандарт этамбутол. При выборе внутренний стандарт, использовать стабильную форму помечены исследуемое вещество препарата, (такие как дейтерий меченых наб используется в этой демонстрации) с достаточной массы сдвиг чтобы избежать изотоп крест говорить между аналита наркотиков и стандарт (обычно минимум 4 Дальтон) .
   Примечание: Создание стандартов в огневки каждого типа соответствующих ткани трудно, потому что существует весьма ограниченный контроль ткани для создания стандартов огневки. В качестве альтернативы для принятия стандартов с шипами огневки образца стандарт могут быть созданы путем добавления пустой ткани и тест соединения вместе и экстрагирования. Объем контроля ткани в огневки, соответствующий целевой объем разделов исследования образца ткани объединяется непосредственно с количеством составные теста, которые будут присутствовать при данной концентрации.
2. Рассчитать объем целевых тканей, основанные на площадь и толщина ткани секции и определить необходимые разрежения фактор для огневки, используя объем огневки, которые будут добавлены к стандарту и КК образцов. Вычисления ниже для целевой расчлененный области 3 миллиона мкм² (²3 мм) с 25 мкм толщина и 2 мкл объем огневки.
   
   
   
   
3. Предполагая, плотность ткани 1 г/мл, подготовить запас огневки весом 50 мг управления ткани и добавляя PBS буфер для разбавления (с использованием коэффициента разрежения 26.67 огневки рассчитывается на шаге 4.2, растворитель – 1.283 мл). Однородный, бисера, победив легочной ткани и PBS буфер для 5 минут при 1750 об/мин на гомогенизатор шарик.
   
   
4. Разбавьте 1 мг/мл концентрация наркотика запасов в 1:1 Ацетонитрил/воды для создания стандартной кривой пики решения. Определите, пики стандартной концентрации, основанные на Спайк тома и тома ткани. Иллюстрированный пример предназначен для 100 нг/мл, стандартное использование 10 мкл Спайк тома.
   
   
5. Удаление пробирки, содержащие microdissected тканей от-80 ° C для хранения и позволяют достичь комнатной температуры за 5 минут.
6. Добавьте 10 мкл раствора Ацетонитрил/водой 1:1 и 2 мкл буфера PBS в пробирки, содержащие microdissected ткани.
7. Для стандартной кривой и контроля качества труб добавьте 10 мкл пики решение 2 мкл управления легких огневки.
8. Добавьте 50 мкл раствора извлечения каждой трубы.
9. Вихревой каждая трубка для 5 минут, sonicate на 5 минут и центрифуги при 5000 об/мин за 5 минут сформировать лепешки пленки и ткани в каждой тюбике.
10. Передача 50 мкл супернатант 96-луночных штанхглубинных тарелку и разбавляют еще 50 мкл обессоленной воды в каждой скважине.
11. Выполните анализ LC/MS/MS, с помощью оптимизированного инструмента параметров для этамбутола и этамбутол d10 внутренний стандарт (как описано в деталях¹²).
12. Для исправления для точное количество ткани, расчлененный для каждого образца используйте коэффициент разрежения.
    

5. метод проверки

1. Создайте огневки в ткани легкого управления, объединяя 1 часть легких, 2 частей PBS и 3-4 стальных шариков. Beat легочной ткани и PBS буфер для 5 минут при 1750 об/мин, с использованием гомогенизатора шарик.
2. Спайк огневки, добавив 10 мкл 1 мг/мл ДМСО этамбутол складе в 990 мкл огневки для создания конечной концентрации 10000 нг/мл (10 мг/мл) и вихревые за 1 минуту.
3. Создайте блок замороженные огневки, наливая огневки в cryomold и быстро замораживания на сухой лед на 5 минут.
4. Подготовка 25 µm толщиной разделы из блока огневки, как описано в шагах 2.1-2.5.
5. Вскрыть целевой области ткани как указано в шагах 3.2-3.10.
6. Добавление 1:1 10 мкл Ацетонитрил/воды и 2 мкл буфера PBS в пробирки, содержащие microdissected ткани.
7. Добавьте 50 мкл раствора извлечения каждой трубы. Выполните шаги 4.9 4.12 для создания стандартной кривой и определения концентрации препарата в блоке огневки ткани.
8. Расчет эффективности извлечения с помощью формулы ниже:
   

Результаты

На рисунке 1показан обзор подхода LCM-LC/MS. После стерилизации ткани по гамма облучения, все последующие шаги (от ткани секционирование начиная) занять место за пределами BSL3 условий. Рисунок 2 показывает поражения разделов биопсии до и посл...

Обсуждение

Количественная оценка пространственно решена наркотиков в легочного туберкулеза поражений требуется определить, достигает ли воздействия наркотиков для стерилизации концентрации бактериальных популяций, проживающих в различных поражения отсеков. LCM-LC/MS метод, описанный здесь позво...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
New Zealand White rabbits	Covance	N/A
HN878 Mycobacterium tuberculosis	BEI Resources	NR-13647
Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N	Henry Schein Animal Health	56344
Anased (Xylazine) 100 mg/mL	Henry Schein Animal Health	33198
Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution	Virbac	710101
Acetonitrile (LC-MS grade)	Fisher	A955-212
Methanol (LC-MS grade)	Fisher	A456-212
Formic Acid (LC-MS grade)	Fisher	A117-50
Water (LC-MS grade)	Fisher	W6212
0.2 mL flat-cap PCR tubes	Corning	07-200-392
Steel frames, PET-membrane	Leica	11505151
Premium Frosted Microscope Slides	Fisher	12-544-2
96 Deep well plate 2.0ML PP RB	Fisher	NC0363259
Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 μm)	Agilent	820631-001D
"Zipper” Seal Sample Bags	Fisher	01-816-1B
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
CM1850 cryostat	Leica	Discontinued	Leica CM1860 is the current model
Laser Microdissection System 6500	Leica	Discontinued	Leica LMD 6 is the current model
Agilent 1260 Infinity II HPLC	Agilent
API 4000 QTRAP Mass Spectrometer	Sciex