JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем метод для генерации и усиления генетически модифицированные синцитиальный респираторных вирусов (RSVs) и оптимизированной налета assay RSVs. Проиллюстрируем этот Протокол путем создания двух рекомбинантных вирусов, которые соответственно дать количественную оценку данной RSV репликации и жить анализ RSV включения органов и органов включение связанных гранулы динамики.

Аннотация

Применение рекомбинантного вирусов приобрел решающее значение в основных или прикладной вирусологии. Было доказано обратного генетика быть чрезвычайно мощная технология, как расшифровать механизмы вирусной репликации и для изучения противовирусные препараты или предоставить платформу для разработки вакцин для. Строительство и манипуляции обратный генетической системы для отрицательные strand РНК вируса таких респираторно-синцитиальный вирус (RSV), однако, остается нестабильным и требует специального ноу-хау. Геном RSV является одной strand, отрицательные чувство РНК около 15 КБ, который служит в качестве шаблона для вирусной РНК репликации и транскрипции. Наша система обратной генетики использует cDNA копию генома человека RSV длинные штамм (HRSV). Этот cDNA, а также cDNAs кодирования вирусные белки комплекс полимеразы (L, P, N и м2-1), помещаются в отдельные выражения векторов под T7 полимеразы управляющие последовательности. Трансфекция этих элементов в ЧКР-T7/5 клеток, которые стабильно Экспресс T7 полимеразы, позволяет цитоплазматических репликации и транскрипции рекомбинантных RSV, рождая генетически модифицированных вирионов. Новый RSV, которая присутствует на поверхности клеток и в надосадке культуры BSRT7/5, собирается для того, чтобы заразить клетки человека HEp-2 для амплификации вирусной. Два или три круга усиления необходимы для получения вирусных запасов, содержащих 1 x 10-6 до 1 x 107 металлическ формируя единиц (ОРП) / мл. Здесь подробно описаны методы для оптимального сбора урожая, замораживания и титрование вирусных запасов. Мы иллюстрируем протокола, представленные здесь, создав две рекомбинантных вирусов, соответственно выражая бесплатно Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) (RSV-GFP) или вирусный м2-1 сливается с GFP (RSV-м2-1-ГФП). Мы покажем, как использовать RSV-GFP квантифицировать RSV репликации и RSV-м2-1-GFP визуализировать вирусный структур, а также динамика вирусных белков в живой клетке, с использованием методов видео микроскопии.

Введение

RSV человека является основной причиной госпитализации для острой инфекции дыхательных путей в младенцев во всем мире1. Кроме того RSV ассоциируется с существенной заболеваемости в сопоставимых с гриппом, с большинством госпитализации и бременем смертности в пожилых2взрослых. Не существует вакцины или конкретных противовирусные препараты доступны еще против RSV, но перспективных новых препаратов находятся в развития3,4. Сложности и тяжести методы количественной оценки RSV умножения затрудняют поиск противовирусные препараты и вакцины, несмотря на значительные усилия, прилагаемые. Количественная оценка RSV умножения в пробирке обычно основана на трудоемкий, длительным и дорогостоящим методы, которые состоят главным образом в анализе цитопатического эффекта микроскопии, иммуноокрашивания, сокращение зубного налета анализов, количественные обратной транскриптазы (qRT)-полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноферментного анализа тестов. Вирусы с модифицированных геномов и выражая репортер генов, например кодирования для GFP, являются более подходящими для таких фильмов. В сочетании с использованием автоматизированных пластины читателей, Репортер ген нося рекомбинантных вирусы могут сделать эти анализы больше подходит для целей стандартизации и высок объём.

RSV является запечатанным, палочкоядерных отрицательный смысл РНК вирус, который принадлежит к роду Orthopneumovirus из Mononegaviralesсемьи, порядок Pneumoviridae ,5. Геном RSV является одной strand, отрицательные чувство РНК около 15 КБ, который содержит некодирующей региона на 3 и 5' конечностей, назвал лидера и трейлер и 10 transcriptional единиц кодирования 11 белков. Гены упорядочиваются следующим: 3'-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, м2 (кодировка для белков м2-1 и м2-2) и L-5'. Геномной РНК плотно упакованы, Нуклеопротеиды N. Using encapsidated геномной РНК как шаблон, вирусной РНК зависимой РНК-полимеразы (RdRp) обеспечит транскрипцию и репликацию вирусной РНК. Вирусных RdRp состоит из большой белка L, который осуществляет действие полимеразы нуклеотида таковой, ее обязательной кофактор фосфоропротеид P и м2-1 белок, который функционирует как вирусный транскрипции фактор6. В инфицированных клетках RSV индуцирует образование цитоплазматических включений, называется включением органов (IBs). Морфологически похожие цитоплазматических включений было отмечено несколько Mononegavirales7,8,9,10. Недавние исследования на вирус бешенства, вирус везикулярного стоматита (ВСВ), вирус Эбола и RSV, показал, что синтез вирусной РНК происходит в IBs, которые таким образом могут рассматриваться как вирусные фабрики8,9,11, 12. вирус фабрики сконцентрировать РНК и вирусные белки, необходимые для синтеза вирусной РНК и также содержат клеточных белков13,14,,1516, 17. IBs выставлять функциональный subcompartment, называется IB-связанные гранулы (IBAGs), которые концентрируют вновь синтезированный зарождающейся вирусный мРНК вместе с белком м2-1. Геномной РНК и L, P и N не обнаруживаются в IBAGs. IBAGs являются небольшие динамические сферических структуры внутри IBs, которые демонстрируют свойства жидкого органеллы12. Несмотря на центральную роль IBs в Вирусный умножения очень мало известно о природе, внутренняя структура, формирования и функционирования этих вирусные фабрики.

Выражение геном полиовируса из cDNA включено производство первых инфекционные вирусные клон в 1981 году18. Для отрицательных в одноцепочечной РНК-вирусов было не до 1994 года производство первого вируса бешенства, после трансфекции плазмид в клетки19 имели место. Первый на основе плазмида обратный генетической системы для RSV был опубликован в 1995 году20. Обратный генетики привели к крупным достижениям в области вирусологии. Возможность внесения конкретных изменений в вирусного генома предоставил критических идеи на репликации и патогенеза РНК-вирусов. Эта технология также значительно облегчило разработку вакцин, позволяя конкретных затухания через целевые серии модификаций. Изменения генома, позволяя быстрое количественного определения вирусных умножения значительно улучшена антивирусной проверки и изучения режима их действий.

Хотя ранее описанных, получение генетически модифицированных RSVs остается нестабильным. Здесь мы подробно протокол для создания двух типов рекомбинантных HRSV, соответственно, выражая RSV-GFP или RSV-м2-1-GFP. В этом протоколе мы описываем трансфекции условия, необходимые для спасения рекомбинантных новых вирусов, а также их усиления для получения вирусных запасов с высокий титр, подходит для воспроизводимых экспериментах. Строительство векторов обратной генетики per se не описано здесь. Мы описывают методы для оптимального сбора урожая и замораживание вирусных запасов. Наиболее точным методом для количественного определения вирусных инфекционных частиц остается assay металлической пластинкы. Клетки инфицированные серийных разведений анализируемого подвески и инкубировали с накладкой, который запрещает распространение свободных вирусных частиц в надосадке. В таких условиях вирус будет только заразить смежных ячеек, образуя «налет» для каждой первоначальной инфекционные частицы. В обычных assay титрования RSV бляшками выявлены, иммуноокрашивания и учитываются в микроскопические наблюдения. Этот метод является дорогостоящим и трудоемким. Здесь мы описали очень простой протокол для assay металлической пластинкы RSV, используя микрокристаллическая оверлея, который позволяет образованию бляшек, видимых невооруженным глазом. Мы покажем, как RSV-GFP может использоваться мера RSV репликации и, таким образом, для количественной оценки воздействия противовирусных препаратов. Сочетание обратной генетики и живой технологии визуализации, мы демонстрируем, как RSV-м2-1-GFP позволяет ученым визуализировать м2-1 в живых клеток и следовать за динамику внутриклеточная вирусная структур, таких как IBs.

протокол

1. Подготовка

  1. Приобрести мобильные средства массовой информации (сокращение сыворотке СМИ, минимум основных СМИ [мкм], 10 x MEM и Дульбекко модифицированная орла средних [DMEM]), transfection реагента и микрокристаллическая целлюлоза (см. Таблицу материалы).
  2. Получить следующую векторов обратной генетики: геномной vector(s) и векторы выражения, кодирование N белка и сложные протеины полимеразы. Геномный векторы содержат полный cDNA геном RSV-GFP (p-RSV-GFP) и RSV-м2 1GFP (p-RSV-м2 1GFP) вниз по течению от бактериофага Т7 РНК полимеразы (T7 pol) промоутер. Векторы выражения (как p-N, p -P, p-L и p м2-1) содержат кодирующая последовательность N, P, L или м2-1 вниз по течению Поль T7 (см. Rincheval et al.12 и21 Rameix-Уэлти et al. для подробной информации относительно плазмидные конструкции).
  3. Подготовьте СМИ для клеточной культуры в стерильных условиях и для transfection и инфекции. Использование DMEM с 2 мм L-глютамин дополнены с 10% плода телячьей сыворотки (FCS), 1000 единиц/мл пенициллина и стрептомицина 1 мг/мл (или без антибиотиков) и MEM с 2 мм L-глютамин дополнена 0%, 2% или 10% FCS, 1000 единиц/мл пенициллин и 1 мг/мл стрептомицин, как «полного среднего» в следующий протокол.
  4. Получить BSRT7/522 клетки и запасов в полного среднего, дополнена 10% диметилсульфоксида (ДМСО) на 1-2 х 106 клеток/мл. Сохранение запасов клеток в жидком азоте. Получите HEp-2 клетки. Культура клетки BSRT7/5 в полной DMEM и HEp-2 клетки в полной MEM при 37 ° C и 5% CO2 в стерильных условиях.
  5. Приготовляют 10 x RSV сохранения раствор (0,5 М HEPES и 1 М MgSO4 [pH 7.5] в воде) в стерильных условиях.
  6. Получите Перевернутый флуоресценции микроскопа совместимы с измерений флуоресценции GFP и совместимы с живой изображений, если это необходимо контролировать инфекцию. Получите Считыватель микропланшетов совместим с GFP измерений флуоресценции для количественный RSV-GFP репликации.

2. спасение и первый проход рекомбинантных вируса

Примечание: Выполните все следующие действия в стерильных условиях, используя класс безопасности II кабинета.

  1. За день до трансфекции, сделать подвеска клеточной линии BSRT7/5 на 5 x 105 клеток/мл в полной средней. Распространение 2 мл суспензии клеток в колодец в пластине 6-хорошо. Один хорошо за вирус, что собирается быть спасены и один дополнительный хорошо подготовиться отрицательного контроля. Инкубируйте пластины при 37 ° C и 5% CO2. Убедитесь, что клетки при впадении в 80 – 90% следующий день.
  2. Разморозить обратной генетики векторов (с шагом 1,2) p-RSV-GFP и p-RSV-м2-1-GFP, а также p-N, p -P, p-L и p м2-1. Mix, для каждого вируса, чтобы спасти, 1 мкг p-N и p -P, 0,5 мкг p-L, 0,25 мкг p-м2-1 и 1,25 мкг p-RSV (GFP или м2-1 GFP) в трубку.
    Примечание: Могут использоваться различные выражения векторов для N, P, L и м2-1; Однако соотношение белков должен быть сохранен. Выполните отрицательный контроль, заменив вектора p-RSV пустой вектор.
  3. Перейти к трансфекции, после протокол transfection реагент производителя (см. таблицу материалы).
    1. 250 мкл сокращение сыворотке среднего, к смешанной векторов. В другой трубки развести 10 мкл Реагента трансфекции в 250 мкл сокращение сыворотке среды. Аккуратно вихревых труб и подождать 5 минут смеси содержимое обоих труб и ждать 20 минут при комнатной температуре.
    2. Промыть BSRT7/5 клеток с 1 мл среды сокращение сыворотке и распространять 1,5 мл MEM с 10% FCS без антибиотиков в колодец. При необходимости, Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2 , до завершения инкубации, описанные в шаге 2.3.1.
    3. 500 мкл трансфекции смеси, подготовленную на этапе 2.3.1 в колодец, когда закончится время инкубации 20 мин. Место клетки в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2 на 3 дня. Не изменяйте культуры средних клеток во время transfection.
  4. Соблюдать GFP флуоресцирования (возбуждение 488 нм) и выбросов на 515-535 Нм под Перевернутый флуоресцентным микроскопом при 20-кратном 1 x в день для контроля эффективности спасательных, с использованием GFP фильтр.
  5. На второй день после трансфекции семян клетки для первого прохода спасли вирусов. Готовят суспензию клеток Нер-2 на 5 x 105 клеток/мл в полной среды. Распространение 2 мл суспензии клеток в колодец в 6-ну пластине (один хорошо за вирус для спасения и один отрицательный контроль).
  6. На третий день трансфекции, скретч клеток в каждой скважине transfected пластины 6-хорошо BSRT7/5, с помощью различных скребок для каждой скважины. Перенесите каждый хорошо содержания (клетки и супернатант) в стерильные 2-мл пробирку microcentrifuge. Вихревой каждой трубки энергично для по крайней мере 30 s выпустить спасли вируса от клеточных мембран.
    Примечание: Это соответствует прохода 0 (P0) спасли вируса (рис. 1).
  7. Используйте свежие вирусный P0 подвеска для выполнения первые усилители спасли вирусов.
    1. Удаление питательной среды от пластины 6-ну HEp-2 семенами накануне (см. шаг 2.5) и быстро 500 мкл суспензии P0 (от шага 2.6) в хорошо. Место пластину HEp-2 при 37 ° C на Качели балансир рокер для мягкой агитации за 2 ч.
    2. Удалить и сбросить 500 мкл посевным материалом и добавить 2 мл MEM с 2% FCS. Инкубируйте пластины при 37 ° C и 5% CO2 на 3 дня. Это позволит производить первый проход (P1) спасли вирусов (рис. 1).
  8. Добавьте 1/10 объема 10 x RSV сохранения раствора (0,5 М HEPES и 1 М MgSO4 [pH 7.5]) в оставшихся P0 подвеска (из шага 2.6). Вихревой пробирок энергично для 5 s и Алиготе содержание в криогенных трубки помечены с алкоголем стойкие метки. Погружать трубы для по крайней мере 1 час в спирте, охладить в-80 ° C и хранить их в-80 ° C.
  9. Титруйте P0 запасов (см. шаг 2.6) каждого спасли вируса (см. раздел 4 для титрования целлюлоза микрокристаллическая).
  10. Наблюдаю GFP флуоресцирования (возбуждение 488 нм) и выбросов на 515-535 Нм клеток Нер-2 инфицированных P0 подвеска под Перевернутый флуоресцентным микроскопом при 20-кратном 1 x в день контролировать инфекцию. Наблюдать под микроскопом brightfield появление мелких syncytia и клеточной отряд, который отражает RSV цитопатогенного эффекта (CPE) (см. Рисунок 2).
  11. Обратите внимание, что спасение не если флуоресценции ни CPE виден после 2-3 дня.
  12. Соберите первый проход (P1) на день 3 или 4, как описано в пункте 2.6. Вкратце скрести ячейкам, собирать клетки и супернатант вместе, вихревой их, добавить решение сохранения, как описано в шаге 2.8, аликвота образца и заморозить ее.
  13. Титруйте (см. раздел 4 для титрования assay) и усилить первый проход (см. раздел 3 для усиления).

3. усиление спасли вирусов

Примечание: Следующий протокол описывает амплификации спасли вирусов в колбе2 75 см. Адаптировать колбу размер тома необходимо и необходимые кратность инфекции (МВД). Таблица 1 показывает томов для различных колбы. Выполните все следующие действия в стерильных условиях в класс безопасности II кабинета.

  1. Готовят суспензию клеток Нер-2 на 5 x 105 клеток/мл в полного среднего, за день до усиления. Распространять 15 мл суспензии клеток за флакон2 75 см и инкубировать и фляги при 37 ° C и 5% CO2. Подготовьте один флакон за вирус для того чтобы усилить.
  2. На следующий день после начала инкубации, проверьте, что клетки являются 80%-100% притока.
  3. Разбавьте вирусный подвеска из шага 2.12 в MEM без FCS для получения 3 мл суспензии на 50000 ОРП/мл (соответствует MOI 0.01 ОРП/ячейки).
  4. Удалите носитель и быстро добавить вирусный подвеска 3 мл. Место настой при 37 ° C на Качели балансир рокер для мягкой агитации за 2 ч.
  5. Удалить и сбросить посевным материалом и добавляют 15 мл MEM с 2% FCS. Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2 на 2-4 дней.
  6. Проверьте морфологии клеток и флуоресценции ГФП (возбуждение 488 нм) и выбросов на 515-535 Нм под Перевернутый флуоресцентным микроскопом при 20-кратном для того, чтобы оценить время урожай вирусов. Обратите внимание, что это, как правило, когда 50%-80% слоя клеток Нер-2 отсоединяется за CPE RSV, что происходит между 48 и 72 ч postinfection (ИП) (см. рис. 3).
  7. Очистите все клетки, клетки скребком. Соберите клетки и супернатант и передавать их на 50 мл пластиковых пробирок.
  8. Добавьте 1/10 объема 10 x RSV сохранения раствора (0,5 М HEPES и 1 М MgSO4 [pH 7.5]). Вихревой трубы энергично для 5 s и уточнить подвеска центрифугированием 5 мин на 200 x g.
  9. Передать супернатант Тюбик 50 мл. Вихревой кратко и Алиготе подвеска в криогенных трубки помечены с алкоголем стойкие метки. Погружать труб в помощи-80 ° C алкоголя для по крайней мере 1 час и хранить их в-80 ° C.
  10. Размораживать один из аликвоты к Титруйте вирусный подвеска (см. раздел 4).

4. доска титрования Assay

  1. Подготовка 12-ну пластины для титрования за день до титрования генотипирования (шесть скважин будет необходимо Титруйте одной трубы вируса). Семя колодцы с 1 мл клеток Нер-2 на 5 x 105 клеток/мл в полной среды.
  2. Следующий день, подготовить стерильные микрокристаллическая подвеска (2,4% [w/v] в воде) (см. таблицу материалы).
    1. Разогнать 2.4 g порошка микрокристаллической целлюлозы в 100 мл дистиллированной воды, с использованием стандартной магнитной мешалкой, до полного растворения порошка (обычно 4-12 ч). Автоклав подвеска при 121 ° C 20 мин и хранить при комнатной температуре перед использованием.
      Примечание: В таких условиях подвеска является стабильным на 1 год.
    2. После открытия решения в стерильных условиях, храните его при температуре 4 ° C 6 месяцев. Всегда смешивайте подвеска перед использованием (, рукопожатия или vortexing) чтобы убедиться, что это однородной.
  3. Подготовьте 2 x мем в стерильных условиях. Разбавить коммерческих MEM 10 x с стерильной водой и добавить L-глютамина, 1000 единиц/мл пенициллина и стрептомицина 1 мг/мл. Встряхнуть разбавления и хранить при 4 ° C.
    Примечание: Выполните шаги 4.4 – 4.10 в стерильных условиях с помощью класса II безопасности кабинета.
  4. Подготовьте шесть пробирки, содержащие 900 мкл MEM без FCS на вирус, чтобы быть титруют (титрование трубки). Оттепель вирус аликвоты, вихревой их энергично за 5 сек и передачи 100 мкл до первого титрования трубки.
  5. Выполните десятикратно разрежения 6 x, как показано ниже. Добавьте 100 мкл вируса до 900 мкл среды в первой трубе, наденьте крышку на трубе и смешать ее содержимое, vortexing на несколько секунд. Изменить кончик на пипетку, 100 мкл первого разбавления до 900 мкл среды в второй трубе, наденьте крышку на трубу и вихрь. Повторите процедуру до шестого трубки.
    Примечание: Это очень важно изменить кончик для каждого разведения.
  6. Напишите вирус имя и фолд разведений на Нер-2 12-ну пластины. Добавьте знак соответствует пластину и ее обложке, потому что они могут быть разделены во время окрашивания (шаг 4.9). Удалите носитель из пластин и распространять 400 мкл одного разрежения в колодец. Инкубируйте пластины при 37 ° C на 2 ч для адсорбции вирус.
    Примечание: Измените наконечник пипетки между каждой посевным материалом или перейти от низкой к высокой концентрации с тот же Совет. Прививать ограниченной серии плит (1-2) одновременно, чтобы избежать высыхания клетки.
  7. Подготовьте микрокристаллическая оверлея при адсорбции вирус (импровизированный подготовка). Чтобы получить 100 мл оверлея, Смешайте 10 мл 2,4% целлюлоза микрокристаллическая подвески, 10 мл 2 x MEM и 80 мл MEM с 2% FCS.
    1. Отрегулируйте пэ-аш 2 x MEM около 7,2 с стерильных бикарбоната натрия раствор 7,5%, после цвет индикатора. Добавьте микрокристаллическая подвеска и MEM и смесь энергично.
  8. В конце 2 ч инкубации добавьте 2-3 мл оверлея в каждой скважине 12-ну плит без удаления посевным материалом. Будьте осторожны избежать заражения соседних скважин с высокой вирусной титр Инокулянты. Инкубируйте пластины при 37 ° C и 5% CO2 на 6 дней. Не двигаться пластину и не перемещайте инкубатора во время инкубации.
  9. Перейти к запятнать клетки, с помощью решения кристалл фиолетового (фиолетовый кристалл 8% [v/v], 2% формальдегида [v/v] и 20% этанола [v/v] в воде).
    1. Защита рабочей поверхности биобезопасности, кабинет с листа (фиолетовый кристалл сильно цвета поверхностей).
    2. Осторожно встряхните пластины снимать микрокристаллическая оверлея. Удаление supernatants и вымыть клетки 2 x 1 x фосфат амортизированное saline (PBS). Обработки пластин по одному во избежание высыхания клетки. Добавить 1-2 мл раствора Фиолетовый Кристалл и подождите 10-15 мин удалить решение, которое может быть повторно использован для последующих пластины пятнать.
    3. Погружать пластины и крышки в свежих отбеливателя на несколько секунд и затем вымыть их с водопроводной водой. Обратите внимание, что пластины и охватывает обеззараживания от отбеливателя.
    4. Поместите пластины и крышки на бумажных полотенцах и дайте им высохнуть. Сухие пластины при окружающей температуре после ополаскивания водой и хранить их при комнатной температуре. Для длительного хранения (месяцев), Держите пластины, защищенном от света, чтобы защищать цвета. Обратите внимание, что если клетки теряют их окраски, они могут быть окрашены снова с Фиолетовый Кристалл.
  10. Вычислите вирус титры. Граф бляшек в скважинах сухой плиты, которые видны невооруженным глазом. Убедитесь, что количество металлических пластинк в различных разведениях последовательной (фактор 10 между каждого разведения). Выберите хорошо, на котором таблички являются самыми простыми рассчитывать. Оцените количество металлических пластинк против тома посевным материалом и разрежения.
    Примечание: На пример, приведенный на рисунке 421 бляшек, учитываются при разбавлении 10-5 . Они соответствуют титр
    figure-protocol-14683
    figure-protocol-14750

5. Использование HRSV-GFP рекомбинантных вируса для мониторинга репликации вируса в клетках, обработанных с малые интерферирующие РНК или противовирусные препараты

Примечание: Выполните все действия за исключением 5.1 и 5.2.5 в стерильных условиях с помощью класса II безопасности кабинета.

  1. Контроль за эффектом клеточных генов, глушителей на RSV умножения
    Примечание: Протокол transfection зависит реагент (см. Таблицу материалы).
    1. Подготовьте 96-луночных пластины для измерения GFP. За два дня до assay, учитывая малые интерферирующие РНК (siRNA), подготовить раствор сокращение сыворотке сред, содержащих малых интерферирующих РНК в концентрации 100 Нм и siRNA трансфекции реагент разбавлять на 1/500. Инкубируйте решение для 30 мин при комнатной температуре.
    2. Добавьте 25 мкл раствора к добрам плиты, подготовленный в 5.1.1 (в трех экземплярах). Семя колодцы с 75 мкл суспензии клеток A549 в 4 x 105 клеток/мл в полной среды без антибиотиков для получения окончательного ячейки концентрации 3 x 105 кл/мл. Инкубируйте пластину для 48 ч при 37 ° C и 5% CO2.
      Примечание: Окончательный siRNA концентрация составляет 25 Нм и окончательный трансфекции объем реагента – 0.5 мкл/хорошо).
    3. Заразить клетки следующим образом. Удалите носитель из скважин. Добавьте 100 мкл суспензии RSV-GFP в 50000 ОРП/мл и проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C и 5% CO2. Удаление вирусный подвеска и 100 мкл DMEM с 2% FCS и без фенола красного. Инкубируйте пластины при 37 ° C и 5% CO2.
    4. На 24 часа и 48 h п.и., измерения флуоресценции, используя spectrofluorometer набор для возбуждения и выбросов волны 488 и 520 Нм, соответственно (флуоресценции выражается в единицах относительной флуоресценции). Использование noninfected A549 клетки как стандарты для флуоресценции и фоновый уровень.
      Примечание: Клетки должны быть исправлены с параформальдегида 4% (PFA) перед началом измерения их без плиты покрытия.
  2. Оценка с помощью RSV-GFP ингибирования наркотиков
    1. Подготовьте 96-луночных пластины для измерения GFP. За день до assay, семя колодцы с 100 мкл суспензии клеток Нер-2 на 5 x 105 клеток/мл в полной среды без фенола красного.
    2. Подготовьте серийный разбавление испытанные препараты (AZ4316 в этом примере) в MEM, дополняется 2% FCS и антибиотики (50 мкл на хорошо). Подготовьте вирусный подвеска на 10000 ОРП/мл в MEM без стромальные сосудистый фактор (СФДВ) и фенола красного (50 мкл на хорошо).
    3. Удалите носитель из 96-луночных HEp-2 пластины и добавьте 50 мкл суспензии препарата и 50 мкл вирусный подвеска (в трех экземплярах). Выполните пробный инфекции параллельно как элемент управления.
      Примечание: Разбавления наркотиков и вирусных подвески могут быть смешаны перед их добавлением на клетки, или они могут быть добавлены последовательно.
    4. Инкубируйте пластину для 48 ч при 37 ° C и 5% CO2.
    5. Измерьте флуоресценции, используя spectrofluorometer, как описано в шаге 5.1.4. Используйте макет инфицированных клеток Нер-2 в качестве стандартов для флуоресценции фоновых уровней.

6. характеристика м2-1 локализации в Vivo с RSV-м2-1-GFP рекомбинантных вирус

Примечание: Выполните действия 6.1 и 6.2 в стерильных условиях, используя класс безопасности II кабинета.

  1. Готовят суспензию клеток Нер-2 на 5 x 105 клеток/мл в полной среды. Семя 1,5 мл суспензии клеток в 35 мм Петри permeant CO2 и адаптирован для жить изображений.
  2. Выполните инфекции на следующий день после посева с вирусом RSV-м2-1-ГФП в MOI 1, как описано в шагах 3.3-3.5 (удалить носитель, 500 мкл до 1 мл посевным материалом и инкубации образца при 37 ° C во время нежно тряска 2 h; удалить посевным материалом и добавить 1,5 мл MEM с 2 % FCS). Инкубируйте клетки при 37 ° C и 5% CO2 на требуемое время (IBs начнут появляться от 10 h п.и.).
  3. Разогрейте инкубации палаты инвертированным микроскопом с 40 x 100 x целей при 37 ° C, до размещения Петри, содержащие зараженные клетки на сцене. Открыть подачу CO2 и ждать фокус стабилизации.
  4. Выполнение визуализации с фильтрами GFP-совместимых, под возбуждения низкой интенсивности и изображения частоты (от 1 до 0,1 изображений в минуту) для сведения к минимуму Фототоксичность.

Результаты

В этой работе мы описали подробный протокол производить рекомбинантные RSV вирусов, выражая флуоресцентный белок (рис. 2). В pRSV-GFP гена GFP была введена между P и M генов, как описано для вишни гена в ранее опубликованной работе21. В pRSV м2-1-GFP м2 ген б...

Обсуждение

Здесь мы представляем метод спасения рекомбинантного RSVs из пяти плазмид и их усиление. Возможность манипулировать геном вируса революционизировало вирусологии исследования для тестирования мутации и выразить дополнительных гена или тегами вирусного белка. RSV мы описал и используетс...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы благодарят д-р Юй Цинь от компании АстраЗенека R & D Бостон, MA, США, за предоставление AZD4316 наркотиков. Авторы благодарны Cymages платформу для доступа к Микроскоп ScanR Olympus, которое было поддержано гранты от региона Иль (DIM один здоровья). Авторы признают поддержки от INSERM и Университет Версаль Сен-Кантен.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm µ dish for live cell imagingIbidi81156
A549ATCCATCC CCL-185
Avicel RC-591FMC BioPolymerAvicel RC-591Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent.
BSRT7/5not commercially availableSee reference 22. Buchholz et al. 1999
Crystal violet solutionSigmaHT90132
Fluorescence microscope for observationsOlympusIX73 Olympus microscope
Fluorescence microscope for videomicroscopyOlympusScanR Olympus microscope
HEp-2ATCCATCC CCL-23
HEPES ≥99.5%SigmaH3375
L-Glutamine (200 mM)ThermoFisher Scientific25030024
LIPOFECTAMINE 2000 REAGENTThermoFisher Scientific11668019Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent.
MEM (10x), no glutamineThermoFisher Scientific11430030
MEM, GlutaMAX SupplementThermoFisher Scientific41090-028
MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5%SigmaM7506
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermoFisher Scientific51985-026
Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM GradeElectron Microscopy Sciences15714
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
Plasmidsnot commercially availableSee reference 21. Rameix-Welti et al. 2014
See Saw RockerVWR444-0341
Si RNA GAPDHDharmaconON-TARGETplus siRNA
D-001810-10-05		SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.
Si RNA IMPDH2DharmaconON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human
L-004330-00-0005		SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.
Individual references and sequences
J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA;
J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC;
J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU;
J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;
Si RNA RSV NDharmaconON-TARGETplus custom siRNAUUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA
SiRNA NTDharmaconON-TARGETplus Non-targeting Pool
SiRNA transfection reagentDharmaconDharmaFECT 1 Ref: T-2001-03Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent.
Sodium Bicarbonate 7.5% solutionThermoFisher Scientific25080094
SpectrofluorometerTecanTecan infinite M200PRO

Ссылки

  1. Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
  2. Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults. The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).
  3. DeVincenzo, J. P., et al. Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).
  4. DeVincenzo, J. P., et al. Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).
  5. Afonso, C. L., et al. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016. Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).
  6. Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).
  7. Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).
  8. Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions. PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958 (2010).
  9. Lahaye, X., et al. Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication. Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).
  10. Kolesnikova, L., Mühlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions. Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).
  11. Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment. European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).
  12. Rincheval, V., et al. Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus. Nature Communications. 8 (1), 563 (2017).
  13. Santangelo, P. J., Bao, G. Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).
  14. Lifland, A. W., et al. Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS. Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).
  15. Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein. Virology. 195 (1), 243-247 (1993).
  16. Brown, G., et al. Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection. Virology. 338 (1), 69-80 (2005).
  17. Radhakrishnan, A., et al. Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).
  18. Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
  19. Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).
  20. Collins, P. L., et al. Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).
  21. Rameix-Welti, M. -. A., et al. Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice. Nature Communications. 5, 5104 (2014).
  22. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).
  23. Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).
  24. Derscheid, R. J., et al. Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells. Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).
  25. McKimm-Breschkin, J. L. A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus - direct visualization of plaques without immunostaining. Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).
  26. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 7, 1-7 (2006).
  27. Novina, C. D., Sharp, P. A. The RNAi revolution. Nature. 430 (6996), 161-164 (2004).
  28. Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. The structure of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors. Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).
  29. Beaucourt, S., Vignuzzi, M. Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance. Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).
  30. Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).
  31. Simões, E. A. F., et al. Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children. Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).
  32. Alvarez, R., et al. RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).
  33. DeVincenzo, J., et al. A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).
  34. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  35. Nikolic, J., et al. Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles. Nature Communications. 8 (1), 58 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

146

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены