В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы демонстрируем неинвазивный метод оценки сократительной способности кардиологического медицинского устройства с использованием 2D-монослоев индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSC-CM), нанесенных на гибкую подложку, в сочетании с видеомикроскопией. Этот инструмент будет полезен для оценки in vitro сократительных свойств аппаратов электрофизиологии сердца.

Аннотация

Индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-CM), в настоящее время исследуются для многократного применения in vitro и используются в нормативных документах. Здесь мы расширяем их использование для оценки безопасности или производительности кардиологических устройств. Мы разработали новый метод оценки сократительных свойств кардиологических медицинских устройств в надежно сокращающихся монослоях 2D hiPSC-CM, нанесенных на гибкую гидрогелевую подложку на основе внеклеточного матрикса (ECM). Этот инструмент позволяет количественно оценить влияние сигналов устройства электрофизиологии сердца на сердечную функцию человека (например, сократительные свойства) с помощью стандартного лабораторного оборудования. Монослои 2D hiPSC-CM культивировали в течение 2-4 дней на гибкой гидрогелевой подложке в 48-луночном формате.

hiPSC-CM подвергались воздействию стандартных электрических сигналов медицинских устройств модуляции сократимости сердца (CCM) и сравнивались с контрольными (т.е. только кардиостимуляцией) hiPSC-CM. Базовые сократительные свойства 2D hiPSC-CM были количественно определены с помощью анализа обнаружения на основе видео, основанного на смещении пикселей. Стимулированные CCM 2D hiPSC-CM, нанесенные на гибкую гидрогелевую подложку, продемонстрировали значительно улучшенные сократительные свойства по сравнению с исходным уровнем (т.е. до стимуляции CCM), включая увеличенную амплитуду пикового сокращения и ускоренную кинетику сокращения и релаксации. Кроме того, использование гибкого гидрогелевого субстрата позволяет мультиплексировать показания связи сокращения сердца на основе видео (т.е. электрофизиологии, обработки кальция и сокращения) у здоровых и больных hiPSC-CM. Точное обнаружение и количественная оценка влияния сердечных электрофизиологических сигналов на сокращение сердца человека имеет жизненно важное значение для разработки, оптимизации и снижения рисков кардиологических медицинских устройств. Этот метод обеспечивает надежную визуализацию и количественную оценку сократительных свойств сердечного синцития, что должно быть ценным для доклинических испытаний безопасности или эффективности кардиологических медицинских устройств. В этой статье подробно описана методология создания 2D монослоев гидрогелевых субстратов hiPSC-CM.

Введение

По мере старения населения Соединенных Штатов число пациентов с сердечной недостаточностью продолжает расти, наряду с прямыми медицинскими расходами 1,2. Существует острая необходимость в разработке новых методов лечения сердечной недостаточности и инновационных доклинических методологий для тестирования таких методов лечения. Индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-CM), были предложены в качестве инструмента in vitro для помощи в процессе разработки терапевтических препаратов и использовались в нормативных документах 3,4. Однако их широкое использование было ограничено для исследований сократительной способности из-за отсутствия надежных сократительных свойств при нанесении на покрытие в стандартных жестких условиях 2D-культивирования (т.е. в обычном пластике или стекле для культивирования тканей)5,6,7,8. Ранее мы продемонстрировали полезность нанесения изолированных одиночных hiPSC-CM на гибкую гидрогелевую подложку для получения надежных видимых сократительных свойств9. Мы показали, что изолированные hiPSC-CM обладают сравнимыми сократительными свойствами с таковыми у свежевыделенных кардиомиоцитов желудочков взрослых кроликов. Кроме того, мы продемонстрировали полезность этого метода для оценки сократительных реакций на фармакологические средства7. Кроме того, в других исследованиях эта технология применялась к механистическим оценкам для фундаментальной науки и моделирования заболеваний10,11,12. Здесь эта методология была распространена на монослои 2D hiPSC-CM, и продемонстрирована ее полезность для оценки физиологически значимых электрических сигналов медицинского устройства модуляции сократимости сердца (CCM) in vitro.

СКК представляет собой терапию внутрисердечной сердечной недостаточности, при которой невозбуждающие электрофизиологические сигналы доставляются в миокард в течение абсолютного рефрактерного периода сердечного цикла13,14. Воспроизводимые методы оценки СКК на моделях сердечных клеток человека отсутствуют. В предыдущей работе использовались различные модели сердечных клеток для оценки сократительного ответа CCM. Мы продемонстрировали in vitro, что свежевыделенные кардиомиоциты желудочков кроликов реагируют на стимуляцию CCM временным увеличением кальция и амплитудойсокращения 15. Другое исследование на изолированных кардиомиоцитах желудочков собак продемонстрировало индуцированное CCM усиление внутриклеточной переходной амплитудыкальция 16. Тем не менее, в большинстве исследований СКК использовались препараты для животных ex vivo и in vivo. Эти исследования трудно соотнести друг с другом, поскольку в них применяются различные параметры импульса СКК ивиды17. Одно исследование на изолированной папиллярной модели кролика показало повышенную сократимость, индуцированную CCM,8,18, а ряд исследований всего сердца продемонстрировал индуцированное CCM усиление сократительной функции19,20,21. Эти исследования дали важное механистическое понимание. Тем не менее, отсутствуют воспроизводимые человеческие модели для исследований сократительной ЭП сердца in vitro, включая CCM. С этой целью мы разработали несколько 2D и 3D моделей hiPSC и продемонстрировали индуцированное CCM усиление сократительных свойств в зависимости от параметра. Более того, было обнаружено, что индуцированные CCM инотропные эффекты частично опосредованы нейронным входом и β-адренергической сигнализацией 8,17,22. Тем не менее, необходимо больше знать о механизмах терапии CCM, и использование кардиомиоцитов человека может помочь в достижении этого результата. Таким образом, существует значительная потребность в разработке доклинических инструментов на людях для оценки новых устройств и сигналов CCM, ускорения процесса регулирования, снижения нагрузки на модели на животных и помощи разработчикам устройств в принятии решений 8,17,23,24. Важно разработать простые, самостоятельные протоколы, которые могут быть перенесены в любую лабораторию и в которых используется стандартное оборудование и низкие требования к клеткам для снижения затрат. Этот метод выясняет влияние стимуляции СКК на функцию кардиомиоцитов человека и дает важную информацию о безопасности или эффективности СКК17. Здесь мы описываем метод создания 2D-монослоев hiPSC-CM на гибкой гидрогелевой подложке для создания стандартизированного доклинического инструмента для количественной оценки сократительных реакций острого электрофизиологического медицинского устройства сердца (т.е. CCM) в здоровье и болезнях.

протокол

1. Подготовка плит и сред

ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная аликвота гидрогеля на основе внеклеточного матрикса (ECM) составляет ~ 200 мкл в стерильной пробирке объемом 1,5 мл, хранящейся при -20 ° C.

  1. В стерильном вытяжном шкафу для культивирования тканей подготовьте стерильную 6-луночную пластину, переложив в каждую лунку 2 мл 0,1% желатина (таблица материалов). Накройте крышкой 6-луночную пластину и дайте пластине с покрытием инкубироваться при 37 °C в течение как минимум 1 часа.
  2. За день до посева hiPSC-CM на гибкую гидрогелевую подложку разморозьте аликвоту гидрогеля (Таблица материалов) в холодильнике на льду.
  3. Подготовьте кардиомиоцитарную среду (Таблица материалов), смешав 500 мл RPMI 1640, 10 мл добавки 50x B-27 и 5 мл пенициллина-стрептомицина9.

2. Посев криоконсервированных hiPSC-CM

  1. За два дня до посева hiPSC-CM на гибкую гидрогелевую подложку предварительно наложите hiPSC-CM на 0,1% стерильные 6-луночные планшеты, покрытые желатином. Размораживайте hiPSC-CM, используя стандартный протокол размораживания 9,25.
  2. Затем нанесите 1 500 000 hiPSC-CM (Таблица материалов) на скважину в соответствии с инструкциями производителя (рис. 1A)26.
  3. Культивируют hiPSC-CM в стандартной среде кардиомиоцитов в течение 2-4 дней, чтобы позволить hiPSC-CM восстановиться после криоконсервации при 37 ° C и 5% CO2. Обновляйте отработанную среду 100% кардиомиоцитарной средой каждые 48 ч.

3. Диссоциация и подсчет предварительно нанесенных hiPSC-CM

  1. Проверьте состояние hiPSC-CM перед диссоциацией. Оцените здоровье hiPSC-CM, обеспечив жизнеспособность и стабильное биение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важна чистота популяции hiPSC-CM (например, >90% сердечного тропонина T)7. Метод отбора кардиомиоцитов (например, метаболический отбор или сортировка) рекомендуется для уменьшения разрушения гидрогелевого субстрата клетками, не относящимися к кардиомиоцитам25,26.
  2. Промойте hiPSC-CM 2x 4 мл на лунку D-PBS без CaCl 2 или MgCl2 (таблица материалов). Аспирируйте D-PBS, добавьте 1 мл реагента для диссоциации при комнатной температуре в каждую лунку, а затем инкубируйте в течение 15 мин при 37 ° C.
  3. Добавьте 10 мл среды кардиомиоцитов в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл.
  4. Диссоциируйте hiPSC-CM от 6-луночной пластины с помощью пипетки объемом 1,000 мкл (рис. 1B). Добавьте клеточную суспензию в коническую пробирку26 объемом 15 мл.
  5. Промойте лунку 1 мл свежей среды кардиомиоцитов, чтобы собрать остатки hiPSC-CM, и добавьте их в коническую пробирку объемом 15 мл. Доведите конечный объем конической трубки до 15 мл.
  6. Центрифуга в течение 5 мин (200 × г). Удалите надосадочную жидкость до отметки 1 мл. Ресуспендируют клетки в среде кардиомиоцитов до конечного объема 5 мл.
  7. Подсчитайте hiPSC-CM с помощью ручного или автоматического счетчика ячеек.
  8. Инкубируйте суспензию hiPSC-CM при комнатной температуре, пока готовятся гибкие гидрогелевые субстраты (максимум 30 минут).

4. Подготовка гибких гидрогелевых субстратов

  1. Подготовьте пипетку объемом 20 мкл на 1 мкл, наконечники для пипеток объемом 20 мкл (например, 20 мкл) и стерильную стеклянную нижнюю пластину с 48 лунками. Убедитесь, что секундомер / таймер готов, прежде чем делать гидрогелевые подложки.
  2. В стерильном колпаке для культивирования тканей смешайте гидрогелевый субстрат на основе ECM, осторожно постукивая по пробирке, и немедленно поместите ее обратно на лед.
  3. Затем запустите секундомер / таймер непосредственно перед тем, как будет нанесена первая гидрогелевая подложка - это нулевое время.
  4. Пипетка 1 мкл гидрогелевой подложки вверх и вниз ~ 3x, чтобы охладить наконечник пипетки. Нанесите ~ 1 мкл неразбавленной гидрогелевой подложки горизонтально на дно каждой лунки 48-луночной пластины (рис. 1C, рис. 2A и рис. 3A), удерживая пипетку под углом 45°. Поместите все гидрогелевые субстраты в одинаковую ориентацию в каждой лунке (рис. 2 и рис. 3), чтобы помочь идентифицировать подложку при выполнении экспериментов при 40-кратном увеличении 7,9,17,27.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая линия ~ 1 мкл представляет собой один гидрогелевый субстрат (рис. 3). Как правило, на подготовку 48 лунок уходит ~5 минут. Использование горизонтально наклоненной подставки для микропланшетов (например, 30°) может обеспечить лучший обзор дна скважины и гидрогелевой подложки. Обязательно пройдите по всей длине колодца (т.е. слева направо). Короткие гидрогелевые субстраты могут быть слишком толстыми, что снижает стабильность подложки. Не допускайте высыхания гидрогелевого субстрата в наконечнике пипетки. Если это произошло, быстро переключитесь на новый совет и сразу же продолжите. В качестве альтернативы можно использовать охлажденные наконечники для пипеток. Гидрогелевая подложка на основе ECM может быстро полимеризоваться, когда она не находится на льду. Предлагается подготовка нескольких скважин одновременно (например, 10). Кроме того, рекомендуется практиковаться в макете 48-луночной пластины.
  5. Закройте крышку на 48-луночную пластину и дайте гидрогелевым субстратам инкубироваться в течение 8-10 минут при комнатной температуре в стерильном колпаке для культивирования тканей перед добавлением клеток (рис. 2B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно придерживаться рекомендуемого времени инкубации. Время инкубации более 10 минут приведет к образованию жестких гидрогелевых субстратов и отсутствию видимых сокращений. Время инкубации менее 8 минут может привести к разрушению субстратов.
  6. Немедленно посейте hiPSC-CM по каплям непосредственно на гидрогелевые субстраты, с ~ 30 000 жизнеспособных hiPSC-CM на лунку в низком среднем объеме ~ 200 мкл среды кардиомиоцитов, используя пипетку объемом 1000 мкл (рис. 2B и рис. 3B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс останавливает полимеризацию гидрогелевого субстрата и обеспечивает нахождение hiPSC-CM на подложке 7,9,17,27.
  7. Поместите крышку на тарелку и дайте hiPSC-CM инкубироваться в течение 10-15 минут при комнатной температуре (рис. 2C) в стерильном колпаке для культивирования тканей, чтобы hiPSC-CM могли прилипать к гидрогелевому субстрату.
  8. Аккуратно добавьте ~ 100 мкл свежей среды кардиомиоцитов в каждую лунку (конечный объем: ~ 300 мкл на лунку). Накройте тарелку крышкой и переложите в инкубатор при 37 °C, 5%CO2 на 2-4 дня. Обновляйте 100% среду каждые 24 часа перед проведением экспериментов по сокращению.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Визуально осмотрите hiPSC-CM на предмет правильной морфологии; сразу после нанесения покрытия hiPSC-CM должны казаться круглыми (рис. 3B). Ко 2-му дню после посева будет наблюдаться сливающийся 2D монослойный синцитий hiPSC-CM (рис. 3C) (дополнительное видео S1) с сильным видимым сокращением (дополнительное видео S2).

5. Регистрация и анализ сокращений

  1. Приготовьте среду для анализа МНЛЗ, которая представляет собой раствор Тирода, содержащий следующие вещества (в ммоль/л): CaCl 2 0,5, NaCl 134, KCl 5,4, MgCl2 1, глюкозу 10 и HEPES 10, при этом рН доводят до 7,4 с NaOH и уравновешивают до 37 °C на водяной бане.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Субмаксимальный внеклеточный кальций (0,5 мМ) используется для расширения окна анализа CCM.
  2. Включите микроскоп и камеру контроля окружающей среды, чтобы уравновесить температуру до 37 °C и 5% CO2.
  3. Удалите кардиомиоцитарную среду из 48-луночной пластины и осторожно промойте каждую лунку дважды 600 мкл среды для анализа CCM.
  4. Добавьте 300 мкл проанализирующей среды МНЛЗ на лунку и поместите 48-луночную пластину на микроскоп в камеру контроля окружающей среды. Вставьте электроды и уравновесьте ячейки в течение 5 мин.
  5. Используйте видеомикроскопию для записи видео сокращения. Откройте программное обеспечение для записи видео и установите частоту кадров 100 кадров в секунду. Выберите интересующую область (ROI) вблизи центра монослоя hiPSC-CM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не выбирайте ROI вблизи края монослоев hiPSC-CM, так как это может быть нестабильно для сократительных записей.
  6. Затем поле стимулирует клетки с помощью коммерческого генератора импульсов (таблица материалов) для электрического темпа 2D монослоев hiPSC-CM. Темп hiPSC-CM при 1,5-кратном пороге при 1 Гц с базовыми параметрами импульса (например, монофазные импульсы прямоугольной волны с длительностью импульса стимула 2 мс ~ 14 В/см)17.
  7. Запишите видео сокращения на базовом уровне, только в темпе (т.е. перед CCM) (рис. 1D) в течение как минимум пяти ударов17,28.
  8. Затем стимулируйте монослой hiPSC-CM экспериментальным электрическим сигналом (рис. 1D). Для выполнения этого протокола используются стандартные параметры стимуляции СКК: два симметричных двухфазных импульса длительностью фазы 5,14 мс (общая длительность 20,56 мс), ~28 В/см (амплитуда фазы), нулевой межфазный интервал и задержка 30 мс (т.е. время от окончания импульса стимуляции до начала импульса МКМ) (рис. 1D)29,30 и запишите видео сокращения, вызванного CCM, как минимум на пять ударов.
  9. Выключите сигнал CCM, стимулируйте импульс базовой стимуляции и запишите видео сокращения периода восстановления (т. е. после CCM) в течение как минимум пяти ударов.
  10. Используйте стандартное программное обеспечение для автоматического анализа видео сокращения и количественной оценки ключевых сократительных свойств (например, амплитуды сокращения, наклона сокращения, наклона релаксации, времени до пика, времени до исходного уровня 90% и продолжительности сокращения 50%)7,17,31,32.
  11. Используйте 2D hiPSC-CM на гибкой гидрогелевой подложке для сократительных экспериментов со 2 по 14 день после нанесения покрытия на подложку.

Результаты

В этом протоколе описан простой, надежный инструмент для создания заметно сжимающихся 2D-монослоев hiPSC-CM на гибкой гидрогелевой подложке. Измерение сократительных свойств осуществляется с помощью видеозаписи в сочетании с программным обеспечением для анализа сократительной способности. Это позволяет количественно оценить ключевые параметры сократимости кардиомиоцитов, включая амплитуду сокращения, наклон сокращения, наклон релаксации, время до пика, время до исходного уровня 90% и продолжительность сокращения 50%. Модель используется для характеристики базовых сократительных свойств hiPSC-CM (рис. 4) от различных «здоровых» доноров и может быть распространена на оценку сигналов медицинских устройств электрофизиологии сердца (т.е. CCM). Применение стандартных параметров стимуляции СКК (рис. 1D)29,30 привело к усилению сократительных свойств in vitro (рис. 5 и табл. 1)17.

Мы также продемонстрировали, что этот метод может быть использован для оценки влияния модуляции внеклеточных концентраций кальция на сократительные свойства человека с стимуляцией CCM и без нее (рис. 6)17. Ожидаемая исходная кальциевая зависимость сокращения наблюдалась 7,17, а также индуцированное КМК повышение чувствительности к кальцию на уровне монослоя кардиомиоцитов. Кроме того, фармакологический опрос β-адренергического сигнального пути (рис. 7) показал, что индуцированные СКК инотропные эффекты были частично опосредованы β-адренергической сигнализацией17. Кроме того, этот инструмент может быть расширен до кардиомиоцитов конкретного пациента, включая кардиомиоциты дилатационной кардиомиопатии (DCM)33,34,35 (рис. 8), чтобы понять влияние CCM в контексте болезненных состояний; действительно, повышенная сократительная амплитуда и кинетика ускоренного сокращения и релаксации наблюдались при испытанной здесь «дозе» СКК (рис. 8). Несмотря на то, что в нашей лаборатории есть устройство, имитирующее CCM, методология, используемая здесь, не является специфической для этой системы и может быть применена к другим устройствам электрофизиологии сердца.

figure-results-2695
Рисунок 1: Схематическое резюме 2D-модели МНЛЗ hiPSC-CM in vitro. (A) HiPSC-CM предварительно нанесены в монослойном формате на 6-луночные пластины с желатиновым (0,1%) покрытием. (B) После 2 дней в культуре hiPSC-CM диссоциируют и готовят к нанесению на гибкую гидрогелевую подложку. (C) Изолированные hiPSC-CM нанесены с высокой плотностью на гидрогелевые подложки, расположенные в 48-луночном формате (слева), и анализируются во внеклеточном растворе кальция Tyrode (справа) (0,5 мМ). (D) Коммерческий генератор импульсов и стандартные клинические параметры импульсаCCM 29,30 (справа) используются для стимуляции hiPSC-CM; Сердечная функция оценивается с помощью видеоанализа (слева). (E) Репрезентативные записи сокращений до СКК (исходный уровень: 5 В), во время СКК (СКК: 10 В) и после СКК (восстановление: 5 В). Эта цифра была перепечатана из Feaster et al.17. Сокращения: hiPSC-CM = индуцированный плюрипотентный кардиомиоцит человека, полученный из стволовых клеток; CCM = модуляция сократимости сердца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4262
Рисунок 2: Схема обшивки и посева гибкого гидрогелевого субстрата. (A) Полностью размороженная, неразбавленная гидрогелевая подложка на основе ECM наносится на стерильную 48-луночную пластину (левая панель) с 1 мкл гидрогелевой подложки на лунку (правая панель). (B) Гидрогелевый субстрат выдерживают при комнатной температуре в течение 8-10 мин (правая панель) с последующим нанесением покрытия на высокоплотные hiPSC-CM в низком среднем объеме (~ 200 мкл) (левая панель). (C) После 10-15 мин инкубации в каждую лунку (левая панель) добавляют среду, а планшеты перемещают в стандартный инкубатор для культивирования тканей (правая панель). Сокращения: ECM = внеклеточный матрикс, hiPSC-CM = индуцированный плюрипотентный кардиомиоцит человека, полученный из стволовых клеток; RT = комнатная температура. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5494
Рисунок 3: Гидрогелевый субстрат на основе внеклеточного матрикса. (A) Репрезентативный гидрогелевый субстрат (без клеток) в одной лунке 48-луночной стеклянной нижней пластины сразу после нанесения подложки на лунку. (B) Время 0 после посева hiPSC-CM. С) Через 24 часа после посева hiPSC-CM. Эта панель была перепечатана из Feaster et al.17. Белыми стрелками обозначен край гидрогелевой подложки, 4-кратное увеличение. Масштабная линейка = 1 мм. Аббревиатура: hiPSC-CM = индуцированный плюрипотентный кардиомиоцит, полученный из стволовых клеток человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-6501
Рисунок 4: Характеристика сократительных свойств монослоя 2D hiPSC-CM. (A) Репрезентативная запись сокращения 2D hiPSC-CM с частотой 1 Гц (5 В). (B) Репрезентативные следы сокращения, изображающие один цикл сокращения. (C) Сводные гистограммы. Данные являются средними ± SEM. n = 18. Аббревиатура: hiPSC-CM = индуцированный плюрипотентный кардиомиоцит, полученный из стволовых клеток человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-7322
Рисунок 5: Острое влияние СКК на сократительные свойства 2D hiPSC-CM. (A) Репрезентативная регистрация сокращения до СКК (5 В), во время СКК (10 В) и после СКК (5 В). (B) Репрезентативные следы сокращения непосредственных эффектов (т.е. последний удар до удара СКК, первый удар СКК и первый удар после удара СКК, обозначенный +). С) Сводные гистограммы непосредственных последствий. Процентное изменение, данные являются средними ± SEM. n = 23. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Эта цифра была перепечатана из Feaster et al.17. Сокращения: hiPSC-CM = индуцированный плюрипотентный кардиомиоцит человека, полученный из стволовых клеток; CCM = модуляция сократимости сердца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-8501
Рисунок 6: Влияние внеклеточной модуляции кальция на реакцию СКК. (A) репрезентативные следы сокращения непосредственных эффектов для каждой группы до СКК (5 В), во время СКК (10 В) и после СКК (5 В); hiPSC-CM подвергались воздействию возрастающих концентраций внеклеточного кальция (Cao) на 0,25-2 мМ. (Б-Д) Преобразованные данные (сигмоидальные) для направления глаза, демонстрирующие влияние КМК на кальциевую чувствительность сократительных свойств (т.е. амплитуду и кинетику) (наклон холма = 1,0). n = 6-8 на группу. Эта цифра была перепечатана из Feaster et al.17. Сокращения: hiPSC-CM = индуцированный плюрипотентный кардиомиоцит человека, полученный из стволовых клеток; CCM = модуляция сократимости сердца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-9696
Рисунок 7: Фармакологическая проблема. Репрезентативные следы сокращения для каждой группы до СКК (5 В), во время СКК (10 В) и после СКК (5 В); hiPSC-CM предварительно обрабатывали (A) носителем или (B) метопрололом (2 мкМ). (С,Д) Сводные гистограммы для каждого условия. Процентное изменение, данные являются средними ± SEM. n = 10 на группу. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Эта цифра была перепечатана из Feaster et al.17. Сокращения: hiPSC-CM = индуцированный плюрипотентный кардиомиоцит человека, полученный из стволовых клеток; CCM = модуляция сократимости сердца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-10792
Рисунок 8: Острое влияние CCM на сократительные свойства пораженных 2D hiPSC-CM. (A) Репрезентативный след сокращения для DCM L35P, контрольный базовый уровень (до, 6 В) и DCM L35P плюс CCM (10 В). (B) Сводные гистограммы. Процентное изменение, данные являются средними ± SEM. n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01. Сокращения: hiPSC-CM = индуцированный плюрипотентный кардиомиоцит человека, полученный из стволовых клеток; CCM = модуляция сократимости сердца; DCM = дилатационная кардиомиопатия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительное видео S1: Таймлапс hiPSC-CM на гидрогеле на основе внеклеточного матрикса. Двумерные hiPSC-CM, нанесенные на гибкую гидрогелевую подложку; Время: 0-90 ч; один колодец со стеклянной нижней пластиной на 48 лунок; 4-кратное увеличение. hiPSC-CM образуют горизонтальный монослойный синцитий (т.е. слева направо). Масштабная линейка = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Дополнительное видео S2: hiPSC-CMs на гидрогеле на основе внеклеточного матрикса. Двумерные hiPSC-CM, нанесенные на гибкую гидрогелевую подложку; Время: ~24 ч; один колодец со стеклянной нижней пластиной на 48 лунок; 4-кратное увеличение. hiPSC-CM образуют монослойную морфологию и демонстрируют сильное сжатие через ~ 24 часа после нанесения покрытия. Масштабная линейка = 1 мм. Это видео взято из Feaster et al.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

ПараметрСККПосле
Амплитуда16 ± 4%**4 ± 5%
Время достижения пика 50%-20 ± 9%*7 ± 5%
Время достижения пика 90%-22 ± 8%*6 ± 5%
Время до исходного уровня 50%-8 ± 5%4 ± 4%
Время выхода на исходный уровень 90%-12 ± 6%*5 ± 5%
Продолжительность сокращения: 10%-13 ± 6%3 ± 5%
Продолжительность сокращения: 50%-6 ± 5 %3 ± 5%
Продолжительность сокращения: 90%0 ± 5%3 ± 4%
N2323

Таблица 1: Сократительные свойства. Процентное изменение относительно того, что было до МНЛЗ (5 В); данные являются средними ± SEM для всех ударов в каждой группе во время СКК (10 В) и после СКК (5 В). n = 23. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Эта таблица была перепечатана из Feaster et al.17.

Обсуждение

Протокол, описанный в настоящем документе, описывает способ получения надежно сжимающихся монослоев 2D hiPSC-CM на гибком гидрогелевом субстрате на основе внеклеточного матрикса (ECM) с коммерческими реагентами 7,17. HiPSC-CM, посеянные на гибком гидрогелевом субстрате, остаются жизнеспособными и обладают повышенными сократительными свойствами7. Этот метод опирается на стандартное лабораторное оборудование и возможности7. В протоколе есть несколько важных шагов, в том числе в отношении работы с гидрогелевым субстратом на основе ECM, которые требуют пристального внимания к деталям. Одной из потенциальных проблем является наличие сыворотки в среде. Это может привести к тому, что hiPSC-CM образуют сети (например, эндотелиальные/сосудистые сети) вместо сливающегося монослойного листа; следовательно, среда без сыворотки рекомендуется во время создания гибких монослоев гидрогеля hiPSC-CM (т.е. с 0 по 4 день). Аналогичным образом, одновременная подготовка слишком большого количества гидрогелевых субстратов может привести к плохим или неровным подложкам из-за усталости оператора. Несмотря на то, что важно работать быстро, целостность каждого гидрогелевого субстрата имеет решающее значение. Точно так же следует осторожно засеять hiPSC-CM и сменить среду; Это не должно делаться насильно. При смене среды его следует добавлять аккуратно от верхнего края лунки, чтобы не нарушить гидрогелевый субстрат или клетки. Как и в случае со стандартными 2D-культурами hiPSC-CM (т.е. обычными тканевыми культурами, пластиком или стеклом), покрытие с низкой плотностью приведет к неполному образованию монослоя. Важно визуально осмотреть hiPSC-CM, чтобы убедиться, что они находятся на гидрогелевой подложке, и использовать таймер для обеспечения точного времени. Кроме того, культивирование монослоев 2D hiPSC-CM в течение более 14 дней на гидрогелевой подложке может привести к разрушению монослоя, основываясь на свойствах ECM и инструкциях производителя подложки.

Существует несколько ограничений текущего метода, которые необходимо учитывать. Во-первых, клетки, используемые в этом протоколе, были от коммерческого поставщика hiPSC-CM, и эти клетки образуют синцитий электрически связанных клеток. Синцитий содержит смесь hiPSC-CM из всех трех подтипов сердца (т.е. желудочкового, предсердного и узлового)17. Исследования могут извлечь выгоду из популяции hiPSC-CM без подтипа (т.е. 100% желудочков или 100% предсердий). Во-вторых, в этом методе использовались только hiPSC-CM, в то время как немиоциты, включая сердечные фибробласты, эндотелиальные клетки и нейроны, могут улучшать функциональность hiPSC-CM22,36. В-третьих, 2D hiPSC-CM демонстрируют несколько особенностей относительно незрелых кардиомиоцитов, включая спонтанное биение, аморфную морфологию и отсутствие инотропного ответа 8,37. В-четвертых, несмотря на то, что этот протокол производит надежно сокращающиеся 2D-монослои hiPSC-CM, вполне вероятно, что функционально улучшенные 3D-модели hiPSC-CM, такие как сконструированные сердечные ткани (ЭСТ), приведут к усиленному сократительному ответу, индуцированному CCM, при физиологических концентрациях кальция 8,38. Наконец, описанный здесь протокол рассчитан на 48-луночный формат. Однако с оптимизацией и включением автоматизации это может быть масштабировано до формата с высокой пропускной способностью (например, 96-луночные или 384-луночные планшеты).

В настоящее время золотым стандартом для исследований hiPSC-CM являются обычные жесткие 2D-условия культивирования (т.е. культура тканей, пластик или стекло). Несмотря на то, что традиционная методология полезна для электрофизиологии3 иобработки кальция в 39 исследованиях, она приводит к минимальным сократительным свойствам 5,6,7. В результате обычные жесткие условия 2D-культивирования не поддаются оценке сократительных эффектов СКК8. Функционально усовершенствованные методы 3D HIPSC-CM ECT38 являются технически сложными, трудоемкими и требуют сложного оборудования, которое доступно не в каждой лаборатории. В этом протоколе мы описываем простую методологию для создания надежно сжимающихся 2D-монослоев hiPSC-CM за более короткий промежуток времени, чем методы 3D ECT или долгосрочные традиционные 2D-методы 7,40,41. Кроме того, используемые здесь реагенты коммерчески доступны, включая гидрогелевый субстрат и hiPSC-CM, и оба имеют значительную консистенцию от партии к партии. В то время как мы использовали съемные электроды из платиновой проволоки (межэлектродное расстояние: 2,0 мм, ширина: 1,0 мм), различные материалы и конфигурации электродов поддаются сократительной оценке CCM in vitro 8,15,17,18,22. Кроме того, существует несколько автоматизированных программ, которые позволяют анализировать видео сокращений 7,31,32.

Большинство доклинических методов оценки сократимости кардиологических медицинских устройств в значительной степени основаны на дорогостоящих моделях животных in vivo (например, собак или свиней) и технически сложных полосках сосочковых мышц (например, кроликов)18. В этой статье описана модель человека in vitro для оценки влияния сигналов медицинских устройств электрофизиологии сердца на сократимость. Этот инструмент может снизить зависимость от исследований на животных и быть полезным для оценки сократительных свойств электрофизиологических устройств сердца in vitro .

Раскрытие информации

Эта статья отражает точку зрения авторов и не должна толковаться как отражающая взгляды или политику Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США. Упоминание коммерческих продуктов, их источников или их использования в связи с материалами, представленными в настоящем документе, не должно толковаться как фактическое или подразумеваемое одобрение таких продуктов Министерством здравоохранения и социальных служб. Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов в этой работе.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана назначением в Программу участия в исследованиях в Центре устройств и радиологического здоровья, управляемую Институтом науки и образования Ок-Ридж в рамках межведомственного соглашения между Министерством энергетики США и Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США. Авторы благодарят Ричарда Грея, Трента Робертсона и Анну Авилу за их предложения и техническую помощь. Исследование финансировалось Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, Управлением научных и инженерных лабораторий.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1% GelatinSTEMCELL Technologies7903Pre-plating Culture Substrate
48-well PlateMatTek P48G-1.5-6-FHydrogel Substrate hiPSC-CM Culture, Glass
6-well PlateThermofisher140675hiPSC-CM Culture, Plastic
B-27 Supplement, with insulinInvitrogen17504-044Cardiomyocyte Media
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2)Fisher Scientificc70-500Tyrode’s solution
CellOPTIQ Platform and Software Clyde BiosciencesContraction Recording and Analysis
Conical tube 15 mLCorning 352099hiPSC-CM Dissociation
Digital CMOS CameraHamamatsuC11440-42U30Contraction Video Recording
D-PBSLife Technologies14190-144Cell Wash
Environmental Control ChamberOKOLAB INCH201-K-FRAMEEnvironmental Regulation
Glucose Sigma-AldrichG8270-1kgTyrode’s solution
HemocytometerFisher Scientific22-600-107hiPSC-CM Counting
HEPESSigma-AldrichH3375Tyrode’s solution
iCell Cardiomyocytes Plating MediumFujifilm Cellular Dynamic, Inc. M1001hiPSC-CM Plating Media
iCell Cardiomyocytes2, 01434Fujifilm Cellular Dynamic, Inc. R1017hiPSC-CMs
Incubator (37 °C, 5% CO2)Thermofisher50116047Maintain hiPSC-CMs
Inverted MicroscopeOlympusIX73Imaging hiPSC-CMs
Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2) Fisher Scientificm33-500Tyrode’s solution
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane MatrixCorning 356230Flexible Hydrogel Substrate
Microcentrifuge tubes 1.5 mlFisher Scientific05-408-129Hydrogel Substrate Aliquot
Model 4100 Isolated High Power StimulatorAM-SystemsModel 4100 Pulse Generator
MyCell Cardiomyocytes DCM LMNA L35P, 01016Fujifilm Cellular Dynamic, Inc. R1153DCM hiPSC-CMs
Pen-StrepInvitrogen15140-122Cardiomyocyte Media
Pipette L-20Rainin17014392Plating Hydrogel Substrate
Pipette P1000Fisher ScientificF123602G
Pipette tips, 1000 ulFisher Scientific02-707-509
Pipette tips, 20 ulRaininGPS-L10SMaking Hydrogel Substrate
Potassium Chloride (KCl) Fisher ScientificP330-500Tyrode’s solution
RPMI 1640, with glucose Invitrogen11875Cardiomyocyte Media
Sodium Chloride (NaCl)Fisher Scientifics641-212Tyrode’s solution
Sodium Hydroxide (NaOH)Sigma-Aldrich221465Tyrode’s solution
Stimulation ElectrodesPacing and CCM Stimulation
Stopwatch/TimerFisher Scientific02-261-840Plating Hydrogel Substrate
Trypan Blue StainLife TechnologiesT10282hiPSC-CM Counting
TrypLE Express Life Technologies12605-010hiPSC-CM Dissociation

Ссылки

  1. Jackson, S. L., et al. National burden of heart failure events in the United States, 2006 to 2014. Circulation: Heart Failure. 11 (12), 004873 (2018).
  2. Cook, C., Cole, G., Asaria, P., Jabbour, R., Francis, D. P. The annual global economic burden of heart failure. International Journal of Cardiology. 171 (3), 368-376 (2014).
  3. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  4. Yang, X., Ribeiro, A. J. S., Pang, L., Strauss, D. G. Use of human iPSC-CMs in nonclinical regulatory studies for cardiac safety assessment. Toxicology Sciences. 190 (2), 117-126 (2022).
  5. Zuppinger, C. 3D cardiac cell culture: A critical review of current technologies and applications. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).
  6. Huethorst, E., et al. Conventional rigid 2D substrates cause complex contractile signals in monolayers of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 600 (3), 483-507 (2022).
  7. Feaster, T. K., et al. Matrigel mattress: A method for the generation of single contracting human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 117 (12), 995-1000 (2015).
  8. Feaster, T. K., et al. Acute effects of cardiac contractility modulation stimulation in conventional 2D and 3D human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte models. Frontiers in Physiology. 13, 1023563 (2022).
  9. Feaster, T. K. . Implementation of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte to model excitation-contraction coupling in health and disease. , (2015).
  10. Cadar, A. G., et al. Real-time visualization of titin dynamics reveals extensive reversible photobleaching in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 318 (1), 163-173 (2020).
  11. Parikh, S. S., et al. Thyroid and glucocorticoid hormones promote functional T-tubule development in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 121 (12), 1323-1330 (2017).
  12. Wang, L., et al. Hypertrophic cardiomyopathy-linked mutation in troponin T causes myofibrillar disarray and pro-arrhythmic action potential changes in human iPSC cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 320-327 (2018).
  13. Campbell, C. M., Kahwash, R., Abraham, W. T. Optimizer Smart in the treatment of moderate-to-severe chronic heart failure. Future Cardiology. 16 (1), 13-25 (2020).
  14. PMA P180036. FDA Summary of Safety and Effectiveness Data. Food and Drug Administration Available from: https://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf18/P180036B.pdf (2019)
  15. Blinova, K., et al. Acute effects of nonexcitatory electrical stimulation during systole in isolated cardiac myocytes and perfused heart. Physiological Reports. 2 (8), 12106 (2014).
  16. Sabbah, H. N., et al. Cardiac contractility modulation with the impulse dynamics signal: Studies in dogs with chronic heart failure. Heart Failure Reviews. 6 (1), 45-53 (2001).
  17. Feaster, T. K., Casciola, M., Narkar, A., Blinova, K. Acute effects of cardiac contractility modulation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Physiological Reports. 9 (21), 15085 (2021).
  18. Brunckhorst, C. B., Shemer, I., Mika, Y., Ben-Haim, S. A., Burkhoff, D. Cardiac contractility modulation by non-excitatory currents: Studies in isolated cardiac muscle. European Journal of Heart Failure. 8 (1), 7-15 (2006).
  19. Mohri, S., et al. Cardiac contractility modulation by electric currents applied during the refractory period. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 282 (5), 1642-1647 (2002).
  20. Mohri, S., et al. Electric currents applied during refractory period enhance contractility and systolic calcium in the ferret heart. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (4), 1119-1123 (2003).
  21. Burkhoff, D., et al. Electric currents applied during the refractory period can modulate cardiac contractility in vitro and in vivo. Heart Failure Reviews. 6 (1), 27-34 (2001).
  22. Narkar, A., Feaster, T. K., Casciola, M., Blinova, K. Human in vitro neurocardiac coculture (ivNCC) assay development for evaluating cardiac contractility modulation. Physiological Reports. 10 (21), 15498 (2022).
  23. Harris, K., et al. Comparison of electrophysiological data from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to functional preclinical safety assays. Toxicological Sciences. 134 (2), 412-426 (2013).
  24. Blinova, K., et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
  25. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  26. Burridge, P. W., Holmstrom, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87, 1-15 (2015).
  27. Cadar, A. G., Feaster, T. K., Durbin, M. D., Hong, C. C. Production of single contracting human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Matrigel mattress technique. Current Protocols in Stem Cell Biology. 42, 1-7 (2017).
  28. Narkar, A., Willard, J. M., Blinova, K. Chronic cardiotoxicity assays using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). International Journal of Molecular Sciences. 23 (6), 3199 (2022).
  29. OPTIMIZER® Smart Implantable Pulse Generator INSTRUCTIONS FOR USE. ImpulseDynamics Available from: https://impulse-dynamics.com/wp-content/uploads/2020/05/13-290-008-01-US-Rev-01-OPT-Smart-IPG-IFU.pdf (2018)
  30. OPTIMIZER™ Smart Mini Implantable Pulse Generator INSTRUCTIONS FOR USE. ImpulseDynamics Available from: https://impulse-dynamics.com/wp-content/uploads/2021/02/13-290-011-EU-Rev-00-OPTIMIZER-Smart-Mini-IPG-IFU-EU.pdf (2019)
  31. Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).
  32. Grune, T., Ott, C., Haseli, S., Hohn, A., Jung, T. The "MYOCYTER" - Convert cellular and cardiac contractions into numbers with ImageJ. Scientific Reports. 9, 15112 (2019).
  33. Masarone, D., et al. Use of cardiac contractility modulation as bridge to transplant in an obese patient with advanced heart failure: A case report. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 9, 833143 (2022).
  34. Nadeem, M., Tariq, E. F., Aslam, H. M., Illahi, Y., Shah, R. All-cause mortality outcomes of usage of cardiac contractility modulation in patients with dilated cardiomyopathy ineligible for cardiac re-synchronization therapy: An updated meta-analysis of randomized controlled trials. Cureus. 12 (9), 10627 (2020).
  35. Manganelli, G., et al. Use of cardiac contractility modulation in an older patient with non-ischemic dilated cardiomyopathy: A case report. Clinics and Practice. 11 (4), 835-840 (2021).
  36. Mannhardt, I., et al. Automated contraction analysis of human engineered heart tissue for cardiac drug safety screening. Journal of Visualized Experiments. (122), e55461 (2017).
  37. Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
  38. Feric, N. T., et al. Engineered cardiac tissues generated in the Biowire™ II: A platform for human-based drug discovery. Toxicology Sciences. 172 (1), 89-97 (2019).
  39. Hwang, H. S., et al. Human induced pluripotent stem cell (hiPSC) derived cardiomyocytes to understand and test cardiac calcium handling: A glass half full. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 379-380 (2015).
  40. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  41. Stoehr, A., et al. Automated analysis of contractile force and Ca2+ transients in engineered heart tissue. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (9), 1353-1363 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1902D hiPSC CM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены