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요약

여기에서는 비디오 기반 현미경과 결합된 유연한 기판에 도금된 2D 인간 유도만능 줄기 세포 유래 심근세포(hiPSC-CM) 단층을 사용하여 비침습적 심장 의료 기기 수축성 평가 방법을 시연합니다. 이 도구는 심장 전기 생리학 장치의 수축 특성에 대한 시험관 내 평가에 유용합니다.

초록

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CMs)는 현재 여러 시험관 내 응용 분야에서 탐구되고 있으며 규제 제출에 사용되었습니다. 여기에서는 심장 의료 기기 안전 또는 성능 평가로 사용을 확대합니다. 우리는 유연한 세포외 기질(ECM) 기반 하이드로겔 기질에 도금된 견고하게 수축하는 2D hiPSC-CM 단층에서 심장 의료 기기 수축 특성을 평가하는 새로운 방법을 개발했습니다. 이 도구를 사용하면 표준 실험실 장비를 사용하여 심장 전기 생리학 장치 신호가 인간의 심장 기능(예: 수축 특성)에 미치는 영향을 정량화할 수 있습니다. 2D hiPSC-CM 단분자층을 48웰 형식의 유연한 하이드로겔 기판 위에서 2-4일 동안 배양하였다.

hiPSC-CM은 표준 심장 수축성 변조(CCM) 의료 기기 전기 신호에 노출되었고 대조군(즉, 페이싱만) hiPSC-CM과 비교되었습니다. 2D hiPSC-CM의 기준선 수축 특성은 픽셀 변위를 기반으로 한 비디오 기반 검출 분석으로 정량화되었습니다. 유연한 하이드로겔 기판에 도말된 CCM 자극 2D hiPSC-CM은 증가된 피크 수축 진폭과 가속화된 수축 및 이완 동역학을 포함하여 기준선에 비해(즉, CCM 자극 전) 크게 향상된 수축 특성을 나타냈습니다. 또한, 유연한 하이드로겔 기질의 활용은 건강하고 질병에 걸린 hiPSC-CM에서 비디오 기반 심장-흥분 수축 결합 판독값(즉, 전기생리학, 칼슘 처리 및 수축)의 멀티플렉싱을 가능하게 합니다. 심장 전기 생리학적 신호가 인간의 심장 수축에 미치는 영향을 정확하게 감지하고 정량화하는 것은 심장 의료 기기 개발, 최적화 및 위험 제거에 매우 중요합니다. 이 방법을 사용하면 심장 세포융합의 수축 특성을 강력하게 시각화하고 정량화할 수 있으며, 이는 비임상 심장 의료 기기 안전성 또는 유효성 테스트에 유용합니다. 이 논문은 2D hiPSC-CM 하이드로겔 기판 단층을 생성하는 방법론을 자세히 설명합니다.

서문

미국 인구가 고령화됨에 따라 심부전 환자의 수는 직접 의료 비용 1,2과 함께 계속 증가하고 있습니다. 심부전을 치료하기 위한 새로운 치료법과 그러한 치료법을 테스트하기 위한 혁신적인 비임상 방법론을 개발하는 것이 매우 중요합니다. 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CMs)는 치료 개발 과정을 돕기위한 시험관 내 도구로 제안되었으며 규제 제출 3,4에 사용되었습니다. 그러나, 표준 경질 2D 배양 조건 (즉, 기존의 조직 배양 플라스틱 또는 유리)5,6,7,8에서 도금 할 때 강력한 수축 특성이 부족하기 때문에 수축성 연구에 널리 사용되었다. 우리는 이전에 유연한 하이드로겔 기질에 분리된 단일 hiPSC-CM을 도금하여 강력한 가시적 수축 특성을 생성하는 유용성을 입증했습니다9. 우리는 분리된 hiPSC-CM이 갓 분리된 성인 토끼 심실 심근 세포와 유사한 수축 특성을 갖는다는 것을 보여주었습니다. 또한, 우리는 약리학적 제제에 대한 수축 반응을 평가하기 위한 이 방법의 유용성을 입증했다7. 또한, 다른 연구에서는 이 기술을 기초 과학 및 질병 모델링10,11,12에 대한 기계론적 평가에 적용했습니다. 여기에서 이 방법론은 2D hiPSC-CM 단층으로 확장되었으며 시험관 내에서 생리학적으로 관련된 심장 수축성 조절(CCM) 의료 기기 전기 신호를 평가하는 데 유용성이 입증되었습니다.

CCM은 심장 주기13,14의 절대 불응 기간 동안 비흥분성 전기생리학적 신호가 심근으로 전달되는 심장내 심부전 치료법입니다. 인간 심장 세포 모델에서 CCM을 평가하는 재현 가능한 방법은 부족합니다. 이전 연구에서는 CCM 수축 반응을 평가하기 위해 다양한 심장 세포 모델을 사용했습니다. 우리는 시험관 내에서 갓 분리된 토끼 심실 심근 세포가 칼슘과 수축 진폭의 일시적인 증가에 의해 CCM 자극에 반응한다는 것을 입증했습니다15. 고립된 개 심실성 심근 세포에 대한 또 다른 연구에서는 CCM에 의해 유발된 세포내 칼슘 과도 진폭의 향상을 입증했습니다16. 그러나 대부분의 CCM 연구는 생체 외 및 생체 내 동물 제제를 사용했습니다. 이러한 연구는 다양한 CCM 펄스 파라미터와 종17을 적용하기 때문에 서로 상관관계가 어렵다. 분리된 토끼 유두 모델을 대상으로 한 한 연구에서는 CCM에 의한 수축성 증가가 나타났으며8,18, 일련의 전심 연구에서는 CCM에 의한 수축 기능 향상이 나타났다19,20,21. 이러한 연구는 중요한 기계론적 통찰력을 제공했습니다. 그러나 CCM을 포함한 시험관 내 심장 EP 수축 연구를 위한 재현 가능한 인간 모델이 부족합니다. 이를 위해 우리는 여러 2D 및 3D hiPSC 모델을 개발하고 매개변수 의존적 방식으로 CCM에 의한 수축 특성 향상을 입증했습니다. 더욱이, CCM에 의해 유도된 근수축 효과는 부분적으로 뉴런 입력 및 β-아드레날린성 신호전달에 의해 매개되는 것으로 밝혀졌다 8,17,22. 그러나 CCM 치료의 메커니즘에 대해 더 많이 알아야 하며 수축하는 인간 심근 세포를 활용하면 이러한 결과를 달성하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 새로운 CCM 장치 및 신호를 평가하고, 규제 프로세스를 가속화하고, 동물 모델에 대한 부담을 줄이고, 장치 개발자 의사 결정을 돕기 위한 인간 비임상 도구를 개발할 상당한 필요성이 있습니다(8,17,23,24). 모든 실험실로 이전할 수 있고 표준 장비와 낮은 세포 요구 사항을 사용하여 비용을 절감할 수 있는 쉬운 DIY 프로토콜을 개발하는 것이 중요합니다. 이 방법은 CCM 자극이 인간 심근 세포 기능에 미치는 영향을 설명하고 CCM 안전성 또는 유효성에 대한 중요한 통찰력을 제공한다17. 여기에서는 건강 및 질병에서 급성 심장 전기생리학 의료 기기(즉, CCM) 수축 반응을 정량화하기 위한 표준화된 비임상 도구를 생성하기 위해 유연한 하이드로겔 기판에 2D hiPSC-CM 단층을 생성하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

1. 플레이트 및 배지 준비

참고: 일반적인 세포외 기질(ECM) 기반 하이드로겔 분취량은 -20°C에서 보관된 멸균 1.5mL 튜브에서 ~20μL입니다.

  1. 멸균 조직 배양 후드에서 0.1% 젤라틴 2mL(재료 표)를 각 웰에 옮겨 멸균된 6웰 플레이트를 준비합니다. 뚜껑을 6-웰 플레이트에 놓고 코팅된 플레이트를 37°C에서 최소 1시간 동안 인큐베이션합니다.
  2. hiPSC-CMs를 플렉시블 하이드로겔 기판에 파종하기 하루 전, 하이드로겔(Table of Materials) 분취액을 냉장고에서 얼음 위에서 해동한다.
  3. RPMI 1640 500mL, 50x B-27 보충제 10mL 및 페니실린-스트렙토마이신9 5mL를 혼합하여 심근세포 배지(재료 표)를 준비합니다.

2. 냉동보존된 hiPSC-CM의 시드

  1. 유연한 하이드로겔 기판에 hiPSC-CM을 파종하기 이틀 전에 0.1% 젤라틴 코팅된 멸균 6웰 플레이트에 hiPSC-CM을 사전 플레이트합니다. 표준 해동 프로토콜 9,25를 사용하여 hiPSC-CM을 해동합니다.
  2. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 웰 당 총 1,500,000 개의 hiPSC-CM (Table of Materials)을 플레이트합니다 (그림 1A) 26.
  3. hiPSC-CMs가 37°C 및 5%CO2에서 냉동보존으로부터 회복될 수 있도록 하기 위해 표준 심근세포 배지에서 2-4일 동안 배양하였다. 48 시간마다 100 % 심근 세포 배지로 소비 된 배지를 새로 고칩니다.

3. 사전 도금된 hiPSC-CM의 해리 및 계수

  1. 해리하기 전에 hiPSC-CM의 상태를 확인합니다. hiPSC-CM의 상태를 평가하여 생존력과 안정적인 박동을 보장합니다.
    참고: hiPSC-CM 모집단의 순도가 중요합니다(예: >90% 심장 트로포닌 T)7. 심근세포 선택 방법(예를 들어, 대사 선택 또는 분류)은 비심근세포 세포에 의한 하이드로겔 기질의 파괴를 감소시키기 위해 권장된다25,26.
  2. CaCl2 또는MgCl2 없이 D-PBS의 웰 당 4 mL로 hiPSC-CMs 2x를 세척한다 (표 of Materials). D-PBS를 흡인하고 실온 해리 시약 1mL를 각 웰에 첨가한 후 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
  3. 10mL의 심근세포 배지를 멸균된 15mL 원뿔형 튜브에 추가합니다.
  4. 1,000μL 피펫을 사용하여 6웰 플레이트에서 hiPSC-CM을 분리합니다(그림 1B). 세포 현탁액을 15 mL 원뿔형 튜브26에 첨가한다.
  5. 1mL의 신선한 심근 세포 배지로 웰을 헹구어 잔류 hiPSC-CM을 수집하고 15mL 원뿔형 튜브에 추가합니다. 원뿔형 튜브의 최종 부피를 15mL로 가져옵니다.
  6. 5 분 동안 원심 분리기 (200 × g). 상청액을 1mL 표시까지 제거합니다. 심근 세포 배지에서 세포를 5mL의 최종 부피로 재현탁합니다.
  7. 수동 또는 자동 셀 카운터로 hiPSC-CM을 계산합니다.
  8. 유연한 하이드로겔 기질이 준비되는 동안 실온에서 hiPSC-CM 현탁액을 배양합니다(최대 30분).

4. 플렉서블 하이드로겔 기질의 제조

  1. 1 μL의 20 μL 피펫 세트, 20 μL 피펫 팁(예를 들어, 20 μL) 및 멸균된 48-웰 유리 바닥판을 준비한다. 하이드로겔 기질을 만들기 전에 스톱워치/타이머가 준비되어 있는지 확인하십시오.
  2. 멸균 조직 배양 후드에서 ECM 기반 하이드로겔 기질을 튜브를 가볍게 두드려 혼합한 후 즉시 다시 얼음 위에 놓습니다.
  3. 그런 다음 첫 번째 하이드로겔 기판이 도금되기 직전에 스톱워치/타이머를 시작합니다(이것은 시간 0입니다).
  4. 하이드로겔 기질 1μL를 위아래로 피펫하여 ~3배 피펫 팁을 식힙니다. 희석되지 않은 하이드로겔 기질 ~1μL를 48웰 플레이트(그림 1C, 그림 2A 및 그림 3A)의 각 웰 바닥에 수평으로 바르고 피펫을 45° 각도로 유지합니다. 40x 배율 7,9,17,27에서 실험을 수행할 때 기질을 식별하는 데 도움이 되도록 각 웰(그림 2 및 그림 3)에서 동일한 방향으로 모든 하이드로겔 기질을 플레이트합니다.
    참고: 각 ~1μL 라인은 하나의 하이드로겔 기질입니다(그림 3). 일반적으로 48개의 우물을 준비하는 데 ~5분이 소요됩니다. 수평으로 기울어진 마이크로플레이트 스탠드(예를 들어, 30°)의 사용은 웰 및 히드로겔 기재의 바닥을 더 잘 볼 수 있게 할 수 있다. 우물의 전체 길이 (즉, 왼쪽에서 오른쪽으로)로 가야합니다. 짧은 하이드로겔 기질은 너무 두꺼울 수 있고, 따라서 기질 안정성을 감소시킬 수 있다. 하이드로겔 기질이 피펫 팁에서 건조되지 않도록 하십시오. 이 경우 신속하게 새 팁으로 전환하고 즉시 계속하십시오. 또는 냉장 피펫 팁을 사용할 수 있습니다. ECM 기반 하이드로겔 기판은 얼음 위에 있지 않을 때 빠르게 중합될 수 있습니다. 한 번에 여러 개의 웰(예를 들어, 10개)의 제조가 제안된다. 또한 모의 48웰 플레이트에서 연습하는 것이 좋습니다.
  5. 48-웰 플레이트 상에 뚜껑을 놓고, 하이드로겔 기질이 세포를 첨가하기 전에 멸균된 조직 배양 후드 내에서 실온에서 8-10분 동안 인큐베이션되도록 한다(도 2B).
    참고: 제안된 배양 시간을 준수하는 것이 중요합니다. 10분 이상의 배양 시간은 하이드로겔 기질이 뻣뻣해지고 눈에 띄는 수축이 없습니다. 배양 시간이 8분 미만이면 기질이 붕괴될 수 있습니다.
  6. 1,000μL 피펫을 사용하여 ~200μL의 낮은 배지 부피의 심근 세포 배지에서 웰당 ~30,000개의 실행 가능한 hiPSC-CM을 사용하여 hiPSC-CM을 하이드로겔 기질에 직접 적하합니다(그림 2B 및 그림 3B).
    참고: 이 공정은 하이드로겔 기질 중합을 중단하고 hiPSC-CM이 기질 7,9,17,27에 있는지 확인합니다.
  7. 플레이트에 뚜껑을 놓고 hiPSC-CM이 하이드로겔 기질에 부착될 수 있도록 멸균 조직 배양 후드에서 실온에서 10-15분 동안 방해받지 않고 배양합니다(그림 2C).
  8. ~100 μL의 신선한 심근세포 배지를 각 웰에 부드럽게 추가합니다(최종 부피: 웰당 ~300 μL). 플레이트 위에 뚜껑을 놓고, 2-4일 동안 37°C, 5%CO2 의 인큐베이터로 옮긴다. 수축 실험을 수행하기 전에 24시간마다 100% 배지를 새로 고칩니다.
    알림: 올바른 형태에 대해 hiPSC-CM을 육안으로 검사합니다. 도금 직후 hiPSC-CM은 둥글게 보여야 합니다(그림 3B). 파종 후 2일째까지 강력한 가시적 수축(보충 비디오 S2)과 함께 융합성 2D hiPSC-CM 단층 융합이 관찰됩니다(그림 3C)(보충 비디오 S1).

5. 수축 기록 및 분석

  1. CaCl2 0.5, NaCl 134, KCl 5.4, MgCl2 1, 포도당 10 및 HEPES 10을 포함하는 Tyrode의 용액 인 CCM 분석 배지를 준비하고, pH를 NaOH로 7.4로 조정하고, 수조에서 37 °C로 평형을 이룹니다.
    참고: 최대 세포외 칼슘(0.5mM)은 CCM 분석 창을 향상시키는 데 사용됩니다.
  2. 현미경과 환경 제어 챔버를 켜서 37°C 및 5%CO2로 평형을 이룹니다.
  3. 48웰 플레이트에서 심근세포 배지를 제거하고 600μL의 CCM 분석 배지로 각 웰을 두 번 부드럽게 헹굽니다.
  4. 웰당 300μL의 CCM 분석 배지를 추가하고 환경 제어 챔버의 현미경에 48웰 플레이트를 놓습니다. 전극을 삽입하고 5분 동안 셀을 평형화합니다.
  5. 비디오 기반 현미경을 사용하여 수축 비디오를 녹화합니다. 비디오 녹화 소프트웨어를 열고 프레임 속도를 100프레임/초로 설정합니다. hiPSC-CM 단층의 중심 부근에 있는 관심 영역(ROI)을 선택합니다.
    알림: hiPSC-CM 단층 가장자리 근처에서 ROI를 선택하지 마십시오., 수축성 기록에 불안정할 수 있기 때문에.
  6. 이어서, 상용 펄스 발생기(Table of Materials)로 세포를 자극하여 2D hiPSC-CM 단층을 전기적으로 페이스화한다. 기준선 펄스 매개변수(예: ~14V/cm의 2ms 자극 펄스 지속 시간을 갖는 단상 구형파 페이싱 펄스)를 사용하여 1Hz에서 1.5x 임계값에서 hiPSC-CM의 속도를 조절합니다17.
  7. 기준선, 페이싱만(즉, CCM 전)(그림 1D) 수축 비디오를 최소 5비트17,28에 대해 기록합니다.
  8. 그런 다음 실험적인 전기 신호로 hiPSC-CM 단층을 자극합니다(그림 1D). 이 프로토콜을 따르려면 표준 CCM 자극 파라미터를 사용하십시오: 5.14ms 위상 지속 시간(총 지속 시간 20.56ms), ~28V/cm(위상 진폭), 0 위상 간격 및 30ms 지연(즉, 페이싱 펄스 끝에서 CCM 펄스 시작까지의 시간)의 대칭 이상성 펄스 2개(그림 1D)29,30 , CCM으로 인한 수축 비디오를 최소 5비트 동안 녹화합니다.
  9. CCM 신호를 끄고, 기준선 페이싱 펄스로 자극하고, 최소 5비트 동안 회복 기간(즉, CCM 후)의 수축 비디오를 녹화합니다.
  10. 표준 수축 소프트웨어를 사용하여 수축 비디오를 자동으로 분석하고 주요 수축 특성(예: 수축 진폭, 수축 기울기, 이완 기울기, 피크까지의 시간, 기준선까지의 시간 90% 및 수축 지속 시간 50%)7,17,31,32.
  11. 기판에 도금한 후 2-14일 동안 수축 실험을 위해 유연한 하이드로겔 기판에 2D hiPSC-CM을 사용합니다.

결과

이 프로토콜에는 유연한 하이드로겔 기판에서 눈에 띄게 수축하는 2D hiPSC-CM 단층을 생성하는 간단하고 강력한 도구가 설명되어 있습니다. 수축 특성의 측정은 수축성 분석 소프트웨어와 결합된 비디오 기반 녹화를 통해 수행됩니다. 이를 통해 수축 진폭, 수축 기울기, 이완 기울기, 피크까지의 시간, 기준선까지의 시간 90% 및 수축 지속 시간 50%를 포함한 심근 세포 수축성의 주요 매개변수를 정량화할 수 있습니다. 이 모델은 다양한 "건강한" 기증자로부터 hiPSC-CM(그림 4)의 기본 수축 특성을 특성화하는 데 사용되며 심장 전기생리학 의료 기기 신호(즉, CCM)의 평가로 확장될 수 있습니다. 표준 CCM 자극 파라미터(그림 1D)29,30의 적용은 시험관 내에서 향상된 수축 특성을 가져왔습니다(그림 5 및 표 1)17.

우리는 또한 이 방법이 CCM 자극 유무에 관계없이 인간 수축 특성에 대한 세포외 칼슘 농도 조절의 효과를 평가하는 데 사용될 수 있음을 입증했습니다(그림 6)17. 수축의 예상 기준선 칼슘 의존성은 7,17뿐만 아니라 심근 세포 단층 수준에서 CCM에 의해 유도 된 칼슘 민감도의 증가가 관찰되었다. 또한, β-아드레날린 신호 전달 경로의 약리학적 조사(그림 7)는 CCM에 의해 유도된 근수축 효과가 부분적으로 β-아드레날린 신호 전달에 의해 매개된다는 것을 밝혀냈다17. 또한, 이 도구는 확장성 심근병증(DCM)33,34,35(그림 8)을 포함한 환자 특이적 질병 심근 세포로 확장되어 질병 상태의 맥락에서 CCM의 효과를 이해할 수 있습니다. 실제로, 향상된 수축 진폭과 가속화된 수축 및 이완 동역학은 여기에서 테스트된 CCM "용량"에서 관찰되었습니다(그림 8). 우리 실험실에는 CCM 모방 장치가 있지만 여기에 사용된 방법론은 해당 시스템에만 국한되지 않으며 다른 심장 전기생리학 장치에 적용될 수 있습니다.

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그림 1: 2D hiPSC-CM in vitro CCM 모델의 개략도 요약. (A) hiPSC-CM은 젤라틴(0.1%) 코팅된 6웰 플레이트에 단층 형식으로 사전 도금됩니다. (B) 배양 2일 후, hiPSC-CM을 해리시키고 유연한 하이드로겔 기판에 플레이팅하기 위해 준비합니다. (C) 분리된 hiPSC-CM을 48웰 형식으로 배열된 하이드로겔 기판에 고밀도로 도말하고(왼쪽) 세포외 칼슘 Tyrode 용액(오른쪽)에서 분석합니다. (D) 상용 펄스 발생기 및 표준 임상 CCM 펄스 파라미터29,30(오른쪽)이 hiPSC-CM을 자극하는 데 사용됩니다. 심장 기능은 비디오 기반 분석(왼쪽)으로 평가됩니다. (E) CCM 전(기준선: 5V), CCM 중(CCM: 10V) 및 CCM 후(회복: 5V)의 대표적인 수축 기록. 이 그림은 Feaster et al.17에서 다시 인쇄되었습니다. 약어: hiPSC-CM = 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포; CCM = 심장 수축성 조절. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 유연한 하이드로겔 기판 도금 및 시딩의 개략도 . (A) 완전히 해동되고 희석되지 않은 ECM 기반 하이드로겔 기질을 웰당 1μL의 하이드로겔 기질(오른쪽 패널)과 함께 멸균된 48웰 플레이트(왼쪽 패널)에 적용합니다. (B) 하이드로겔 기질을 실온에서 8-10분 동안 배양한 다음(오른쪽 패널) 고밀도 hiPSC-CM을 저중간 부피(~200μL)로 도금합니다(왼쪽 패널). (C) 배양 10-15분 후, 배지를 각 웰(왼쪽 패널)에 첨가하고, 플레이트를 표준 조직 배양 배양기(오른쪽 패널)로 옮긴다. 약어: ECM = 세포외 기질, hiPSC-CM = 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포; RT = 실온. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 세포외 기질 기반 하이드로겔 기질. (a) 대표적인 하이드로겔 기질(세포 없음)을 48-웰 유리 바닥판의 한 웰에 기판을 도포한 직후 웰에 도포한다. (B) hiPSC-CM이 시드된 후 시간 0. (C) hiPSC-CM이 시드된 후 24시간 후. 이 패널은 Feaster et al.17에서 재인쇄되었습니다. 흰색 화살표는 하이드로겔 기질의 가장자리를 나타내며, 4배 배율입니다. 스케일 바 = 1mm. 약어: hiPSC-CM = 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 2D hiPSC-CM 단층 수축 특성의 특성화. (A) 1Hz(5V)에서 페이싱된 2D hiPSC-CM의 대표적인 수축 기록. (B) 하나의 수축 주기를 나타내는 대표적인 수축 흔적. (C) 요약 막대 그래프. 데이터는 평균 ± SEM입니다. n=18. 약어: hiPSC-CM = 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 2D hiPSC-CM 수축 특성에 대한 CCM의 급성 영향. (A) CCM 전(5V), CCM 동안(10V) 및 CCM 후(5V)에 대한 대표적인 수축 기록. (B) 즉각적인 효과의 대표적인 수축 흔적(즉, +로 표시된 마지막 CCM 전 박동, 첫 번째 CCM 박동 및 첫 번째 CCM 후 박동). (C) 즉각적인 효과의 요약 막대 그래프. 백분율 변화, 데이터는 SEM± 평균입니다. n = 23. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. 이 그림은 Feaster et al.17에서 다시 인쇄되었습니다. 약어: hiPSC-CM = 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포; CCM = 심장 수축성 조절. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6: CCM 반응에 대한 세포외 칼슘 조절의 영향. (A) CCM 전(5V), CCM 동안(10V) 및 CCM 후(5V)에 대한 각 그룹에 대한 즉각적인 효과의 대표적인 수축 흔적; hiPSC-CM은 0.25-2 mM의 증가하는 농도의 세포외 칼슘(Cao)에 노출되었습니다. (B-D) 수축 특성(즉, 진폭 및 동역학)의 칼슘 민감도에 대한 CCM의 효과를 입증하는 눈을 안내하는 변환된 데이터(S자 모양)(언덕 기울기 = 1.0). n = 그룹당 6-8. 이 그림은 Feaster et al.17에서 다시 인쇄되었습니다. 약어: hiPSC-CM = 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포; CCM = 심장 수축성 조절. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 7: 약리학적 도전. CCM 전(5V), CCM 동안(10V) 및 CCM(5V) 후의 각 그룹에 대한 대표적인 수축 추적; hiPSC-CM을 (A) 비히클 또는 (B) 메토프롤롤(2μM)로 전처리하였다. (씨, 디) 각 조건에 대한 요약 막대 그래프입니다. 백분율 변화, 데이터는 SEM± 평균입니다. n=그룹당 10. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. 이 그림은 Feaster et al.17에서 다시 인쇄되었습니다. 약어: hiPSC-CM = 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포; CCM = 심장 수축성 조절. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 8: 질병이 있는 2D hiPSC-CM의 수축 특성에 대한 CCM의 급성 효과. (A) DCM L35P, 대조군 기준선(이전, 6V) 및 DCM L35P와 CCM(10V)에 대한 대표적인 수축 추적. (B) 요약 막대 그래프. 백분율 변화, 데이터는 SEM± 평균입니다. n = 3. *p < 0.05, **p < 0.01입니다. 약어: hiPSC-CM = 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포; CCM = 심장 수축성 조절; DCM = 확장성 심근병증. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 비디오 S1: 세포외 기질 기반 하이드로겔에서 hiPSC-CM의 타임랩스. 상기 유연한 하이드로겔 기판에 도말한 2차원 hiPSC-CMs; 시간: 0-90시간; 48 웰 유리 바닥 판의 하나의 웰; 4x 배율. hiPSC-CM은 수평 단층 싱크티움(즉, 왼쪽에서 오른쪽으로)을 형성합니다. 스케일 바 = 1mm. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 비디오 S2: 세포외 기질 기반 하이드로겔의 hiPSC-CM. 상기 유연한 하이드로겔 기판에 도말한 2차원 hiPSC-CMs; 시간: ~24시간; 48 웰 유리 바닥 판의 하나의 웰; 4x 배율. hiPSC-CM은 단층 형태를 형성하고 도금 후 ~24시간에 강력한 수축을 보입니다. 스케일 바 = 1mm. 이 비디오는 Feaster et al.17에서 가져온 것입니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

매개 변수증권 시세 표시기후
진폭16 ± 4%**4 ± 5%
피크 시간 50%-20 ± 9%*7 ± 5%
피크 시간 90%-22 ± 8%*6 ± 5%
기준선까지의 시간 50%-8 ± 5%4 ± 4%
기준선까지의 시간 90%-12 ± 6%*5 ± 5%
수축 지속 시간 10%-13 ± 6%3 ± 5%
수축 지속 시간 50%-6 ± 5 %3 ± 5%
수축 지속 시간 90%0 ± 5%3 ± 4%
N2323

표 1: 수축성 특성. CCM 이전과 비교한 백분율 변화(5V); 데이터는 CCM(10V) 동안 및 CCM(5V) 후(5V) 동안 각 그룹의 모든 비트에 대한 평균 ± SEM입니다. n = 23입니다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. 이 표는 Feaster et al.17에서 재인쇄되었습니다.

토론

본원에 요약된 프로토콜은 상업적 시약을 사용하여 유연한 세포외 기질(ECM) 기반 하이드로겔 기판 상에서 견고하게 수축하는 2D hiPSC-CM 단층을 생성하는 방법을 설명한다 7,17. 유연한 하이드로겔 기질에 시딩된 hiPSC-CM은 생존 가능성을 유지하고 향상된 수축 특성을 가지고 있습니다7. 이 기술은 표준 실험실 장비 및 기능에 의존합니다7. ECM 기반 하이드로겔 기질 작업과 관련된 것을 포함하여 프로토콜에는 세부 사항에 세심한 주의가 필요한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 한 가지 잠재적인 문제는 배지에 혈청이 존재한다는 것입니다. 이로 인해 hiPSC-CM이 합류 단층 시트 대신 네트워크(예: 내피/혈관 네트워크)를 형성할 수 있습니다. 따라서 유연한 하이드로겔 hiPSC-CM 단층을 구축하는 동안(즉, 0일에서 4일까지) 무혈청 배지를 사용하는 것이 좋습니다. 마찬가지로, 한 번에 너무 많은 하이드로겔 기질을 준비하면 작업자의 피로로 인해 기질이 불량하거나 고르지 않을 수 있습니다. 신속하게 작업하는 것이 중요하지만 각 하이드로겔 기질의 무결성이 중요합니다. 마찬가지로 hiPSC-CM을 조심스럽게 시드하고 매체를 변경해야 합니다. 이것은 강제적으로 수행되어서는 안됩니다. 배지를 변경할 때 하이드로겔 기질이나 세포를 방해하지 않도록 웰의 상단 가장자리에서 부드럽게 첨가해야 합니다. 표준 2D hiPSC-CM 배양(즉, 기존의 조직 배양 플라스틱 또는 유리)과 마찬가지로 저밀도로 도금하면 불완전한 단층 형성이 발생합니다. hiPSC-CM을 육안으로 검사하여 하이드로겔 기질에 있는지 확인하고 정확한 타이밍을 보장하기 위해 타이머를 사용하는 것이 중요합니다. 또한, 하이드로겔 기판 상에서 2D hiPSC-CM 단층을 14일 이상 배양하는 것은 ECM 특성 및 기판 제조업체의 지침에 따라 단층 파괴를 초래할 수 있습니다.

현재 방법에는 고려해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 이 프로토콜에 사용된 셀은 상용 hiPSC-CM 제공업체의 셀이었고, 이러한 셀은 전기적으로 결합된 셀의 동기화체를 형성합니다. syncytium에는 세 가지 심장 아형(즉, 심실, 심방 및 결절)의 hiPSC-CM이 혼합되어 있습니다17. 연구는 아형 배타적 hiPSC-CM 집단(즉, 100% 심실 또는 100% 심방)의 이점을 얻을 수 있습니다. 둘째, 이 방법은 hiPSC-CM만 사용하는 반면, 심장 섬유아세포, 내피 세포 및 뉴런을 포함한 비근세포는 hiPSC-CM 기능을 향상시킬 수 있습니다22,36. 셋째, 2D hiPSC-CM은 자발적인 박동, 비정질 형태 및 근수축 반응의 결여를 포함하여 상대적으로 미성숙한 심근세포의 몇 가지 특징을 나타낸다 8,37. 넷째, 이 프로토콜은 견고하게 수축하는 2D hiPSC-CM 단층을 생성하지만, 공학적 심장 조직(ECT)과 같은 기능적으로 향상된 3D hiPSC-CM 모델은 생리학적 칼슘 농도 8,38에서 향상된 CCM 유도 수축 반응을 초래할 가능성이 높습니다. 마지막으로, 여기에 설명된 프로토콜은 48웰 형식을 위해 설계되었습니다. 그러나 최적화 및 자동화 포함을 통해 고처리량 형식(예: 96웰 또는 384웰 플레이트)으로 확장할 수 있습니다.

현재 hiPSC-CM 연구의 황금 표준은 기존의 엄격한 2D 배양 조건(즉, 조직 배양 플라스틱 또는 유리)입니다. 전기생리학(electrophysiology)3 및 칼슘 취급(calcium handling)39 연구에 유용하지만, 종래의 방법론은 최소한의 수축 특성을 초래한다 5,6,7. 그 결과, 종래의 엄격한 2D 배양 조건은 CCM수축 효과8의 평가에 적합하지 않다. 기능적으로 강화된 3D hiPSC-CM ECT 방법(38)은 기술적으로 도전적이고, 시간이 많이 걸리며, 모든 실험실에서 쉽게 이용할 수 없는 정교한 장비를 필요로 한다. 이 프로토콜에서는 3D ECT 방법 또는 장기간의 기존 2D 방법 7,40,41보다 짧은 시간 내에 견고하게 수축하는 2D hiPSC-CM 단분자층을 생성하는 간단한 방법론을 설명합니다. 또한, 여기에 사용된 시약은 하이드로겔 기질 및 hiPSC-CM을 포함하여 상업적으로 이용 가능하며, 둘 다 상당한 로트 간 일관성을 가지고 있습니다. 탈착식 백금 와이어 전극(전극간 거리: 2.0mm, 너비: 1.0mm)을 사용했지만 다양한 전극 재료 및 구성은 시험관 내 CCM 수축 평가를 받을 수 있습니다. 8,15,17,18,22. 마찬가지로, 수축 비디오(7,31,32)의 분석을 가능하게 하는 다수의 자동화된 소프트웨어가 이용가능하다.

심장 의료기기 수축성을 평가하기 위한 대부분의 비임상 방법은 비용이 많이 드는 생체 내 동물 모델(예: 개 또는 돼지)과 기술적으로 까다로운 유두 근육 스트립(예: 토끼)에 크게 의존합니다18. 이 논문은 심장 전기생리학 의료 기기 신호가 수축성에 미치는 영향을 평가하기 위해 인간 체외 모델을 설명했습니다. 이 도구는 동물 연구에 대한 의존도를 줄이고 심장 전기 생리학 장치의 수축 특성에 대한 시험관 내 평가에 유용할 수 있습니다.

공개

이 기사는 저자의 견해를 반영하며 미국 식품의약국(FDA)의 견해나 정책을 나타내는 것으로 해석되어서는 안 됩니다. 여기에 보고된 자료와 관련하여 상업용 제품, 출처 또는 사용에 대한 언급은 보건복지부가 해당 제품을 실제로 또는 묵시적으로 보증하는 것으로 해석되어서는 안 됩니다. 저자는 이 작업에 대해 경쟁적인 이해 관계를 선언하지 않습니다.

감사의 말

이 작업은 미국 에너지부와 미국 식품의약국(FDA) 간의 기관 간 협정을 통해 Oak Ridge Institute for Science and Education에서 관리하는 장치 및 방사선 건강 센터의 연구 참여 프로그램에 임명됨으로써 부분적으로 지원되었습니다. 저자는 Richard Gray, Trent Robertson 및 Anna Avila의 제안과 기술 지원에 감사드립니다. 이 연구는 미국 식품의약국(FDA), 과학 및 공학 연구소를 통해 자금을 지원받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1% GelatinSTEMCELL Technologies7903Pre-plating Culture Substrate
48-well PlateMatTek P48G-1.5-6-FHydrogel Substrate hiPSC-CM Culture, Glass
6-well PlateThermofisher140675hiPSC-CM Culture, Plastic
B-27 Supplement, with insulinInvitrogen17504-044Cardiomyocyte Media
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2)Fisher Scientificc70-500Tyrode’s solution
CellOPTIQ Platform and Software Clyde BiosciencesContraction Recording and Analysis
Conical tube 15 mLCorning 352099hiPSC-CM Dissociation
Digital CMOS CameraHamamatsuC11440-42U30Contraction Video Recording
D-PBSLife Technologies14190-144Cell Wash
Environmental Control ChamberOKOLAB INCH201-K-FRAMEEnvironmental Regulation
Glucose Sigma-AldrichG8270-1kgTyrode’s solution
HemocytometerFisher Scientific22-600-107hiPSC-CM Counting
HEPESSigma-AldrichH3375Tyrode’s solution
iCell Cardiomyocytes Plating MediumFujifilm Cellular Dynamic, Inc. M1001hiPSC-CM Plating Media
iCell Cardiomyocytes2, 01434Fujifilm Cellular Dynamic, Inc. R1017hiPSC-CMs
Incubator (37 °C, 5% CO2)Thermofisher50116047Maintain hiPSC-CMs
Inverted MicroscopeOlympusIX73Imaging hiPSC-CMs
Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2) Fisher Scientificm33-500Tyrode’s solution
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane MatrixCorning 356230Flexible Hydrogel Substrate
Microcentrifuge tubes 1.5 mlFisher Scientific05-408-129Hydrogel Substrate Aliquot
Model 4100 Isolated High Power StimulatorAM-SystemsModel 4100 Pulse Generator
MyCell Cardiomyocytes DCM LMNA L35P, 01016Fujifilm Cellular Dynamic, Inc. R1153DCM hiPSC-CMs
Pen-StrepInvitrogen15140-122Cardiomyocyte Media
Pipette L-20Rainin17014392Plating Hydrogel Substrate
Pipette P1000Fisher ScientificF123602G
Pipette tips, 1000 ulFisher Scientific02-707-509
Pipette tips, 20 ulRaininGPS-L10SMaking Hydrogel Substrate
Potassium Chloride (KCl) Fisher ScientificP330-500Tyrode’s solution
RPMI 1640, with glucose Invitrogen11875Cardiomyocyte Media
Sodium Chloride (NaCl)Fisher Scientifics641-212Tyrode’s solution
Sodium Hydroxide (NaOH)Sigma-Aldrich221465Tyrode’s solution
Stimulation ElectrodesPacing and CCM Stimulation
Stopwatch/TimerFisher Scientific02-261-840Plating Hydrogel Substrate
Trypan Blue StainLife TechnologiesT10282hiPSC-CM Counting
TrypLE Express Life Technologies12605-010hiPSC-CM Dissociation

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