Обезболивающее действие туина на крысиных моделях с компрессией ганглионарной боли заднего корешка

Резюме

В данной статье представлена манипуляция для лечения хронической компрессии ганглия заднего корешка у крыс с помощью терапии Туйна, а также метод оценки ее эффективности на основе болевого поведения и гистопатологических результатов.

Аннотация

Нейропатическая боль является распространенным состоянием, которое поражает 6,9%-10% населения и возникает в результате повреждения нервов различной этиологии, таких как грыжа межпозвоночного диска поясничного отдела, стеноз позвоночного канала и стеноз межпозвонкового отверстия. Несмотря на то, что Туйна, традиционная китайская мануальная терапия, показала обезболивающий эффект в клинической практике для лечения нейропатической боли, лежащие в ее основе нейробиологические механизмы остаются неясными. Животные модели необходимы для выяснения основных принципов Туины. В этом исследовании мы предлагаем стандартизированный протокол Tuina для крыс с компрессией ганглия заднего корешка (DRG), который включает в себя индуцирование компрессии DRG путем введения стержня из нержавеющей стали в межпозвонковое отверстие, выполнение манипуляций Tuina с определенными параметрами локализации, интенсивности и частоты в контролируемой среде, а также оценку поведенческих и гистопатологических исходов лечения Tuina. В этой статье также обсуждаются потенциальные клинические последствия и ограничения исследования и предлагаются направления для будущих исследований Tuina.

Введение

В клинических условиях часто наблюдается неврологическая патологическая боль, вызванная компрессией нервных корешков по разным причинам. Наиболее типичной формой этой нейропатической боли является грыжа межпозвоночного диска поясничного отдела позвоночника (ЛДГ), которая часто является постоянной, рецидивирующей и трудно излечимой. Примерно 9% населения мира страдают от ЛДГ, что приводит к значительному социальному и экономическому бремени¹. Частота возникновения этого типа нейропатической боли увеличивается с каждым годом, с тенденцией к более молодому возрасту пациентов из-за изменений в производстве и образе жизни^{человека.} Несмотря на применение нестероидных обезболивающих, симптомы пациентов не могут быть полностью облегчены. В результате, альтернативные методы лечения, такие как Tuina, для лечения боли, вызванной ЛДГ, привлекают все большее внимание.

Терапия Tuina, форма консервативного лечения ЛДГ, широко рекомендована в различных клинических руководствах по всему миру для профилактики и лечения боли в пояснице ^3,4. Исследования показали, что Tuina может значительно снизить уровень воспалительных факторов, таких как сывороточный IL-6 и фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α) у пациентов с ЛДГ, одновременно уменьшая боль и нарушение функции поясницы у пациентов⁵. Тем не менее, конкретный механизм, лежащий в основе обезболивающих эффектов терапии Tuina, остается неясным.

Животные модели являются ценным инструментом для изучения нейропатической боли, вызванной ЛДГ⁶. Они позволяют проводить поведенческие измерения для оценки эффективности терапии Tuina и предоставляют образцы патологической физиологии ЛДГ. Например, образцы из ганглиев задних корешков бедра могут быть взяты для проверки изменений в ганглиозных клетках задних корешков. Хроническая компрессия модели ганглия заднего корешка (CCD) обычно используется для оценки патологической физиологии ЛДГ, поскольку она вызывает повреждение морфологии ганглиозных клеток дорсальных корешков, которые согласуются с патологическими изменениями, наблюдаемыми в клинических случаях компрессии нерва, вызванной грыжей диска⁷.

Многие ученые провели несколько экспериментов на животных по точечной анальгезии ^8,9,10. Однако при выполнении операций точечного массажа на животных моделях часто имитируют точечный массаж человека. На лечебный эффект точечного массажа влияют такие факторы, как величина, частота и направление приложенной силы^11,12,13. Если в эксперименте отсутствует единый стандарт точечного массажа, такой как сила, частота и продолжительность операции, это может привести к некоторым отклонениям в результатах эксперимента. В данной статье представлен набор планов лечения точечным массажем, основанных на характеристиках крыс CCD, и содействие разработке стандартизированных операций точечного массажа на животных моделях.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Эта работа была проведена в лаборатории боли Института нейробиологии Фуданьского университета. Эксперименты были одобрены и строго соблюдались в соответствии с рекомендациями по защите лабораторных животных, установленными Международной ассоциацией по изучению боли (LASP) для всех хирургических процедур и обращения с животными. Для настоящего исследования были использованы чистые крысы Спрэга-Доули (SD), состоящие из 32 самцов в возрасте от 40 до 50 дней, со средним весом 220 ± 1,38 г. Эти крысы были получены из Центра экспериментальных животных Шанхайской академии наук о жизни Китайской академии наук. За животными осуществлялся надлежащий уход и размещение в специальном помещении с независимой вентиляцией, регулируемой температурой (22 ± 1 °C) и влажностью (40%-50%). Крысы имели доступ к достаточному количеству пищи и воды в своих клетках. В комнате для лабораторных животных соблюдался 12-часовой цикл света и темноты, чтобы поддерживать регулярность циркадных ритмов крыс, а специальный персонал регулярно заменял подкладку. Рентген был выполнен в отделении радиологии больницы интегрированной традиционной китайской и западной медицины Юэян, аффилированной с Шанхайским университетом традиционной китайской медицины.

1. Участники исследования и группировка

1. Распределите 32 крысы по четырем группам: наивная (контроль), симуляция (имитация операции), CCD (хроническая компрессия ганглия заднего корешка) и CCD + Tuina (8 крыс в группе). Крысы имели свободный доступ к пище и воде в животноводческих помещениях.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наивные крысы не подвергались вмешательству, в то время как бутафорская группа подверглась той же хирургической процедуре, что и крысы группы CCD, но без оставления «L»-образного стержня из нержавеющей стали в межпозвонковом отверстии L4 и L5. Крысам в группе CCD была проведена полная операция по компрессии ганглия заднего корешка. Крысы в группе CCD + Tuina получали терапию туйной, начиная с четвертого дня после операции CCD.

2. Создание животной модели

1. Вводят изофторан для обезболивания крыс. Как только крысы потеряют сознание (нет рефлекса взмахивания хвостом или рефлекса сгибания ног), сбрейте волосы в области операции с помощью бритвы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обезболивающие препараты наносили за 15 мин до операции, а крысам подкожно вводили трамадол в дозе 20 мг/кг.
2. Закрепите крысу на пенопластовой доске (см. Таблицу материалов) и используйте резинки, чтобы зафиксировать ее конечности и резцы. Протирайте подготовленный участок стерильным препаратом из чередования спирта и йода в течение минимум 3 циклов.
3. Вставьте L-образный зонд (см. Таблицу материалов).
   1. Ножницами сделайте послойный разрез 2-3 см через кожу, поверхностную фасцию и глубокую фасцию. Во-первых, найдите переднюю верхнюю подвздошную кость, которая соответствует пятому поясничному отделу позвоночника. Затем последовательно локализуют третий и четвертый остистые отростки.
   2. Зажмите остистый отросток зубчатыми щипцами и приподнимите его, чтобы ножницы оказались близко к правой стороне остистого отростка и перерезали мышцу, прикрепленную к правой стороне остистого отростка.
   3. Затем тупо рассекайте мышцу, прикрепленную к наружной поверхности позвоночной пластинки, до тех пор, пока не возникнет сопротивление с правой стороны. Выпячивание представляет собой скуловой сустав. Аналогично тупо рассеките мышцу и фасцию на скуловом суставе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поперечный отросток, указывающий в направлении головы крысы, сначала затрагивается в нижней наружной передней части зигапофизиального сустава. Ниже поперечного отростка находится межпозвонковое отверстие, которое заполнено нервными корешками и окружающими мягкими тканями, и его обычно нелегко найти.
   4. Сначала с помощью «L»-образного зонда для определения положения межпозвонкового отверстия, а затем с помощью «L»-образного стержня из нержавеющей стали (который нужно изготовить диаметром 0,4 мм и длиной 4 мм) ввести его в межпозвонковое отверстие.
   5. Если ганглий заднего корешка успешно сдавлен, у крысы будет наблюдаться взмах хвостом и рефлекс сгибания ног. Вставьте стержень из нержавеющей стали в четвертое и пятое поясничное межпозвонковое отверстие. Затем наложите швы (3-0, см. Таблицу материалов) на мышцу, фасцию и кожу слой за слоем.
4. Поместите крысу в термостатический ящик, пока она не проснется. После пробуждения понаблюдайте, нормализована ли функция правой задней конечности крысы. Если есть волочение, значит, операция повредила двигательные нервы, и крысу следует выбросить. Если функция правой задней конечности в норме, крысу можно использовать и поместить в клетку для кормления.

3. Туинотерапия

1. Создайте комфортные условия: перед началом терапии Tuina акклиматизируйте крысу в ограничителе в течение 30 минут, чтобы дать ей возможность адаптироваться (рис. 1). Это приспособление может полностью обнажить бедро крысы и обездвижить его, облегчая маневры Туина (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Температура в процедурном кабинете должна поддерживаться в пределах 22-26 °C, а влажность должна быть в пределах 40%-50%.
2. Стандартизация Tuina: убедитесь, что терапевты носят беспроводные рукава для пальцев, которые могут контролировать давление и частоту Tuina и предоставлять данные обратной связи в режиме реального времени. Сначала потренируйтесь с данными обратной связи пальцевых рукавов, регулируя усилие до 5 Н и частоту до 2 Гц. Затем выполните те же маневры на крысах, сохраняя постоянную силу и частоту на протяжении всей процедуры (рис. 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Основываясь на нашей предыдущей работе, рассчитанное оптимальное усилие прессования составляет 5 Н (подробнее см. раздел «Обсуждение»).
3. Определите акупунктурную точку: выберите икроножную мышцу правой задней конечности в качестве области Туина крысы, в месте соединения двух головок икроножной мышцы, примерно в месте расположения BL57¹⁴.
4. Выполните Туину: убедитесь, что терапевт смотрит на заднюю часть бедра крысы и держит правую заднюю конечность крысы правой верхней конечностью. Расположите большой палец вертикально на акупунктурной точке BL57 и убедитесь, что предплечье и пальцы прилагают усилие для выполнения ритмичных вращательных движений на малом расстоянии, прилагая давление 5 Н (Рисунок 3).
5. Во время лечения следите за тем, чтобы сила и частота обратной связи манипуляций соответствовали заданным значениям. Начните вмешательство с четвертого дня после операции, при этом Туйна выполняется один раз в день по 15 мин, непрерывно в течение 18 дней.

4. Поведенческое тестирование боли

ПРИМЕЧАНИЕ: Поведенческие тесты проводились до моделирования, после моделирования, в 1-й день вмешательства, 3-й день вмешательства, 7-й день вмешательства, 14-й день вмешательства, 17-й день вмешательства и 21-й день вмешательства.

1. Выполните определение порога реакции на механическую стимуляцию (Paw Withdrawal Threshold, PWT), выполнив следующие действия (рис. 4).
   1. Используйте метод фон Фрея для проверки порога реакции на механическую стимуляцию в ногах крыс. Поместите крыс в прозрачный отсек из закаленного стекла размером 20 см × 10 см × 20 см, который поместили на подставку из металлической проволочной сетки с отверстиями 10 мм × 10 мм на высоте 40 см. Поддерживайте температуру в помещении на уровне 23 ± 2 °C, а окружающую среду — в тишине.
   2. Измерьте механический порог отвода с помощью электронных волокон фон Фрея (см. таблицу материалов). Стимулируйте центр стопы крысы до тех пор, пока она не начнет заметно двигаться, например, поднимать ногу или избегать ее. Машина автоматически регистрирует максимальное значение давления (Н).
   3. Подождите 15 секунд или больше, прежде чем снова стимулировать ту же крысу. Каждая стимуляция не должна превышать 5 с, чтобы предотвратить тактильную сенсибилизацию в лапах крысы. Повторите испытание пять раз до тех пор, пока три последовательных измерения не будут отличаться менее чем на 10 Н.
2. Выполните латентность вывода лапы (PWL) в ответ на тепловую стимуляцию (рис. 5).
   1. Оценивают PWL по методу Харгривза^15,16. Поместите крыс в небольшую камеру из прозрачного закаленного стекла, размером 20 см х 10 см х 20 см, с прозрачной стеклянной крышкой с вентиляционным отверстием. Нагрейте центральную часть стеклянной крышки до 45 °C с помощью нагревательной пластины, пока она не достигнет стабильной температуры.
   2. Во время фазы поведенческого тестирования акклиматизируйте крыс в поведенческой лаборатории не менее 2 часов каждый день, чтобы свести к минимуму влияние факторов окружающей среды на результаты тестирования.
   3. Перед формальным тестированием поместите крыс в поведенческую лабораторию на 30 минут, чтобы они могли адаптироваться к окружающей среде и уменьшить помехи.
   4. Нагрейте нагревательную пластину до 45 °C и поместите задние конечности крысы на нагревательную пластину.
   5. Латентность отведения лапы (PWL) определялась как время от начала нагрева до появления рефлекса отведения лапы в ответ на тепловую стимуляцию. В каждом тесте проверяйте одну и ту же заднюю конечность три раза подряд и среднее значение, чтобы получить латентность ответа этой задней конечности. После тестирования верните крыс в клетки для кормления.

5. Перфузия

1. Приготовление: заранее приготовьте 0,9% солевой раствор и 4% раствор параформальдегида. Поместите солевой раствор в духовку с постоянной температурой 37 °C и храните раствор параформальдегида в холодильнике при температуре 4 °C для последующего использования.
2. Проведите анестезию и установите доступ.
   1. Начните с введения 25% уретана (0,6 мл/100 г, см. таблицу материалов) в брюшную полость крысы, чтобы вызвать глубокую анестезию. Подождите, пока не исчезнет рефлекс пальца ноги, роговицы или поворота. Закрепите крысу на пенокартоне.
   2. Разрежьте грудную кость ножницами и вскрывайте кожу и фасцию слой за слоем. Отрежьте диафрагму и отрежьте ребра с обеих сторон, чтобы полностью обнажить сердце. Аккуратно отделите перикард. Отделите легкие от сердца.
   3. Используйте щипцы, чтобы потянуть и обнажить аорту, потянув сердце на себя. Совместите иглу, левый желудочек и аорту по прямой линии и в одной горизонтальной плоскости. Затем введите иглу из левого желудочка в аорту до тех пор, пока игла не станет видна внутри аорты.
   4. С помощью щипцов зажмите аорту и иглу внутри аорты, а затем разрежьте левое предсердие ножницами. В это время из левого предсердия будет хлестать большое количество крови. Откройте клапан для физиологического раствора и подсоедините инъекцию физиологического раствора к перфузии физиологического раствора с температурой 37 °C, в общей сложности около 150-200 мл.
3. После завершения перфузии физиологического раствора переключитесь на 4% раствор параформальдегида и перфузируйте 4% раствором параформальдегида в общей сложности около 400 мл при 4 °C. При начале перфузии параформальдегида удерживайте передние зубы крысы одной парой щипцов и тяните их вперед, придерживая хвост одной рукой и тяну его назад, что выгодно для полного вытяжения позвоночника и увеличения межпозвонкового отверстия для облегчения отбора проб DRG.
4. Во время перфузии печень крысы, брыжейка и большой сальник постепенно бледнеют до тех пор, пока печень не станет жесткой. Затем уменьшите скорость потока и отрегулируйте ее примерно до 2 капель в секунду, пока весь параформальдегид не будет перфузирован.

6. Скопление ганглия заднего корешка

ПРИМЕЧАНИЕ: После перфузии быстро отрежьте поясничный отдел позвоночника крысы. Найдите межпозвонковое отверстие L5 и L4, соединив самые высокие точки гребня подвздошной кости с обеих сторон с поясничным остистым отростком L5 с помощью этого метода позиционирования, и удалите ганглий заднего корешка из межпозвонкового отверстия. Конкретный метод сбора следующий:

1. От входа в спинномозговой канал (грудной позвоночный канал) введите ножницы в спинномозговой канал и отрежьте пластинку с обеих сторон до тех пор, пока все пластинки не будут полностью удалены, обнажив весь спинномозговой канал.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить спинной мозг и нервные корешки за пределами спинномозгового канала при разрезании пластинок.
2. Осторожно извлеките спинной мозг и заднюю продольную связку. Отделяют твердую мозговую оболочку, прикрепленную к внутреннему отверстию межпозвоночного отверстия.
3. Используйте офтальмологические щипцы, чтобы пережать и вытащить ганглий заднего корешка, который имеет форму жемчужины и слегка желтоватый.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за хрупкости и плохой жесткости нервной ткани необходимо ухватиться за силу и направление тяги при вытаскивании ганглия заднего корешка и не использовать грубую силу.
4. При вытягивании ганглия заднего корешка заранее очистите окружающие мягкие ткани, включая твердую мозговую оболочку и паутинную оболочку, чтобы облегчить плавное вытягивание ганглия заднего корешка.
5. Поместите ганглий заднего корешка на впитывающую бумагу, отрежьте аксон лезвием и очистите кровеносные сосуды на поверхности ганглия заднего корешка.
6. После обрезки взвешивают ганглий заднего корешка и погружают его в 4%-ный раствор параформальдегида с концентрацией 4% и температурой 4 °С на достаточное время, обычно около 2-4 ч, затем переносят ганглий заднего корня в заранее приготовленный 10%, 20% и 30% раствор сахарозы PB (4 °С) для ступенчатого обезвоживания.

7. Криосекционирование

1. Начните с помещения ганглия заднего корешка в раствор PBS 0,01 М. Встряхните их в течение 10 минут, а затем смойте раствором сахарозы. Аккуратно обрежьте волокна аксонов обоих сегментов ганглиев задних корешков. Очистите замораживающую головку криосекционной машины и добавьте в нее компаунд оптимальной температуры резки (OCT) (см. Таблицу материалов).
2. Поместите замораживающую головку на поверхность металлической оболочки, содержащей жидкий азот, подождите, пока ткань замерзнет, извлеките ее и обрежьте. После этого поместите замораживающую головку на основание слайсера. Толщина срезов ганглиев задних корешков должна составлять 15 мм. Разложите нарезанные тонкие срезы в деревянной коробке по порядку и храните их в холодильнике при температуре -20 °C, вдали от света.

8. Окрашивание гематоксилином и эозином

1. Поместите срезы на 2 минуты в ксилол и обезвоживайте их в ряде спиртов, включая 100%, 95%, 80% и 70%, в течение 2 минут каждый. Затем срезы помещают на 2 мин в дистиллированную воду, 1 мин в гематоксилин, проводят 5 мин промывки водопроводной водой и проводят дифференцировку в 1% солевом спиртовом растворе в течение 30 с, а затем 30 с в насыщенном карбонате лития.
2. Затем поместите ломтики на 2 минуты каждый в дистиллированную воду и водопроводную воду, на 5 минут в раствор эозина (0,5%), быстрое полоскание на 1 минуту в дистиллированной воде, два раунда по 2 минуты в 95% и 100% спирте, 30 с в 100% ксилол с добавлением бикарбоната натрия, три раунда по 3 минуты в ксилоле и, наконец, уплотнить нейтральным бальзамом (см. Таблицу материалов).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Туйна-терапия может помочь снизить пороги механической и тепловой стимуляции крыс, вызванные ПЗС-моделированием
Через 17 дней терапии Туина наблюдалась достоверная разница в пороговых значениях ЛУП между крысами с ПЗС, получавшими терапию Туйной, и группой, не получавшей ПЗ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Наша исследовательская группа провела соответствующие исследования по параметрам манипуляций Туина на ранней стадии. Во-первых, важно установить интенсивность силы для манипуляции Туйна. В клинике Tuina практикующие врачи регулируют интенсивность силы в соответствии со своим опытом и ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
"L" stainless steel rod (4 mm long and 0.4 mm in diameter)	hand-made	/	For CCD models making
ALMEMO admeasuring apparatus	ahlborn	2450-1	Mechanical Withdrawal Threshold test
Constant temperature slicer CM-1900	Leica	1491950C1US	For specimen production
Disinfectant (iodine) 100 mL/bottle	LIRCON/Shandong Lilkang	/	For disinfection
Disposable sterile syringe 5 mL	Shanghai Misha Wa Medical Industry	/	For injection
Electron microscope CX-31	Olympus, Japan	BJ002318	For specimen observation
Finger pressure recordings	Suzhou Changxian Optoelectronic Technology	CX1003w	For Tuina manipulation
Foam board (35 cm x 20 cm)	hand-made	/	It is our homemade apparatus for fixing rats
MERSILK W2512	Johnson & Johnson	/	For tissue suture
Neutral balsam	Sinopharm Chemical Reagent	10004160	For specimen production
paraformaldehyde	China National Chemical Reagent	/	For specimen production
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761	For anesthesia of rat
Plantar Test Apparatus (Hargreaves Method) for Mice and Rats	IITC Life Science	/	Paw Withdrawal Latency
Precision electronic scale for experiment JY3002	Shanghai Precision Scientific Instrument	/	Weighing of rat
Rat hair clipper	Philips	HP6341/00	Shaving of rat fur
Restrainer for rats	Tongji University (self-made)	/	It is a homemade apparatus made by Tongji University, which can effectively immobilize the rats and fully expose their hind limbs.
Tissue-Tek O.C.T. Compound	SAKURA	4583	For specimen production
Uratan	China National Chemical Reagent	/	For anesthesia of rat
X-ray detector XR-600	Dongguan Kaso Electronic Technology	/	Examination of CCD models
xylene	Shanghai Sinopharm Group	100092	For specimen production