Effetto analgesico di Tuina su modelli di ratto con compressione del dolore al ganglio della radice dorsale

Riepilogo

Questo articolo presenta una manipolazione per il trattamento della compressione cronica del ganglio della radice dorsale nei ratti utilizzando la terapia Tuina, insieme a un metodo per valutarne l'efficacia in base al comportamento del dolore e ai risultati istopatologici.

Abstract

Il dolore neuropatico è una condizione prevalente che colpisce il 6,9%-10% della popolazione e deriva da danni ai nervi dovuti a varie eziologie, come l'ernia del disco lombare, la stenosi del canale spinale e la stenosi del forame intervertebrale. Sebbene il Tuina, una terapia manuale tradizionale cinese, abbia mostrato effetti analgesici nella pratica clinica per il trattamento del dolore neuropatico, i suoi meccanismi neurobiologici sottostanti rimangono poco chiari. I modelli animali sono essenziali per chiarire i principi di base del Tuina. In questo studio, proponiamo un protocollo Tuina standardizzato per ratti con compressione del ganglio della radice dorsale (DRG), che prevede l'induzione della compressione DRG inserendo un'asta in acciaio inossidabile nel forame intervertebrale, eseguendo la manipolazione Tuina con parametri specifici di localizzazione, intensità e frequenza in un ambiente controllato e valutando gli esiti comportamentali e istopatologici del trattamento Tuina. Questo articolo discute anche le potenziali implicazioni cliniche e i limiti dello studio e suggerisce direzioni per la ricerca futura su Tuina.

Introduzione

In ambito clinico, è comune osservare dolore patologico neurologico causato dalla compressione della radice nervosa per vari motivi. La forma più tipica di questo dolore neuropatico è l'ernia del disco lombare (LDH), che è spesso persistente, ricorrente e difficile da curare. Circa il 9% della popolazione mondiale è affetta da LDH,^{con conseguenti} oneri sociali ed economici significativi. L'incidenza di questo tipo di dolore neuropatico aumenta di anno in anno, con una tendenza verso i pazienti più giovani, a causa dei cambiamenti nella produzione umana e nello stile di vita². Nonostante l'uso di antidolorifici non steroidei, i sintomi dei pazienti non possono essere completamente alleviati. Di conseguenza, le terapie alternative, come Tuina, per il trattamento del dolore causato da LDH hanno guadagnato un'attenzione crescente.

La terapia Tuina, una forma di trattamento conservativo per l'LDH, è ampiamente raccomandata in varie linee guida di pratica clinica in tutto il mondo per la prevenzione e il trattamento del dolore lombare ^3,4. La ricerca ha dimostrato che Tuina può ridurre significativamente i fattori infiammatori come i livelli sierici di IL-6 e il fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-α) nei pazienti con LDH, migliorando al contempo il dolore e la compromissione della funzione lombare^{dei pazienti 5}. Tuttavia, il meccanismo specifico alla base degli effetti antidolorifici della terapia Tuina rimane poco chiaro.

I modelli animali sono uno strumento prezioso per studiare il dolore neuropatico causato da LDH⁶. Consentono misurazioni comportamentali per valutare l'efficacia della terapia Tuina e fornire campioni della fisiologia patologica dell'LDH. Ad esempio, è possibile prelevare campioni dai gangli della radice dorsale nella coscia per verificare i cambiamenti nelle cellule del ganglio della radice dorsale. La compressione cronica del modello del ganglio della radice dorsale (CCD) è comunemente utilizzata per valutare la fisiologia patologica dell'LDH, in quanto provoca danni alla morfologia delle cellule gangliari della radice dorsale che sono coerenti con i cambiamenti patologici osservati nei casi clinici di compressione nervosa causata dall'ernia del disco⁷.

Molti studiosi hanno condotto diversi esperimenti sugli animali sull'analgesia della digitopressione 8,9,10. Tuttavia, quando si implementano operazioni di digitopressione su modelli animali, spesso imitano la digitopressione umana. L'effetto terapeutico della digitopressione è influenzato da fattori come la dimensione, la frequenza e la direzione della forza applicata^11,12,13. Se l'esperimento non dispone di uno standard di digitopressione unificato, come la forza, la frequenza e la durata dell'operazione, ciò può causare alcune deviazioni nei risultati sperimentali. Questo articolo introduce una serie di piani di trattamento della digitopressione basati sulle caratteristiche dei ratti CCD e promuove lo sviluppo di operazioni di digitopressione standardizzate in modelli animali.

Protocollo

Questo lavoro è stato svolto presso il Pain Lab dell'Istituto di Neurobiologia dell'Università di Fudan. Gli esperimenti sono stati approvati e hanno rispettato rigorosamente le linee guida per la protezione degli animali da laboratorio stabilite dall'Associazione Internazionale per lo Studio del Dolore (LASP) per tutte le procedure chirurgiche e la manipolazione degli animali. Per il presente studio sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley (SD) di qualità pulita, costituiti da 32 maschi di età compresa tra 40 e 50 giorni, con un peso medio di 220 ± 1,38 g. Questi ratti sono stati ottenuti dall'Experimental Animal Center dell'Accademia di Scienze della Vita di Shanghai, Accademia Cinese delle Scienze. Gli animali sono stati adeguatamente accuditi e alloggiati in un locale dedicato con ventilazione indipendente, temperatura (22 ± 1 °C) e umidità (40%-50%) regolate. I ratti avevano accesso a cibo e acqua adeguati nelle loro gabbie. La stanza degli animali da laboratorio ha seguito un ciclo luce-buio di 12 ore per mantenere la regolarità dei ritmi circadiani dei ratti e il personale designato ha sostituito regolarmente l'imbottitura. La radiografia è stata eseguita presso il Dipartimento di Radiologia dell'Ospedale Yueyang di Medicina Tradizionale Cinese e Occidentale Integrata, affiliato all'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanghai.

1. Partecipanti allo studio e raggruppamento

1. Assegna 32 ratti a quattro gruppi: naïve (controllo), sham (operazione fittizia), CCD (compressione cronica del ganglio della radice dorsale) e CCD + Tuina (8 ratti/gruppo). I ratti avevano libero accesso al cibo e all'acqua nelle strutture per animali.
   NOTA: I ratti naive non hanno subito alcun intervento, mentre il gruppo fittizio è stato sottoposto alla stessa procedura chirurgica dei ratti del gruppo CCD, ma senza lasciare un'asta di acciaio inossidabile a forma di "L" nel forame intervertebrale L4 e L5. I ratti del gruppo CCD sono stati sottoposti a un intervento chirurgico completo di compressione del ganglio della radice dorsale dorsale. I ratti del gruppo CCD + Tuina hanno ricevuto la terapia con tuina a partire dal quarto giorno dopo l'intervento chirurgico CCD.

2. Definizione di un modello animale

1. Somministrare isofluorano per anestetizzare i ratti. Una volta che i ratti perdono conoscenza (nessun riflesso di movimento della coda o riflesso di flessione delle gambe), radere i peli nell'area chirurgica usando un rasoio.
   NOTA: I farmaci analgesici sono stati applicati 15 minuti prima dell'intervento chirurgico e ai ratti è stato iniettato per via sottocutanea tramadolo 20 mg/kg.
2. Fissare il ratto su un pannello di gommapiuma (vedere la tabella dei materiali) e utilizzare degli elastici per fissare gli arti e gli incisivi. Pulire l'area preparata con una preparazione sterile di alcool e iodio alternati per un minimo di 3 cicli.
3. Inserire la sonda a forma di "L" (vedi Tabella dei materiali).
   1. Usa le forbici per praticare un'incisione di 2-3 cm attraverso la pelle, la fascia superficiale e la fascia profonda strato per strato. Innanzitutto, individua la colonna iliaca anteriore superiore, che corrisponde alla quinta colonna lombare. Quindi, individua in sequenza il terzo e il quarto processo spinoso.
   2. Clamp il processo spinoso con una pinza dentata e sollevalo per consentire alle forbici di essere vicino al lato destro del processo spinoso e tagliare il muscolo attaccato al lato destro del processo spinoso.
   3. Quindi, sezionare senza mezzi termini il muscolo attaccato alla superficie esterna della placca vertebrale fino a quando non c'è resistenza sul lato destro. La protrusione è l'articolazione zigapofisaria. Allo stesso modo, seziona senza mezzi termini il muscolo e la fascia sull'articolazione zigapofisaria.
      NOTA: Il processo trasversale che punta verso la direzione della testa del ratto verrà toccato prima nella parte anteriore esterna inferiore dell'articolazione zigapofisaria. Al di sotto del processo trasverso c'è il forame intervertebrale, che è pieno di radici nervose e tessuti molli circostanti e di solito non è facile da trovare.
   4. Innanzitutto, utilizzare una sonda a forma di "L" per determinare la posizione del forame intervertebrale, quindi utilizzare un'asta in acciaio inossidabile a forma di "L" (che deve essere realizzata con un diametro di 0,4 mm e una lunghezza di 4 mm) per inserirlo nel forame intervertebrale.
   5. Se il ganglio della radice dorsale viene compresso con successo, il ratto mostrerà un colpo di coda e un riflesso di flessione delle gambe. Inserire l'asta in acciaio inossidabile nel quarto e quinto forame intervertebrale lombare. Quindi, suturare (3-0, vedi Tabella dei materiali) il muscolo, la fascia e la pelle strato per strato.
4. Metti il ratto in una scatola termostatica fino a quando non si sveglia. Dopo il risveglio, osservare se la funzione dell'arto posteriore destro del ratto è normale. Se c'è trascinamento, significa che l'operazione ha danneggiato i nervi motori e il ratto dovrebbe essere scartato. Se la funzione dell'arto posteriore destro è normale, il ratto può essere utilizzato e messo in una gabbia per l'alimentazione.

3. Terapia Tuina

1. Stabilire un ambiente confortevole: prima di iniziare la terapia con Tuina, acclimatare il ratto nel sistema di ritenuta per 30 minuti per consentirgli di adattarsi (Figura 1). Questo dispositivo è in grado di esporre completamente la coscia del ratto e immobilizzarla, facilitando le manovre Tuina (vedi Tabella dei Materiali).
   NOTA: La temperatura nella sala di trattamento deve essere mantenuta tra 22-26 °C e l'umidità deve essere compresa tra il 40% e il 50%.
2. Standardizzazione del Tuina: assicurarsi che i terapisti indossino manicotti per le dita wireless in grado di monitorare la pressione e la frequenza del Tuina e fornire dati di feedback in tempo reale. Per prima cosa, esercitati con il Tuina con i dati di feedback dei manicotti delle dita, regolando la forza a 5 N e la frequenza a 2 Hz. Quindi, eseguire le stesse manovre sui ratti, mantenendo una forza e una frequenza costanti per tutta la procedura (Figura 2).
   NOTA: Sulla base del nostro lavoro precedente, la forza di pressatura ottimale calcolata è di 5 N (vedere la sezione Discussione per i dettagli).
3. Identificare il punto di agopuntura: selezionare il muscolo gastrocnemio dell'arto posteriore destro come zona Tuina del ratto, alla giunzione dei due capi del muscolo gastrocnemio, approssimativamente nella posizione di BL57¹⁴.
4. Eseguire il Tuina: assicurarsi che il terapeuta sia rivolto verso la parte posteriore della coscia del ratto e tenga l'arto posteriore destro del ratto con l'arto superiore destro. Posizionare il pollice verticalmente sul punto di agopuntura BL57 e assicurarsi che l'avambraccio e le dita esercitino una forza per eseguire movimenti rotatori ritmici a piccola distanza applicando una pressione di 5 N (Figura 3).
5. Durante il trattamento, assicurarsi che la forza e la frequenza del feedback di manipolazione corrispondano ai valori preimpostati. Iniziare l'intervento dal quarto giorno dopo l'intervento, con Tuina eseguito una volta al giorno per 15 minuti, ininterrottamente per 18 giorni.

4. Test comportamentali per il dolore

NOTA: I test comportamentali sono stati condotti prima della modellazione, dopo la modellazione, il giorno di intervento 1, il giorno di intervento 3, il giorno di intervento 7, il giorno di intervento 14, il giorno di intervento 17 e il giorno di intervento 21.

1. Eseguire la soglia di risposta della stimolazione meccanica (soglia di ritiro della zampa, PWT) seguendo i passaggi seguenti (Figura 4).
   1. Utilizzare il metodo di von Frey per testare la soglia di risposta della stimolazione meccanica nelle zampe dei ratti. Collocare i ratti in uno scomparto in vetro temperato trasparente di 20 cm × 10 cm × 20 cm, posizionato su un supporto a griglia metallica con aperture da 10 mm × 10 mm ad un'altezza di 40 cm. Mantenere la temperatura ambiente a 23 ± 2 °C e l'ambiente circostante tranquillo.
   2. Misurare la soglia di prelievo meccanico con fibre elettroniche di Von Frey (vedi Tabella dei Materiali). Stimola il centro del piede del ratto fino a quando non si muove in modo evidente, ad esempio sollevando la gamba o evitandolo. La macchina registra automaticamente il valore massimo di pressione (N).
   3. Attendere 15 secondi o più prima di stimolare nuovamente lo stesso ratto. Mantenere ogni stimolazione al di sotto di 5 secondi per prevenire la sensibilizzazione tattile nelle zampe del ratto. Ripetere il test cinque volte fino a quando le tre misurazioni consecutive differiscono di meno di 10 N.
2. Eseguire la latenza di ritiro della zampa (PWL) in risposta alla stimolazione termica (Figura 5).
   1. Valutare il PWL utilizzando il metodo di Hargreaves^15,16. Metti i ratti in una piccola camera di vetro temperato trasparente, che misura 20 cm x 10 cm x 20 cm, con un coperchio di vetro trasparente con un foro di sfiato. Riscaldare la zona centrale del coperchio in vetro a 45 °C utilizzando una piastra riscaldante fino a raggiungere una temperatura stabile.
   2. Durante la fase di test comportamentale, acclimatare i ratti al laboratorio comportamentale per almeno 2 ore al giorno per ridurre al minimo l'impatto dei fattori ambientali sui risultati del test.
   3. Prima del test formale, posizionare i ratti nel laboratorio comportamentale per 30 minuti per consentire loro di adattarsi all'ambiente e ridurre le interferenze.
   4. Riscaldare la piastra riscaldante a 45 °C e posizionare gli arti posteriori del ratto sulla piastra riscaldante.
   5. La latenza di ritiro della zampa (PWL) è stata definita come il tempo che intercorre tra l'inizio del riscaldamento e la comparsa del riflesso di ritiro della zampa in risposta alla stimolazione termica. In ogni test, testare lo stesso arto posteriore tre volte di seguito e il valore medio per ottenere la latenza di risposta di quell'arto posteriore. Dopo il test, riportare i ratti nelle loro gabbie per l'alimentazione.

5. Perfusione

1. Preparazione: preparare preventivamente una soluzione salina allo 0,9% e una soluzione di paraformaldeide al 4%. Porre la soluzione salina in un forno impostato a una temperatura costante di 37 °C e conservare la soluzione di paraformaldeide in frigorifero a 4 °C per un uso successivo.
2. Eseguire l'anestesia e stabilire l'accesso.
   1. Iniziare iniettando uretano al 25% (0,6 ml/100 g, vedere la tabella dei materiali) nella cavità addominale del ratto per indurre l'anestesia profonda. Attendere fino a quando non si osserva alcun riflesso delle dita dei piedi, corneale o di rotazione. Fissa il ratto su un pannello di gommapiuma.
   2. Taglia l'osso toracico con le forbici e apri la pelle e la fascia strato per strato. Tagliare il diaframma e tagliare le costole su entrambi i lati per esporre completamente il cuore. Separare con cura il pericardio. Separare i polmoni dal cuore.
   3. Utilizzare le pinze per tirare ed esporre l'aorta tirando il cuore verso di sé. Allineare l'ago, il ventricolo sinistro e l'aorta in linea retta e sullo stesso piano orizzontale. Quindi inserire l'ago dal ventricolo sinistro nell'aorta fino a quando l'ago non è visibile all'interno dell'aorta.
   4. Usa una pinza per bloccare l'aorta e l'ago all'interno dell'aorta, quindi taglia l'atrio sinistro con le forbici. A questo punto, una grande quantità di sangue sgorgherà dall'atrio sinistro. Aprire la valvola per la soluzione salina e collegare l'iniezione salina alla soluzione salina perfusa a 37 °C, per un totale di circa 150-200 mL.
3. Al termine della perfusione salina, passare alla soluzione di paraformaldeide al 4% e perfondere con una soluzione di paraformaldeide al 4% per un totale di circa 400 mL a 4 °C. Quando si inizia la perfusione di paraformaldeide, tenere i denti anteriori del ratto con un paio di pinze e tirarli in avanti, tenendo la coda con una mano e tirandola all'indietro, il che è vantaggioso per estendere completamente la colonna vertebrale e aumentare il forame intervertebrale per facilitare il campionamento DRG.
4. Durante la perfusione, il fegato del ratto, il mesentere e l'omento maggiore impallidiscono gradualmente fino a quando il fegato diventa rigido. Quindi, rallentare la portata e regolarla a circa 2 gocce al secondo fino a quando tutta la paraformaldeide non è perfusa.

6. Raccolta del ganglio della radice dorsale

NOTA: Dopo la perfusione, tagliare rapidamente la sezione lombare della colonna vertebrale del ratto. Localizzare il forame intervertebrale L5 e L4 collegando i punti più alti della cresta iliaca su entrambi i lati al processo spinoso lombare L5 utilizzando questo metodo di posizionamento e rimuovere il ganglio della radice dorsale dal forame intervertebrale. Il metodo di raccolta specifico è il seguente:

1. Dall'ingresso del canale spinale (canale spinale toracico), inserire le forbici nel canale spinale e tagliare la lamina su entrambi i lati fino a quando tutte le lamine possono essere completamente rimosse, esponendo l'intero canale spinale.
   NOTA: Fare attenzione a non danneggiare il midollo spinale e le radici nervose al di fuori del canale spinale quando si tagliano le lamine.
2. Rimuovere con cautela il midollo spinale e il legamento longitudinale posteriore. Separare la dura madre attaccata al foro interno del forame intervertebrale.
3. Usa una pinza oftalmica per bloccare ed estrarre il ganglio della radice dorsale, che ha la forma di una perla e leggermente giallastro.
   NOTA: A causa della fragilità e della scarsa tenacità del tessuto nervoso, è necessario afferrare la forza e la direzione di trazione quando si estrae il ganglio della radice dorsale e non usare la forza bruta.
4. Quando si estrae il ganglio della radice dorsale, assicurarsi di pulire in anticipo i tessuti molli circostanti, tra cui la dura madre e l'aracnoide, per facilitare la trazione regolare del ganglio della radice dorsale.
5. Posizionare il ganglio della radice dorsale su carta assorbente, tagliare l'assone con una lama e pulire i vasi sanguigni sulla superficie del ganglio della radice dorsale.
6. Dopo il taglio, pesare il ganglio della radice dorsale e immergerlo in una soluzione di paraformaldeide al 4% con una concentrazione del 4% e una temperatura di 4 °C per un tempo sufficiente, di solito circa 2-4 ore, quindi trasferire il ganglio della radice dorsale in una soluzione di saccarosio PB al 10%, 20% e 30% (4 °C) preparata in anticipo per la disidratazione graduale.

7. Criosezione

1. Iniziare posizionando il ganglio della radice dorsale in una soluzione PBS 0,01 M. Agitare per 10 minuti e poi lavare via la soluzione di saccarosio. Tagliare con cura le fibre assonali di entrambi i segmenti dei gangli della radice dorsale. Pulire la testa di congelamento della criosezionatrice e aggiungervi il composto per la temperatura di taglio ottimale (OCT) (vedere la tabella dei materiali).
2. Posizionare la testina di congelamento sulla superficie di un guscio metallico contenente azoto liquido, attendere che il tessuto sia congelato, rimuoverlo e tagliarlo in piano. Dopodiché, posizionare la testina di congelamento sulla base dell'affettatrice. Lo spessore delle fette dei gangli della radice dorsale dovrebbe essere di 15 mm. Disporre in ordine le fette sottili in una cassetta di legno e conservarle in frigorifero a -20 °C, al riparo dalla luce.

8. Colorazione dell'ematossilina e dell'eosina

1. Mettere le sezioni per 2 minuti nello xilene e disidratarle in una serie di alcoli, tra cui 100%, 95%, 80% e 70%, per 2 minuti ciascuna. Quindi posizionare le sezioni 2 minuti in acqua distillata, 1 minuto in ematossilina, eseguire 5 minuti di risciacquo con acqua di rubinetto ed eseguire la differenziazione in soluzione alcolica salina all'1% per 30 secondi, seguiti da 30 secondi in carbonato di litio saturo.
2. Successivamente, mettere le fette 2 minuti ciascuna in acqua distillata e acqua di rubinetto, 5 minuti in soluzione di eosina (0,5%), un risciacquo rapido di 1 minuto in acqua distillata, due giri di 2 minuti ciascuno in alcol al 95% e 100%, 30 secondi in xilene al 100% con aggiunta di bicarbonato di sodio, tre giri di 3 minuti ciascuno in xilene e infine, sigillare con balsamo neutro (vedi Tabella dei materiali).

Risultati

La terapia Tuina può aiutare a ridurre le soglie di stimolazione meccanica e termica dei ratti causate dalla modellazione CCD
Dopo 17 giorni di terapia con Tuina, è stata osservata una differenza significativa nelle soglie di PWT tra i ratti CCD che hanno ricevuto la terapia con Tuina e il gruppo CCD non trattato (P = 0,021, <0,05) (Figura 6 e Tabella 1).

I ratti del gruppo CCD che hanno ricevuto la terapia con Tuina...

Discussione

Il nostro gruppo di ricerca ha condotto studi rilevanti sui parametri della manipolazione Tuina in fase iniziale. Innanzitutto, è importante impostare l'intensità della forza per la manipolazione Tuina. Nel Tuina clinico, i professionisti regolano l'intensità della forza in base alla loro esperienza e alle sensazioni soggettive dei pazienti, ottenendo il miglior effetto Tuina attraverso la comunicazione. Tuttavia, questo non è fattibile negli esperimenti sugli animali. Negli esperimenti sugli animali, viene utilizzat...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
"L" stainless steel rod (4 mm long and 0.4 mm in diameter)	hand-made	/	For CCD models making
ALMEMO admeasuring apparatus	ahlborn	2450-1	Mechanical Withdrawal Threshold test
Constant temperature slicer CM-1900	Leica	1491950C1US	For specimen production
Disinfectant (iodine) 100 mL/bottle	LIRCON/Shandong Lilkang	/	For disinfection
Disposable sterile syringe 5 mL	Shanghai Misha Wa Medical Industry	/	For injection
Electron microscope CX-31	Olympus, Japan	BJ002318	For specimen observation
Finger pressure recordings	Suzhou Changxian Optoelectronic Technology	CX1003w	For Tuina manipulation
Foam board (35 cm x 20 cm)	hand-made	/	It is our homemade apparatus for fixing rats
MERSILK W2512	Johnson & Johnson	/	For tissue suture
Neutral balsam	Sinopharm Chemical Reagent	10004160	For specimen production
paraformaldehyde	China National Chemical Reagent	/	For specimen production
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761	For anesthesia of rat
Plantar Test Apparatus (Hargreaves Method) for Mice and Rats	IITC Life Science	/	Paw Withdrawal Latency
Precision electronic scale for experiment JY3002	Shanghai Precision Scientific Instrument	/	Weighing of rat
Rat hair clipper	Philips	HP6341/00	Shaving of rat fur
Restrainer for rats	Tongji University (self-made)	/	It is a homemade apparatus made by Tongji University, which can effectively immobilize the rats and fully expose their hind limbs.
Tissue-Tek O.C.T. Compound	SAKURA	4583	For specimen production
Uratan	China National Chemical Reagent	/	For anesthesia of rat
X-ray detector XR-600	Dongguan Kaso Electronic Technology	/	Examination of CCD models
xylene	Shanghai Sinopharm Group	100092	For specimen production