Обнаружение многогенного однонуклеотидного полиморфизма при раке желудка на основе платформы ионного полупроводникового секвенирования

Резюме

Этот протокол предлагает целостные лабораторные процедуры, необходимые для обнаружения однонуклеотидных полиморфизмов в образцах рака желудка на основе платформы ионного полупроводникового секвенирования. Также подробно описаны целевые последовательности, лигирующие адаптеры, библиотечная амплификация и очистка, а также критерии контроля качества.

Аннотация

Рак желудка является распространенной гетерогенной опухолью. Большинство пациентов имеют распространенный рак желудка на момент постановки диагноза и часто нуждаются в химиотерапии. Хотя 5-фторурацил (5-FU) широко используется для лечения, его терапевтическая чувствительность и толерантность к препарату все еще нуждаются в определении, что подчеркивает важность индивидуального введения. Фармакогенетика может служить руководством для клинического применения индивидуализированного лечения. Однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), как генетический маркер, способствуют выбору соответствующих схем химиотерапии и дозировок. Некоторые SNP связаны с метаболизмом фолиевой кислоты, терапевтической мишенью 5-FU. Метилентетрагидрофолатредуктаза (MTHFR) rs1801131 и rs1801133, дигидрофолатредуктаза (DHFR) rs1650697 и rs442767, метионинсинтаза (MTR) rs1805087, гамма-глутамилгидролаза (GGH) rs11545078 и семейство растворенных носителей 19 член 1 (SLC19A1) rs1051298 были исследованы при различных видах рака, а противоопухолевые противоопухолевые препараты имеют потенциальное прогнозное и руководящее значение для применение 5-ФУ. Технология секвенирования полупроводников нового поколения, основанная на ионном потоке, может быстро обнаруживать SNP, связанные с раком желудка. Каждый раз, когда основание удлиняется в цепочке ДНК, высвобождается H⁺ , вызывая локальные изменения pH. Ионный датчик обнаруживает изменения pH и преобразует химические сигналы в цифровые, обеспечивая секвенирование путем синтеза. Этот метод отличается низкими требованиями к образцам, простотой в эксплуатации, низкой стоимостью и высокой скоростью секвенирования, что полезно для проведения индивидуальной химиотерапии с помощью SNP.

Введение

Рак желудка является тяжелым бременем в области глобального общественного здравоохранения. Согласно Глобальной статистике рака за 2020 год, опубликованной Международным агентством по изучению рака (МАИР), рак желудка является пятым наиболее часто диагностируемым раком и четвертой по значимости причиной смертности, связанной с раком. Во всем мире распространенность стандартизированного по возрасту коэффициента в Восточной Азии является самой высокой как среди мужчин, так и среди женщин¹. Возникновение рака желудка коварно, а это значит, что у пациентов часто не наблюдается каких-либо явных и специфических симптомов на ранней стадии. Среди всех пациентов с раком желудка в странах, где нет рутинного скрининга, 80-90% пациентов диагностируются либо на поздней стадии, когда опухоль не может быть прооперирована, либо рецидивируют в течение 5 лет^{после операции.}

При распространенном или метастатическом раке желудка химиотерапия является основным методом лечения, который может улучшить выживаемость и качество жизни пациентов. Для начальной терапии пациентов с метастатическим раком желудка схема, основанная на платине-фторпиримидине, является основным выбором для схемы химиотерапии первой линии³. Фторпиримидин в основном включает 5-фторурацил (5-FU) и пероральные производные фторпиримидина, такие как капецитабин и тегафур. Основной мишенью 5-FU являются ферменты, связанные с метаболизмом фолатов, которые подавляют синтез ДНК и замедляют рост опухолевой ткани. Побочные реакции на лекарства ограничивают их полезность, при этом наиболее частыми побочными эффектами являются диарея, мукозит, миелосупрессия и ладонно-подошвенный синдром. Сообщалось, что терапевтический ответ и побочные реакции на лекарства тесно связаны с факторами метаболического пути фолиевой кислоты. Примечательно, что гомозиготная мутация rs1801131 была идентифицирована как индикатор ладонно-подошвенного синдрома (p = 4,1 x ^10-6, OR =9,99, 95% ДИ: 3,84-27,8)⁴. Хотя фторпиримидины широко используются в противоопухолевой химиотерапии, их химиорезистентность является распространенным чрезвычайным случаем, вызывающим терапевтическую неудачу при лечении рака желудка. Например, общая частота ответа составляет всего 10-15% среди пациентов с прогрессирующим колоректальным раком, получавших^только 5-FU. Также фторпиримидины обладают токсичностью, которую нельзя игнорировать. Реакции токсичности, индуцированные 5-FU, в основном включают диарею, ладоностопный синдром, стоматит, нейтропению, тромбоцитопению, нейротоксичность и даже смерть⁶. Тяжелая токсичность, связанная с лечением, наблюдается у 10%-30% пациентов, получавших фторпиримидины, а смертельная токсичность наблюдается у 0,5%-1% этих пациентов⁷.

Исследование качества жизни пациентов с прогрессирующим раком желудка показало, что частота ответа составила менее 50% у тех, кто получал химиотерапию на основе 5-FU⁸. Таким образом, понимание факторов, связанных с чувствительностью химиотерапии на основе 5-FU, особенно важно для точного лечения, позволяющего максимизировать скорость и эффективность ответа при минимизации токсичности. Учитывая, что 5-FU тесно связан с метаболизмом фолатов, генетические варианты ферментов в пути метаболизма фолатов могут быть одним из факторов. Около 90% вариаций последовательностей у человека связано с мутациями одного основания в ДНК, известными как однонуклеотидные полиморфизмы (SNP)⁹. Когда SNP изменяют ферментативные свойства метаболизма фолатов, это может привести к индивидуальным различиям в эффективности, токсичности и химиорезистентности к фторурацилу у пациентов с раком желудка.

Метилентетрагидрофолатредуктаза (MTHFR) в основном используется для преобразования 5,10-метилентетрагидрофолата (5,10-MTHF) в 5-метилтетрагидрофолат. 5-FdUMP, метаболит 5-FU, образует неактивную тройку с 5,10-MTHF и тимидилатсинтазой (TS), ингибируя активность TS и приводя к дефициту dTMP¹⁰. Накопление 5,10-MTHF может усиливать ингибирующий эффект 5-FU на СТ, что коррелирует с активностью MTHFR. MTHFR rs1801131 и rs1801133 являются наиболее распространенными полиморфизмами, которые связаны с более низкой активностью фермента (снижение на 75% для rs1801133 и 30% для rs181131) и накоплением 5,10-MTHF¹¹.

Дигидрофолатредуктаза (DHFR) является ключевым ферментом в метаболизме фолатов и синтезе ДНК. DHFR восстанавливает дигидрофолат с помощью NADPH до тетрагидрофолата (THF), который используется для переноса одноуглеродной единицы. SNP DHFR могут влиять на его экспрессию, изменять активность и содержание ТГФ, а также в дальнейшем влиять на метаболизм фолатов и чувствительность 5-FU. Точечная мутация DHFR rs1650697 происходит в основном промоторе гена DHFR , что увеличивает экспрессию DHFR¹². Исследование показало, что rs442767 связан с эффективностью и токсичностью антифолатных противоопухолевых препаратов, таких как пеметрексед и метотрексат. Что касается SNP rs442767, генотип GT означает наследование аллеля G и аллеля T в одном и том же локусе на гомологичных хромосомах от каждого родителя. Аналогичным образом, генотипы GG и TT обозначают наследование либо двух аллелей G, либо двух аллелей T, соответственно. По сравнению с генотипом GT+TT, GG связан со снижением выживаемости без осложнений и повышенным^{риском 13}. Это говорит о том, что rs442767 может приводить к определенному потенциальному влиянию на 5-FU.

Метионинсинтаза (MTR) катализирует реметилирование гомоцистеина в метионин, который играет важную роль в метаболизме фолатов. MTR rs1805087 является наиболее распространенным полиморфизмом гена MTR . MTR rs1805087 заменяет глицин на аспарагиновую кислоту в потенциально функциональном участке белка, что может снижать активность MTR. У пациентов с аллелем G был повышен уровень фолиевой кислоты в плазме крови и снижен уровень гомоцистеина¹⁴ в плазме крови. Напротив, исследование показало, что rs1805087 не имеет статистически значимой связи с эффективностью 5-FU. Но это исследование было сосредоточено на колоректальном раке, и размер выборки был небольшим. Взаимосвязь между rs1805087 и эффективностью 5-FU у пациентов с раком желудка еще предстоит изучить¹⁵.

Гамма-глутамилгидролаза (GGH) — лизосомальный фермент, регулирующий внутриклеточную концентрацию фолатов. Птероилглутаминовая кислота является синонимом фолиевой кислоты, которая состоит из птерина,-аминометилбензойной кислоты и глутаминовой кислоты. Существует две формы фолиевой кислоты в организмах: моноглутамат фолат и полиглутаматированный фолат. ТГФ-полиглутамат ферментативно преобразуется в моноглутаминовый фолат под действием GGH, последовательно высвобождая либо моноглутамат (mono-Glu), либо диглутамат (di-Glu)¹⁶. Исследование экспрессии GGH у пациентов с местнораспространенным раком желудка показало, что высокая экспрессия GGH может снижать 5,10-MTHF и TS, что означает, что для достижения ингибирующего эффекта TS у^{этих пациентов необходима} лишь небольшая доза 5-FU. ГГ является прогностическим биомаркером у пациентов с местнораспространенным раком желудка, получающих послеоперационную адъювантную химиотерапию с S-1, пролекарством 5-FU, и играет важную роль в поддержании внутриклеточного гомеостаза фолиевой кислоты¹⁸. GGH rs11545078 является миссенс-вариантом и изменяет Thr-127 на Ile-127. Исследование, посвященное субстратной специфичности GGH, предполагает, что rs11545078, по сравнению с диким типом, приводит к более высокому Km и более низкой каталитической эффективности метотрексата, а его структура аналогична фолиевой кислоте¹⁹. Совместное изучение взаимосвязи между rs11545078 и клиническими исходами 5-FU является многообещающей стратегией для понимания лекарственной устойчивости.

Семейство растворенных носителей 19 член 1 (SLC19A1), также называемое транспортером восстановленных фолатов, является типичным облегчающим трансмембранным белком, который импортирует восстановленные фолаты, которые клетки млекопитающих не способны синтезировать de novo, что признано для оценки реакции опухоли на 5-FU²⁰. Тем не менее, было проведено лишь несколько исследований относительно связи между 5-FU и полиморфизмом SLC19A1 ²¹. У пациентов с немелкоклеточным раком легкого, получавших пеметрексед, который является аналогом фолиевой кислоты, rs1051298 в гене SLC19A1 способствовал увеличению риска всех побочных реакций на лекарственные препараты и снижению^{общей выживаемости.} SLC19A1 rs1051298, вариант 3'нетранслируемой области, отвечающий за метаболизм фолиевой кислоты, может помочь объяснить некоторые индивидуальные различия в терапии 5-FU. Цель исследования состоит в том, чтобы оценить связь между rs1051298 и резистентностью к 5-FU у пациентов с раком желудка.

Набор, основанный на полупроводниковом секвенировании, используется для качественного обнаружения генов in vitro (рис. 1), который может обнаружить 7 выбранных SNP в 5 генах, мутации rs1801131 и rs1801133 гена MTHFR , мутации rs1650697 и rs442767 гена DHFR , мутацию rs1805087 гена MTR , мутацию rs11545078 гена GGH и rs1051298 гена SLC19A1 Ген в образцах опухолевой ткани больных раком желудка. Сначала образец извлекали нуклеиновую кислоту, а целевой фрагмент специально амплифицировали методом ПЦР. Универсальный адаптер для секвенирования был добавлен на обоих концах фрагмента ДНК для создания библиотеки, которую можно использовать для секвенирования. Затем была проведена амплификация библиотеки секвенирования методом ПЦР для формирования шаблона секвенирования. Позитивный шаблон был обогащен в соответствии с требованиями секвенирования. С помощью системы секвенирования полупроводников путем фиксации нити ДНК в крошечном отверстии полупроводникового чипа. ДНК-полимераза берет одноцепочечную ДНК в качестве матрицы и синтезирует комплементарную цепь ДНК по принципу комплементарного спаривания оснований. Каждый раз, когда основание удлиняется в цепочке ДНК, протон высвобождается, вызывая локальные изменения pH. Ионный датчик обнаруживает изменения pH и преобразует химические сигналы в цифровые, так что основания могут быть интерпретированы в режиме реального времени, и, наконец, может быть получена последовательность оснований каждого сегмента ДНК. Биоинформатический анализ был использован для сопоставления этих последовательностей с эталонной картой генома человека. Когда гены, связанные с раком желудка, мутируют, их соответствующие последовательности оснований ДНК изменяются, чтобы получить информацию о мутациях родственных генов.

Результат может отображать статус мутации гена и служить ориентиром для клиницистов для выбора подходящих типов и дозировок химиотерапевтических препаратов и прогнозирования лекарственной устойчивости у пациентов с раком желудка. Тем не менее, результаты тестов носят исключительно клинический характер и не рекомендуются в качестве единственной основы для индивидуального лечения пациентов. Клиницисты должны вынести всестороннее суждение, основываясь на состоянии пациента, показаниях к применению лекарств, реакциях на лечение и других показателях лабораторных исследований.

протокол

Все протоколы и образцы тканей рака желудка (этап 1), полученные с помощью эндоскопии или хирургии верхних отделов желудочно-кишечного тракта, использованные в этом исследовании, были рассмотрены и одобрены комитетом по медицинской этике 24 июля 2023 года (NFEC-2023-298). Кроме того, этот протокол предназначен исключительно для иллюстрации обнаружения мультигенов при раке желудка без участия когортных сравнений, поэтому он не устанавливает конкретных критериев для включения или исключения пациентов. Пациенты/участники предоставили письменное информированное согласие на участие в данном исследовании.

1. Препарирование внедренных блоков при раке желудка

1. Сконфигурируйте систему встраивания тканей, состоящую из резервуара для парафина и дозатора, а также теплой и холодной пластин, в соответствии с предписанными инструкциями по эксплуатации.
2. Извлеките подготовленную ткань для заделки из дегидратора и поместите ее в слот для хранения центра встраивания.
3. Выберите подходящие формы для встраивания в зависимости от размера ткани, налейте достаточное количество расплавленного парафина, чтобы покрыть ткань, а затем расположите форму на теплой пластине.
4. Извлеките ткань из кассет и поместите слизистую оболочку желудка перпендикулярно основанию закладной формы, чтобы плоскость поперечного сечения пересекала все слои ткани. Выровняйте ткань в форме.
5. Установите кассету на верхнюю часть формы, с последующей вторичной заливкой парафина, заполнением формы.
6. Поместите закладную форму на холодную пластину и после застывания парафина отломите закладные блоки от форм.

2. Экстракция нуклеиновой кислоты из образцов

1. Используйте наборы для экстракции и очистки нуклеиновых кислот для извлечения нуклеиновых кислот из образцов тканей, залитых парафином.
2. Используйте квантор нуклеиновых кислот для количественного определения экстрагированной нуклеиновой кислоты. Рекомендуемая концентрация нуклеиновых кислот должна превышать 2 нг/мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые здесь материалы доступны в Таблице материалов.

3. Подготовка к секвенированию библиотеки

1. Подготовка перед экспериментом
   1. Включите УФ-лампу на ультрачистом верстаке, стерилизуйте в течение 30 минут. Затем выключите УФ-лампу и включите вентилятор для проветривания на 10 минут.
   2. Достаньте нуклеиновую кислоту из холодильника при температуре -20 ± 5 °C, проверьте и запишите идентификатор образца, штрих-код нуклеиновой кислоты и конкретный номер бирки, присвоенный образцу. Поместите его на штатив для пробирок центрифуги для растворения при комнатной температуре (RT) после проверки и центрифугируйте в течение 10 с, с фиксированной плотностью 2500 x g для ожидания.
2. ПЦР-амплификация фрагмента мишени
   1. Возьмите раствор для реакции захвата фрагментов, праймер амплификации рака желудка и праймер для амплификации слияния из специально изготовленного набора для обнаружения мультигенных суставов рака желудка и положите их на лед для таяния. Встряхните и перемешайте их после плавления, центрифугируйте в течение 10 секунд и приготовьте воду без нуклеаз. Подробная информация о грунтовке приведена в таблице 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Набор еще не поступил в продажу, свяжитесь с authotrs для получения дополнительной информации.
   2. Приготовьте реакционную пробирку для ПЦР объемом 0,2 мл, добавьте в пробирку по очереди реагенты в соответствии с Дополнительной таблицей 1, перемешайте и перемешайте в течение 5 с и центрифугируйте мгновенно в течение 10 с фиксированным весом 2 500 x g, чтобы на стенке и крышке пробирки не было явных капель. Образцы РНК должны быть обратно транскрибированы в кДНК, а затем использованы для последующего построения библиотеки. Продукты кДНК добавляются в пробирки по очереди в соответствии с Дополнительной таблицей 2.
   3. Поместите каждую реакционную трубку на термоамплификатор. Для образцов ДНК запустите программу амплификации, как описано в таблице 2. Для продуктов кДНК запустите программу амплификации, как описано в таблице 3.
3. Расщепление последовательности праймеров
   1. Достаньте праймер фермент для переваривания и положите его на лед для таяния. После амплификации извлеките вышеуказанные реакционные пробирки, добавьте 2 мкл фермента праймера для расщепления в каждую пробирку и убедитесь, что общий объем составляет 22 мкл.
   2. Смешайте раствор и перемешайте реакционный раствор в ПЦР-пробирке и центрифугируйте мгновенно в течение 10 с фиксированным значением 2 500 x g.
   3. Поместите каждую реакционную трубку в термоамплификатор и запустите программу, как описано в таблице 4.
4. Лигирование адаптера
   1. Положите адаптер для подключения реагентов на лед для растворения. Подготовьте микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, а затем смешайте каждый компонент согласно таблице 5 и обозначьте его как переходную смесь X.
      ПРИМЕЧАНИЕ: К соединительным реагентам адаптеров относятся адаптеры P1 и специальные адаптеры X, пронумерованные от 1 до 48. Они предназначены для уникальной маркировки различных образцов. При добавлении определенного адаптера открывайте только одну трубку за раз, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение конкретного адаптера. Разбавленную специальную переходную смесь можно хранить при температуре -20 ± 5 °C в режиме ожидания. В рабочих процессах секвенирования сэмплы не обрабатываются по отдельности, а несколько сэмплов, каждая из которых помечена определенным адаптером, объединяются в единую библиотеку для секвенирования. Этот метод позволяет впоследствии дифференцировать образцы на основе их специфических последовательностей адаптеров.
   2. Достаньте переваренный продукт праймера (22 μл) из термоамплификатора. Добавить реактивы в пробирку по очереди согласно таблице 6, вортекс и перемешать в течение 5 с. Центрифугируйте на низкой скорости в течение 10 с, с фиксированным значением 2 500 x g, чтобы не было видимых капель на стенке и крышке пробирки.
   3. Поместите реакционную трубку на термоамплификатор. Для образцов ДНК запустите программу амплификации, как описано в таблице 7. Для продуктов кДНК запустите программу амплификации, как описано в таблице 8.
5. Очистка продукта лигирования и амплификация
   1. Заранее достаньте магнитные шарики для очистки ДНК из холодильника при температуре 2-8 °C, равномерно смешайте их и мгновенно центрифугируйте в течение 10 секунд с фиксированной температурой 2500 x g. Уравновесьте магнитные шарики при температуре RT в течение 30 минут.
   2. Приготовьте микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с низкой адсорбцией и перенесите продукт реакции лигирования в соответствующую пробирку.
   3. Добавьте в каждую пробирку 45 μл очищенных магнитных шариков ДНК, сделайте вихрь и хорошо перемешайте, мгновенно центрифугируйте в течение 10 секунд и инкубируйте при RT в течение 5 минут.
   4. Поместите трубку на магнитную решетку на 3 минуты. Выбросьте надосадочную жидкость и избегайте пипетирования шариков.
   5. Перелейте 300 μл только что приготовленного 75% этанола в микроцентрифужную пробирку и осторожно поверните пробирки 4 раза на 180°. После того, как раствор станет прозрачным, быстро выбросьте надосадочную жидкость. Избегайте пипетирования бусин. Повторите процедуру стирки еще 1 раз.
   6. Извлеките микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл из магнитного штатива и кратковременно центрифугируйте (10 с, при фиксированном значении 2 500 x g). Поместите пробирки обратно в магнитный штатив и вылейте остатки жидкости пипеткой. Убедитесь, что на стенке трубки нет остатков жидкости.
   7. Откройте крышку каждой микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 мл и высушите шарики при температуре RT в течение 5 минут. Обратите внимание на сухо-влажное состояние бусин. После того, как магнитные шарики высохнут, проверьте, нет ли на поверхности пятен от воды. Увеличьте время сушки соответствующим образом, если магнитные шарики слишком влажные. Немедленно закройте крышку, если на бусинах появятся трещины, и продолжайте следующий шаг для увеличения и очистки библиотеки.
6. Пополнение и очистка библиотеки
   1. Заранее положите на лед реагенты, связанные с ПЦР, для растворения, сделайте их вихревыми и центрифугируйте в течение 10 секунд. Извлеките микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл из магнитного штатива, пипетируйте ПЦР-регенты в пробирку в соответствии с таблицей 9 и закройте колпачок и вихрь на 5 секунд. Кратковременно (10 с) центрифугируете, чтобы не было заметных капель жидкости на стенке и крышке пробирки.
   2. Переложите указанный выше продукт в новую ПЦР-пробирку. Инкубируйте образец на термоамплификаторе. Для образцов ДНК запустите программу амплификации, как описано в таблице 10. Для продуктов кДНК запустите программу амплификации, как описано в таблице 11.
   3. Подготовьте новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с низкой адсорбцией. Центрифугируйте ПЦР-пробирку в течение 10 с после инкубации. Перенесите продукт из ПЦР-пробирки в ЕР-пробирку.
   4. Добавьте в каждую пробирку по 25 мкл очищенных магнитных шариков ДНК. Перемешайте и хорошо перемешайте, центрифугируйте на низкой скорости и инкубируйте при RT в течение 5 минут.
   5. Поместите пробирки на магнитную решетку на 3 минуты и подождите, пока раствор станет прозрачным. Перенесите надосадочную жидкость в новые микроцентрифужные пробирки. Избегайте пипетирования бусин.
   6. Добавьте в каждую пробирку по 60 мкл очищенных магнитных шариков ДНК. Перемешайте и хорошо перемешайте, центрифугируйте на низкой скорости и инкубируйте при RT в течение 5 минут.
   7. Поместите пробирки на магнитную решетку на 3 минуты и подождите, пока раствор станет прозрачным. Выбросьте надосадочную жидкость. Избегайте пипетирования бусин.
   8. Налейте в пробирки 300 мкл только что приготовленного 75% этанола и осторожно поверните пробирки 4 раза на 180°. После того, как раствор станет прозрачным, быстро пипетируйте и выбросьте надосадочную жидкость. Избегайте пипетирования бусин. Повторите процедуру стирки 1 раз.
   9. Извлеките микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл из магнитного штатива и кратковременно (10 с) запустите центрифугу. Вставьте пробирки обратно в магнитный штатив и выведите остатки жидкости пипеткой. Убедитесь, что на стенке трубки нет остатков жидкости.
   10. Откройте колпачки пробирок объемом 1,5 мл и высушите шарики при температуре RT в течение 5 минут. Обратите внимание на сухо-влажное состояние бусин. После того, как магнитные шарики высохнут, на поверхности не остается водяного пятна. Увеличьте время сушки соответствующим образом, если магнитные шарики слишком влажные. Немедленно закройте крышку, если на бусинах появились трещины.
   11. Пипеткой внесите 50 μл элюента в пробирки, перемешайте и хорошо перемешайте. Кратковременно центрифугируйте (5 с, с фиксированным значением 2 500 x g) и поместите пробирки в режим RT на 5 минут.
   12. Поместите пробирки на магнитную решетку на 3 минуты и подождите, пока раствор станет прозрачным. Осторожно перелейте жидкость в новую пробирку и отметьте в ней название библиотеки.
   13. Временно храните библиотеку в холодильнике при температуре 2-8 °C и дождитесь количественного определения или храните библиотеку в холодильнике при температуре -20 ± 5 °C для длительного хранения.

4. Количественная оценка построенной библиотеки

1. Используйте квантификатор нуклеиновых кислот для количественной оценки библиотеки. Если библиотечная концентрация составляет ≥ 0,2 нг/мкл, она квалифицирована. В противном случае перестройте библиотеку.
2. Смешайте равный объем ДНК (или РНК) и количественно определите раствор. В зависимости от количественного результата разбавьте смешанный раствор до 100 пмоль/л, используя следующую формулу.
   
   ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативой является разбавление библиотеки до 100 пмоль/л в соответствии с формулой, а затем количественное определение с помощью флуоресцентной количественной ПЦР. Равномерно смешивайте библиотеки ДНК (или РНК) в соответствии с количественными результатами ПЦР-инструмента.
3. Смешайте библиотеку ДНК 100 пмоль/л и библиотеку РНК в соотношении 4:1. Используйте смешанный раствор библиотеки ДНК и РНК для компьютерного секвенирования.

5. Секвенирование

1. Выполнить секвенирование можно, обратившись к руководству универсального комплекта по секвенированию реакции^24,25 (метод секвенирования полупроводников).

6. Контроль качества образцов

1. Положительный контроль качества ДНК рака желудка: Возьмите положительный контроль ДНК рака желудка и выполните тест в соответствии с инструкциями набора. Управление поставляется в комплекте. Результат показывает, что обнаружены мутанты генов MTHFR, DHFR, MTR, GGH и SLC19A1 .
2. Отрицательный контроль качества ДНК рака желудка: Пройдите отрицательный контроль ДНК рака желудка и выполните тест в соответствии с инструкциями набора. Управление поставляется в комплекте. Результат показывает, что обнаружены дикие типы генов MTHFR, DHFR, MTR, GGH и SLC19A1 .
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что критерии соблюдены в обоих случаях, в противном случае требуется повторное обнаружение.

7. Анализ данных

1. Запустите соответствующий плагин (Variant Caller, Coverage Analysis и Ion Reporter Software) в программном обеспечении Torrent Suite, чтобы получить результаты анализа образцов. Оценивайте результаты обнаружения образцов в соответствии с результатами анализа плагина.

Результаты

Определение результатов теста основано на положительном оценочном значении, которое также признается референсным интервалом. Используйте метод полупроводникового секвенирования для обнаружения собранных клинических образцов. Когда значение частоты мутаций генов MTHFR, DHFR, MTR, GGH и SLC19A1 составляет ≥ 5%, результатом обнаружения является мутант соответствующего гена. Когда значение частоты мутаций составляет < 5 %, результатом обнаружения является дикий тип соответствующего гена²⁶.

Для определения достоверности результатов обнаружения можно использовать следующие критерии. Во-первых, если средний охват результатов секвенирования ДНК составляет ≥ 500, а картированные прочтения результатов секвенирования РНК равны ≥ 20000, то результаты теста заслуживают доверия²⁷. В противном случае рекомендуется провести повторное тестирование. Во-вторых, средний охват ДНК-положительного контроля качества рака желудка составляет ≥ 500, а результат теста должен соответствовать мутациям rs1801131 и rs1801133 гена MTHFR , rs1650697 и rs442767 гена DHFR , rs1805087 гена MTR , rs11545078 мутации гена GGH и rs1051298 мутации SLC19A1 ген как положительный. В противном случае рекомендуется провести повторное тестирование. В-третьих, средний охват контроля отрицательного качества ДНК рака желудка составляет ≥ 500, и результаты обнаружения должны показать, что все участки в пределах диапазона обнаружения этого набора относятся к дикому типу. В противном случае рекомендуется провести повторное тестирование. Наконец, библиотечная концентрация ниже 0,2 нг/л, что может быть связано с деградацией ДНК или РНК в образце, или с нестрогим соблюдением экспериментального процесса или использованием реагентов с истекшим сроком годности во время эксперимента. Вышеуказанные условия могут привести к снижению качества секвенирования или его нарушению. Рекомендуется пересобрать библиотеку.

С помощью этого набора выполняется ряд шагов для создания библиотеки секвенирования на основе клинических образцов. Затем библиотека секвенируется на платформе секвенирования ионных полупроводников, а ANNOVAR используется для аннотирования результатов. После секвенирования с помощью документа обобщаются мутантные типы для каждого образца. Отсутствие мутантного типа указывало на то, что образец не подвергался этой конкретной мутации. В дополнительнойтаблице 3 приведен типичный пример этого. В таблице 12 приведена основная информация об обнаруженных здесь SNP. Анализ каждого SNP с использованием аннотаций на основе фильтров в различных базах данных, таких как 1000 Genomes Project (1000g2015aug; https://www.internationalgenome.org/; Таблица 13) и Консорциум агрегации экзома (ExAC; https://gnomad.broadinstitute.org/; Таблица 14) может показать, что различные SNP в значительной степени присутствуют в разных популяциях.

Рисунок 1: Блок-схема для протокола. Блок-схема мультигенной детекции рака желудка методом полупроводникового секвенирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Хромосома	Местоположение	Интервал проектирования грунтовки		Левый праймер	Правый праймер
ХР1	11854475	ХР1:11854175-11854775		АКАГГАТГГГ GAAGTCACAG	AAACCGGAAT GGTCACAAAG
	11856377	ХР1:11856077-11856677		CTTCAGGTCA GCCTCAAAGC	TCCCTGTGGT CTCTTCATCC
ХР5	79950780	ХР5:79950480-79951080		CGCCGCACAT AGTAGGTTCT	CTTCCTCCTC CAGCCCTATC
	79951495	ХР5:79951195-79951795		CTTGGGTCAC CTGCACAGTA	АТТТГААГК ACCCAAGCTG
ХР1	237048499	ХР1:237048199-237048799		GTCAAAGGCC AGTCCCTTCT	ЦТККТКАКС CAACTGTGCT
ХР8	63938763	ХР8:63938463-63939063		CAGTGAAGTT CAGCGGCAT	ТАТТТТКТГТ GTGGGGCAC
ХР21	46934825	ХР21:46934525-46935125		CCAACCTGAG АТГГКТТТТЦ	TCCTTGGTGC ТЦТТГТТТТ

Таблица 1: Праймеры, используемые для семи выбранных SNP в пяти генах. На этом листе отображается информация о расположении праймеров SNP, ассоциированных с резистентностью к 5-FU при раке желудка.

Температура	Время	Нет. циклов
99 °C	2 мин	1 цикл
99 °C	15 с	22 цикла
60 °C	4 мин
10 °C	Держать	1 цикл

Таблица 2: Программа термического цикла для амплификации ДНК. Показаны условия термических реакций, такие как температура, время и циклы.

Шаг	Температура	Время	Нет. циклов
Активация ферментов	99 °C	2 мин	1 цикл
Денатурировать	99 °C	15 с	30 циклов
Отжиг и удлинение	60 °C	4 мин
Сохранять	10 °C	Держать	1 цикл

Таблица 3: Программа термического цикла для амплификации кДНК. Показаны условия термических реакций, такие как температура, время и циклы.

Температура	Время	Нет. циклов
50 °C	10 мин	1 цикл
55 °C	10 мин	1 цикл
60 °C	20 мин	1 цикл
10 °C	Держать	1 цикл

Таблица 4: Программа термического цикла для разложения последовательности праймеров. Показаны условия тепловых реакций, такие как температура, время и циклы.

Компонент	Том
Адаптер P1	1,5 мкл
Специальный адаптер X	1,5 мкл
Вода без нуклеаз	3 мкл
Общий объем реакционной системы	6 μЛ
X: Указывает конкретный номер адаптера

Таблица 5: Последовательность добавления реагентов для приготовления переходной смеси. Добавьте реагенты в пробирку в порядке, указанном здесь.

Компонент	Том
Соединительный буфер	4 мкл
Переходная смесь X	2 мкл
ДНК-лигаза	2 мкл
Общий объем реакционной системы	30 μл

Таблица 6: Последовательность добавления реагентов в продукт сброженного праймера. Добавьте реагенты в пробирку в порядке, указанном здесь.

Температура	Время	Нет. циклов
22 °C	30 мин	1 цикл
72 °C	10 мин	1 цикл
10 °C	Держать	1 цикл

Таблица 7: Программа термоцикла для подключения адаптера к ДНК. Показаны условия тепловых реакций, такие как температура, время и циклы.

Температура	Время	Нет. циклов
22 °C	30 мин	1 цикл
68 °С	5 мин	1 цикл
72 °C	5 мин	1 цикл
10 °C	Держать	1 цикл

Таблица 8: Программа термического цикла для подключения адаптера к кДНК. Показаны условия тепловых реакций, такие как температура, время и циклы.

Компонент	Том
Реакционное решение амплификации библиотеки	50 μл
Библиотечная грунтовочная смесь	2 мкл
Общий объем реакционной системы	52 μл

Таблица 9: Последовательность добавления реагентов для амплификации. Добавьте реагенты в пробирку в порядке, указанном здесь.

Температура	Время	Нет. циклов
98 °C	2 мин	1 цикл
98 °C	15 с	5 циклов
60 °C	1 мин
10 °C	Держать	1 цикл

Таблица 10: Программа термического цикла для амплификации библиотеки ДНК. Показаны условия тепловых реакций, такие как температура, время и циклы.

Температура	Время	Нет. циклов
98 °C	2 мин	1 цикл
98 °C	15 с	5 циклов
64 °C	1 мин
10 °C	Держать	1 цикл

Таблица 11: Программа термического цикла для амплификации библиотеки кДНК. Показаны условия тепловых реакций, такие как температура, время и циклы.

	РС1801131	РС1801133	РС1650697	РС442767	РС1805087	РС11545078	РС1051298
Ссылка	T	G	A	G	A	G	G
Альтернативный вариант	G	A	G	T	G	A	A
Func.ref GeneWithVer	экзонный	экзонный	УТР5	вверх по течению	экзонный	экзонный	УТР3
Ген.реф GeneWithVer	MTHFR	MTHFR	DHFR	DHFR	ССО	ГГХ	SLC19A1
ГенПодробнее .refGeneWithVer	.	.	NG_023304.1: Г.5020Т>Г	.	.	.	NM_001205206.1: c.*64C>T; NM_001205207.1: c.*746C>T; NM_194255.2:в. *746C>T
ЭкзоникФунк .refGeneWithVer	несинонимичный; СНВ	несинонимичный; СНВ	.	.	несинонимичный; СНВ	несинонимичный; СНВ	.
AAChange.ref GeneWithVer	MTHFR:NM_00 1330358.1:экзо n8:c.A1409C:p. Е470А; MTHFR: NM_005957.4: Экзон8:c.A1286 С:.Э429А	MTHFR:NM_00 1330358.1:экзо n5:c.C788T:p. А263В; MTHFR:N M_005957.4:e xon5:c.C665T: р.А222В	.	.	MTR:NM_0012 91939.1:экзон2 5:c.A2603G:p. D868G; MTR:N M_001291940. 1:экзон25:c.A1 535G:p.D512G; MTR:NM_0002 54.2:Экзон26:в. А2756Г:с.Д91 9G	ГГХ:NM_003878 .2:exon5:c.C452T: стр.T151I	Джин
cytoBand	1п36.22	1п36.22	5к14.1	5к14.1	1кв43	8к12.3	21в22.3

Таблица 12: Актуальная информация об ОНП. Аннотирование образцов с помощью ANNOVAR.

		MTHFR		DHFR		ССО	ГГХ	SLC19A1
		РС1801131	РС1801133	РС1650697	РС442767	РС1805087	РС11545078	РС1051298
1000g2015aug_all		0.249401	0.245407	0.76857	0.290136	0.218251	0.085463	0.524361
1000g2015aug_afr		0.1513	0.09	0.9349	0.0318	0.2844	0.056	0.5772
1000g2015aug_amr		0.1513	0.4741	0.755	0.3991	0.1772	0.0403	0.4323
1000g2015aug_eas		0.2192	0.2956	0.6607	0.5853	0.1052	0.0873	0.5635
1000g2015aug_eur		0.3131	0.3648	0.7555	0.3191	0.173	0.0924	0.4493
1000g2015aug_sas		0.4172	0.1186	0.6779	0.228	0.3211	0.1483	0.5552

Таблица 13: Аннотирование SNP на основе фильтров в проекте «1000 геномов».

	MTHFR		DHFR		ССО	ГГХ	SLC19A1
	РС1801131	РС1801133	РС1650697	РС442767	РС1805087	РС11545078	РС1051298
ExAC_ALL	0.295	0.3037	.	.	0.2091	0.0936	.
ExAC_AFR	0.1588	0.1124	.	.	0.2666	0.0545	.
ExAC_AMR	0.1555	0.5141	.	.	0.1864	0.0361	.
ExAC_EAS	0.2148	0.3052	.	.	0.1132	0.0824	.
ExAC_FIN	0.3128	0.2227	.	.	0.1892	0.0581	.
ExAC_NFE	0.3191	0.345	.	.	0.1919	0.0969	.
ExAC_OTH	0.304	0.3062	.	.	0.2108	0.0973	.
ExAC_SAS	0.4153	0.1409	.	.	0.316	0.165	.

Таблица 14: Аннотация SNP на основе фильтров в консорциуме Exome Aggregation Consortium.

Дополнительная таблица 1: Последовательность добавления реагентов для амплификации ДНК. Добавьте реагенты в пробирку в порядке, указанном здесь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 2: Последовательность добавления реагентов для амплификации кДНК. Добавьте реагенты в пробирку в порядке, указанном здесь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 3: Пример результатов клинического секвенирования образцов. В документах будут записаны только мутации, присутствующие в образцах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Клинические эксперты единодушно сходятся во мнении, что пациенты, даже с одним и тем же типом и стадией рака желудка, могут иметь заметно разные реакции на идентичный подход к лечению. Многолетние исследования показали ученым, что индивидуальные вариации в основном объясняются природой рака желудка как гетерогенной полиморфной и дифференцированной клеточной популяции, что приводит к значительным индивидуальным различиям^{в ответах} на лечение. Следовательно, получение образцов рака желудка с помощью эндоскопии или хирургического вмешательства верхних отделов желудочно-кишечного тракта и образцов крови в сочетании с высокопроизводительным секвенированием для генетического анализа позволяет проводить персонализированное лечение рака желудка. Эта стратегия предназначена для повышения эффективности клинического лечения и снижения риска тяжелых токсических побочных эффектов. Прогресс в технологии ионного полупроводникового секвенирования превратил персонализированное лечение в практическую реальность²⁹.

Вот некоторые ограничения этого метода тестирования. Используемый здесь набор предназначен в первую очередь для диагностики in vitro , поэтому он ограничен обнаружением мутаций rs1801131 и rs1801133 гена MTHFR , rs1650697 и rs442767 гена DHFR , rs1805087 гена MTR , rs11545078 гена GGH и rs1051298 гена SLC19A1. Мутация в других отделах не может быть обнаружена. Из-за значительной гетерогенности опухолевой ткани различные места отбора проб могут повлиять на результаты обнаружения. Для образцов тканей, залитых парафином, хранящихся в течение более длительного времени, ДНК и РНК могут в определенной степени деградировать, что влияет на результаты теста. Необоснованный сбор, транспортировка и обработка проб, а также неправильная экспериментальная эксплуатация и экспериментальная среда могут привести к ложноотрицательным или ложноположительным результатам. Результат обнаружения не может быть гарантирован, если концентрация нуклеиновой кислоты ниже 2 нг/мкл. Результаты испытаний набора приведены только для клинической справки. Выбор персонализированного лечения для пациента должен рассматриваться в сочетании с их симптомами/признаками, историей болезни, другими лабораторными тестами и реакциями на лечение. Отрицательные результаты не могут полностью исключить существование мутации гена-мишени. Отрицательные результаты также могут быть вызваны слишком малым количеством опухолевых клеток в образце, чрезмерной деградацией нуклеиновой кислоты или концентрацией гена-мишени в реакционной системе амплификации ниже предела обнаружения.

Некоторые эксплуатационные показатели используемого комплекта соответствуют описанным. Аналитическая чувствительность: Для образцов ДНК минимальное обнаруживаемое количество общей нуклеиновой кислоты в этом наборе составляет 10 нг, а частота мутаций может быть обнаружена 5%. Для образцов РНК минимальное обнаруживаемое количество общей нуклеиновой кислоты в этом наборе составляет 10 нг. Коэффициент положительного и отрицательного совпадения: Коэффициент положительного и отрицательного совпадения достигает 100%. Предел обнаружения (LOD): Всего можно использовать 14 ссылок LOD, пронумерованных L1-L14. L1-L11 является LOD референсами генов MTHFR, DHFR, MTR, GGH и SLC19A1 , и результаты их обнаружения должны заключаться в том, что типы мутаций соответствующих сайтов генов положительны, а коэффициенты совпадения равны 100%. Повторяемость: Всего можно использовать пять повторяющихся эталонных материалов, пронумерованных R1-R5. R1 является сильным положительным повторяющимся эталонным материалом (мутация rs67376798 гена DPYD ). R2, который содержит эту мутацию в меньшем количестве, является слабым положительным повторяющимся эталонным материалом (мутация rs67376798 гена DPYD ), R3 является отрицательным повторяющимся эталонным материалом (6 сайтов генов DPYD, MTHFR и ABCB1 детектируются как дикий тип). Каждая референтная выборка должна быть проверена 10 раз, чтобы убедиться, что результаты этих повторных оценок соответствуют их заранее определенным классификациям. Объем данных: Эффективный объем данных образцов ДНК и РНК должен контролироваться выше 0,05 М. Глубина секвенирования образцов ДНК должна контролироваться выше 500, а картированные чтения образцов РНК должны контролироваться выше 20000. Интерференционный тест: На этот набор не влияют эндогенные интерференционные вещества (триглицериды и альбумин) и экзогенные интерференционные вещества (формалин и обезвоженный алкоголь).

Во время эксперимента необходимо соблюдать некоторые меры предосторожности. Используемый здесь набор может быть использован только для тестирования in vitro. Пожалуйста, внимательно прочтите эту инструкцию перед экспериментом и используйте ее в течение срока действия. Компоненты комплекта в разных партиях не могут использоваться взаимозаменяемо. Для предотвращения загрязнения рекомендуется использовать одноразовые расходные материалы для данного набора. Во время использования данного комплекта рекомендуется использовать всасывающую головку с фильтрующим элементом. Во избежание потенциальной биологической опасности в образце испытуемый образец следует рассматривать как инфекционные вещества, чтобы избежать контакта с кожей и слизистой оболочкой. Рекомендуется обрабатывать образцы в шкафу биобезопасности, который может предотвратить утечку аэрозолей. Пробирки и присоски, используемые в операции, должны быть стерилизованы перед утилизацией. Эксплуатация и утилизация образцов должны соответствовать требованиям соответствующих законов и нормативных актов: Общие руководящие принципы по биобезопасности микробных биомедицинских лабораторий и Правила обращения с медицинскими отходами Министерства здравоохранения^30,31. Экспериментальный персонал должен иметь профессиональную подготовку, действовать в строгом соответствии с инструкциями и строго разделять зоны в соответствии с экспериментальным процессом. Специальные приборы и оборудование должны использоваться на каждой стадии опытной эксплуатации, и изделия на каждой стадии каждой области не должны использоваться взаимозаменяемо. Экспериментальный персонал должен строго разделять зоны в соответствии с экспериментальным процессом. На каждом этапе опытной эксплуатации должны использоваться специальные приборы и оборудование. При необходимости примите меры защиты, такие как перчатки, рабочая одежда и т. д. Утилизация отходов должна осуществляться в соответствии с соответствующими национальными нормами.

Несмотря на то, что основное внимание в этой статье уделяется семи SNP в пяти генах, связанных с раком желудка, секвенирование в практических приложениях не ограничивается только этими пятью генами. В этой статье окончательно установлена значимая корреляция между семью SNP и чувствительностью к химиотерапии 5-FU при раке желудка.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL DNA LoBind Tubes	Eppendorf	30108051
50 mL tubes	Greiner Bio-One	227261
Amplification primer of gastric cancer	Thermo Fisher		The primers are sythesized by Thermo Fshier according to the sequence in Table 1.
Deparaffinization	Qiagen	19093
DNA purification magnetic beads	Bechkman	A63881
Ethyl alcohol	Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific		http://www.chemicalreagent.com/
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0	Thermo Fisher	4480441
Nuclease-Free Water	Life Technologies	AM9932
PCR tubes	Axygen	PCR-02D-C
PCR tubes	Axygen	PCR-02D-C
Pipette tips	Quality Scientific Products		https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
PureLink RNA Mini Columns	Thermo Fisher	A29839
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit	Thermo Fisher	AM1975
Tabletop mini centrifuge	SCILOGES	S1010E
Thermal Cycler	Life Technologies	4375786
Ultramicro nucleic acid analyzer	BEIJING ORIENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT LTD.	BD-1000