Из емкости биореактора с перемешиванием временно прекратите контроль температуры pH и DO на контроллере биореактора и полностью выдайте всю PBS из емкости в бутылку для отходов. Приварите к одноразовому фильтрационному модулю к порту на 10-литровой одноразовой сумке для хранения. Отфильтруйте и переложите всю среду MSC, не содержащую сыворотки, в сумку для хранения.
Установите одну скорость насоса на 300 об/мин. И выдать один литр среды из мешка с кормом в сосуд. Остановите насос.
И запускаем температуру pH и растворяем до DO снова, согласно инструкциям производителя. Загерметизируйте и отсоедините трубку, соединяющую обратную связь с подающей трубкой. Приварите трубку от бутылки с дисперсными микроносителями к подающей трубке.
И перекачиваем все содержимое из бутылки в сосуд. Затем повторно суспендируйте в 2,5 раза по 10 до восьми HMC в среде, не содержащей сыворотки, и перенесите их в пустую бутылку, ранее содержащую микронесущую суспензию. Добавьте среду без сыворотки до 500 миллилитров в общей сложности внутрь флакона и перемешайте клеточную суспензию.
Перекачайте все содержимое из бутылки в сосуд. Запечатайте и отсоедините трубку, соединяющую бутылку с подающей трубкой, а затем заварите обратно мешок для корма. Отрегулируйте настройки перемешивания на контроллере, чтобы инициировать инокуляцию клеток на микроносители.
И настроить автоматизированный режим пополнения и обмена носителей. Приварите одноразовые пакеты для отбора проб к пробоотборной трубке. И собрать образцы в нужные временные точки.
Во время сбора клеток на контроллере установите скорость перемешивания равной нулю, чтобы микроносители осели. И дозировать надосадочную жидкость в режим подачи, оставив в сосуде примерно один литр суспензии культуры. Сварите пакетик, содержащий 50 миллилитров свежеприготовленного раствора для варгеста, с 500 миллилитрами HBSS для разбавления.
И закачайте весь раствор в сосуд, через питательную трубку. Установите скорость перемешивания в диапазоне от 40 до 45 об/мин, чтобы растворить микроносители. После того, как микроносители растворятся в течение 40-60 минут, приварите одноразовый трехлитровый мешок для хранения к трубке для сбора урожая и полностью откачайте клеточную суспензию.
Включите систему обработки клеток во время забора клеток. И установить на инструмент набор для обработки одноразовых ячеек, согласно инструкции производителя. Приварите мешки с клеточной суспензией, промывочным буфером и питательной средой к набору.
Введите рабочие параметры и запустите автоматизированный процесс мойки и повторной суспензии. Соберите образец клеток из камеры центрифуги в соответствии с инструкциями систем обработки клеток для расчета плотности клеток. После подсчета отрегулируйте плотность клеток до двух умно-10 до шести клеток на миллилитр, используя полную среду без сыворотки.
Для процесса приготовления клеточной формулы в биореакторе объемом 15 литров используйте буфер для повторного суспендирования собранных клеток. Приварите 250 миллилитров ресуспендированных элементов к наполнителю ячейки. Соберите одноразовый набор расходных материалов для заливки и отделки на систему наполнения ячеек.
И включите систему предварительного охлаждения, следуя инструкциям производителя до того, как элементы будут повторно подвешены. Следуйте инструкциям на системе и настройте ее на наполнение 30 миллилитров на мешок, всего 20 пакетов на комплект. Приварите новый набор из 20 пакетов для криоконсервации к одноразовому набору расходных материалов для наполнения и отделки и повторяйте заполнение и отделку, пока все ячейки не будут аликвотированы.
Для МСК было достигнуто накопленное 128-кратное расширение при жизнеспособности клеток выше 90%. Свежесобранные МСК сохраняют классические фенотипические маркеры с экспрессией более 95% для положительных маркеров и менее 2% для отрицательных маркеров. Криоконсервированные клетки показали хорошую адгезию, нормальное поведение при расширении и типичную форму веретена со спиральным ростом после размораживания и повторного нанесения покрытия на 2D-колбы.
Кроме того, клетки также сохранили свою способность дифференцироваться в остеогенные, адипогенные и хондрогенные линии. Эта платформа может быть использована и для культивирования других клеток, зависящих от анкориджа, таких как клетки HEK293T и Vero. После процесса переноса B2B в 15-литровом биореакторе HEK293T клетки достигли пиковой концентрации в 1,68 раза в 10 из семи клеток на миллилитр.
В то время как клетки Vero достигали концентрации 1,08 умножить на 10 к семи клеткам. Оба типа клеток сохраняли высокую жизнеспособность.
