Соберите клетки MCF-7 путем центрифугирования при температуре 560-G в течение трех минут, при четырех градусах Цельсия. Добавьте 500 микролитров буферизованного RL-1 в пять раз по 10 к шести клеткам и тщательно перемешайте до тех пор, пока не исчезнут клеточные массы. Затем перенесите гомогенаты клеток в колонку для очистки ДНК, встроенную в пробирку для сбора.
Центрифугируйте образцы при 85-50-G в течение двух минут, при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования снимите колонку для очистки ДНК, сохранив надосадочную жидкость в пробирке для сбора. Добавьте 800 микролитров буфера RL-2 и 500 микролитров надосадочной жидкости, и аккуратно перемешайте.
Затем перенесите 700 микролитров смеси в колонку только для РНК, встроенную в пробирку для сбора. Центрифугируйте пробирку при температуре 8, 550-G в течение одной минуты, при четырех градусах Цельсия. Затем выбросьте проточный поток в сборную трубку.
Промойте колонку, состоящую только из РНК, сначала 500 миллилитрами буфера RW-1, а затем 700 миллилитрами буфера RW-2, центрифугируя в течение одной минуты при температуре 8,550-G и четырех градусах Цельсия при каждой промывке. После повторного удаления остаточного RW-2 методом центрифугирования перенесите колонку, содержащую только РНК, в новую пробирку для сбора. Добавьте 100 микролитров деионизированной воды без РНК, предварительно нагретой до 65 градусов Цельсия, к центру мембраны в колонке, содержащей только РНК, и подождите две минуты.
Затем центрифугируйте при 8 550-G в течение одной минуты, при четырех градусах Цельсия, чтобы собрать раствор РНК. Настройте реакционную смесь для ПЦР, а затем задайте условия ПЦР-реакции системы. Выполните процедуру QRT PCR.
ПЦР QRT показала, что лечение цилиндричностью способствует экспрессии генов проапоптотических факторов CC-9, CC-7, CC-3, vim и vax, в то же время подавляя экспрессию генов антиапоптотического BCL-2. Кроме того, введение цилиндрицидов снижало уровни экспрессии генов PI-3K, AKT, M-tor, HIF1-Alpha и Fox-01.
