Чтобы начать проточный цитометрический анализ, сначала установите 785-нанометровый лазер на мощность пять милливатт для измерений в темном поле. Используйте объектив 60X с числовой апертурой 0,9. Затем выберите настройку высокой чувствительности и установите низкую скорость.
Чтобы убедиться в стабильности калибровочного валика, нажмите кнопку воспроизведения в окне жидкости и изучите изображения валиков, которые должны выглядеть четкими и четкими. Создайте новую точечную диаграмму в поле рабочей области, выбрав Новая точечная диаграмма. Затем выберите область в канале Brightfield, которая соответствует интенсивности канала SSC, и исключите калибровочные валики, которые одновременно идут в образце.
Затем нажмите кнопку «Загрузить» и поместите пробирку с образцом лактобактерий в держатель. В поле Параметры сбора данных введите имя образца и укажите место хранения данных. Задайте количество регистрируемых событий, обычно в диапазоне от 10 000 до 20 000 событий.
Теперь начните процесс сбора, нажав кнопку «Запись», расположенную в поле «Получение». Процесс остановится после достижения заданного объема событий. Нажмите кнопку «Возврат», чтобы выгрузить трубку, и извлеките ее из держателя, как указано во всплывающем окне.
Повторив процесс для всех образцов, сохраните шаблон для поддержания единообразия сбора данных. Для анализа данных, чтобы загрузить необработанный файл в программное обеспечение для анализа, нажмите «Файл» и откройте файл rif. В открывшемся окне выберите пункт «Использовать анализ приобретения» и нажмите кнопку «ОК». Далее, чтобы создать гистограмму градиентного среднеквадратичного корня, нажмите кнопку Новая гистограмма и выберите популяцию из полученного материала для анализа.
В разделе «Ось X» выберите «Градиентное среднеквадратичное значение» для канала Brightfield. Затем разместите строб, чтобы исключить несфокусированные события, нажав кнопку Создать область линии в области анализа. Создайте диаграмму рассеяния площади в зависимости от соотношения сторон, нажав кнопку Новая диаграмма рассеяния в области анализа.
Выберите сфокусированное население в окне Новая диаграмма рассеяния. Затем выберите область канала Brightfield для функции X-Axis. Выберите соотношение сторон для функции «Ось Y».
Нарисуйте вентиль на диаграмме рассеяния с помощью кнопки Создать прямоугольник на основе значения площади для совокупности агрегированных событий. Точно так же нарисуйте еще одни ворота для одиночной и малой совокупной популяции. Сохраните анализ данных в качестве шаблона, щелкнув вкладку «Файл», выбрав «Сохранить как шаблон» ast, а затем откройте следующий файл образца по тому же шаблону, чтобы создать файл анализа данных.
Чтобы измерить распределение агрегированных размеров, начните с построения гистограммы площади популяции агрегированных событий. Сохраните анализ данных, щелкнув по файлу и выбрав опцию «Сохранить как шаблон». После сохранения откройте следующий файл образца по тому же шаблону для файла анализа данных.
Одиночные клетки, малые агрегаты, большие агрегаты и цепи наблюдались у LGG и L.paracasei, но отличить цепи от более крупных агрегатов не представлялось возможным. Наблюдались значительные различия в характеристиках агрегации различных штаммов LAB в ответ на ферментируемые или неферментируемые сахара.
