Данные, полученные с помощью этого метода, способствуют пониманию аутоиммунных моделей склонных к мышам, а также гуманизированных мышей, которые могут быть использованы для общей терапии антител или антител. Наличие реагентов с постоянно расширяющимся диапазоном флуорофоров, позволяет проводить одновременный анализ нескольких параметров на отдельных клетках и позволяет оценить гетерогенность В-клеток. Этот протокол был разработан с целью фенотипирования генетически модифицированных мышей.
чтобы определить, изменят ли генетические манипуляции развитие В-клеток. Привет, я Фейт Харрис. Сегодня я продемонстрирую эту процедуру.
Начните с аликвотирования миллиона каждого типа клеток от каждого животного в 96-луночную U-образную нижнюю пластину. Убедитесь, что достаточное количество скважин доступно для всех образцов и контрольных образцов, включая полное окрашивание, флуоресценцию минус один образец и неокрашенные образцы для каждого флуорофора. Для панели созревания костного мозга и панели созревания селезенки аликвотные клетки в две лунки, по 1 миллиону клеток на лунку для каждого полного образца пятна.
Для элементов управления жизнеспособностью одной цветовой компенсации добавьте по два миллиона ячеек каждого типа клеток в отдельные колодцы. Центрифугируйте пластину при 845 х г в течение двух минут при четырех градусах Цельсия. Декантируйте супернатант, быстро переворачивая и перемещая пластину над раковиной, следя за тем, чтобы не загрязнить колодцы перекрестно.
Промывайте ячейки дважды в 200 микролитрах DPBS. Центрифуга и декант супернатанта после каждой стирки. Повторно суспендируют клетки в 100 микролитров жизнеспособности красителя, разбавленного в DPBS в соотношении один к 1000, избегая клеток, используемых для одиночной цветовой компенсации.
Для каждого набора пятен оставьте несколько незапятнанных колодцев для полностью незапятнанного образца и других элементов управления, которые могут вам понадобиться, а также дополнительного незапятнанного колодца для контроля жизнеспособности FMO. Добавьте PBS к этим скважинам. Ресуспендирование клеток одноцветной компенсации жизнеспособности контролируется в 200 микролитров разбавленного красителя жизнеспособности.
Переложите 100 микролитров этих клеток в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку и нагрейте ее в течение пяти минут при 65 градусах Цельсия, затем перенесите нагретые ячейки обратно в исходную колодцу с оставшимися живыми клетками. Инкубируйте клетки при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут, защищенных от света. После инкубации центрифугируют клетки и декантируют супернатант, щелкая или переворачивая пластину без перекрестного загрязнения других лунок.
Промывайте клетки путем повторного использования в 200 микролитрах DPBS, затем центрифугируйте и декантируйте супернатант, как и раньше. Повторите стирку DPBS еще раз. Добавьте микролитры блока FC, разбавленные буфером пятен в соотношении один к 50, чтобы получить конечную концентрацию 10 мкг на миллилитр.
Для перитонеальных клеток добавьте пять микролитров блокатора моноцитов, чтобы уменьшить неспецифическое окрашивание. Затем инкубируют клетки при четырех градусах Цельсия в течение 15 минут, защищенные от света. Подготовьте полные мастер-смеси пятен и FMO в буфере пятен для окончательного объема 100 микролитров на миллион клеток, используя таблицы антител в текстовой рукописи.
Не удаляя блок FC, добавьте 100 микролитров полноценных пятнистых смесей и GMO в выбранные скважины. Подготовьте элементы управления цветовой компенсацией для каждого антитела и набора пятен. Следуйте указаниям производителя при использовании компенсационных бусин.
Инкубируйте клетки и бусины при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут, защищенных от света. Затем центрифугируйте и декантируйте супернатант, переворачивая и щелкая пластиной. Промывайте ячейки и шарики в 200 микролитрах пятнового буфера три раза, каждый раз центрифугируя и декантируя супернатант.
Повторное суспендирование клеток и шариков в 200 микролитрах 2% параформальдегида в DPBS для фиксации образцов для анализа. Инкубируйте ячейку и шарики при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут, защищенных от света, затем центрифугируйте и декантируйте супернатант путем инвертирования или щелчка пластины. Повторное суспендирование клеток и шариков в 200 микролитрах пятнового буфера.
Поместите фильтровальную пластину на чистую 96-луночную U-образную нижнюю пластину и перенесите каждый образец в колодец фильтрующей пластины с помощью мультипипетки. Центрифугируйте фильтрующую пластину и декантируйте супернатант. Для панелей созревания костного мозга и селезенки повторно суспендируйте полностью окрашенные клетки в 100 микролитрах пятнового буфера.
Объедините две лунки для каждого животного в одну лунку. Повторное суспендирование оставшихся панелей, GMO и элементов управления в 200 микролитрах буфера пятен. Инкубируйте фиксированные ячейки и бусины при четырех градусах Цельсия в течение ночи, защищенные от света.
Запишите контроль компенсации для каждой пятеночной панели, используя подготовленные компенсации одного пятна, и установите положительные и отрицательные затворы для каждого образца. Рассчитайте компенсационную матрицу с помощью программного обеспечения. Начните приобретать первый образец, убедившись, что ворота установлены соответствующим образом.
Установите устройство для запуска и записи различных событий ячейки для каждого образца, как указано в текстовой рукописи. Приступайте к анализу данных с использованием программного обеспечения для анализа проточной цитометрии, следуя стратегиям захвата в текстовой рукописи. Проточный цитометрический анализ для характеристики перитонеальных В-клеток в брюшине показывает частоты жизнеспособных перитонеальных клеток, общих В-клеток, подмножеств B-1 и B-2, а также клеток B-1a и B-1b у мышей.
При анализе В-клеток костного мозга определяли частоты жизнеспособных клеток, общих В-клеток, фракции А, препро-В-клеток, фракции В, фракции С, фракции С'фракции D, незрелой фракции Е, переходной фракции Е и фракции F В-клеток у мышей. Анализ селезеночных В-клеток показывает частоты жизнеспособных клеток селезенки, общих В-клеток, переходных В-клеток, Т1, Т2, Т3-клеток, зрелых В-клеток, фолликулярных I-клеток, фолликулярных II-клеток, клеток-предшественников и зрелых клеток маргинальной зоны и клеток В-1 у мышей. Частоты иммуноглобулина каппа и иммуноглобулина лямбда-В-клеток у мышей определяли с помощью проточного цитометрического анализа селезенки.
При выполнении этого протокола необходимо разрешить сигнал от одного детектора, переходящего в другой, используя элементы управления компенсацией. Эти элементы управления могут быть либо окрашены в клетку по отдельности, либо с коммерчески доступными компенсационными шариками. Дополнительные анализы могут быть использованы в сочетании с проточной цитометрией, такими как иммуногистохимия для визуализации локализации клеток в лимфоидных органах, а также две фотонные микроскопии для анализа реакций В-клеток в реальном пространстве и времени.
Анализ проточной цитометрии компартментов В-клеток позволяет характеризовать фенотипы, связанные с BCR и связанными с ним недостатками, возмущениями сигнальных молекул BCR или нарушением цитокинов, которые модулируют выживание В-клеток.
