Клеточное фракционирование островков поджелудочной железы макак-резуса для секвенирования РНК одиночных клеток и метаболомики

Для начала разморозьте изолированную островковую ткань поджелудочной железы макак-резуса на льду. Добавьте 500 микролитров буфера для лизиса 0,1X в тканевую гранулу. Используя одноразовый пестик для гранул без РНКазы, аккуратно гомогенизируйте ткань 15 раз на льду.

Инкубируйте образец на льду в течение 10 минут. Затем добавьте 500 микролитров промывочного буфера в гомогенат и аккуратно перемешайте пипеткой на льду. Загрунтуйте 30-микрометровый фильтр предварительной сепарации 300 миллилитров промывочного буфера и отфильтруйте один миллилитр клеточного гомогената в пятимиллилитровую пробирку.

Отфильтрованный гомогенат вращается при температуре 500 г в течение пяти минут в центрифуге с качающимся ведром при температуре четыре градуса Цельсия. С помощью пипетки переложите один миллилитр надосадочной жидкости в криоциал на льду и сразу же заморозьте его при температуре минус 80 градусов Цельсия для будущих экспериментов по метаболомике. Добавьте один миллилитр промывочного буфера по каплям в гранулу ядра, чтобы ресуспендировать его.

Промытую гранулу крутите при температуре 1 000 г в течение пяти минут в центрифуге с качающимся ведром при температуре четыре градуса Цельсия. После повторения промывки ресуспендируйте ядра в одном миллилитре промывочного буфера. С помощью пипетки смешайте по 10 микролитров суспензии ядер и 0,4% Трипана Синего в отдельной пробирке, и добавьте смесь на предметное стекло автоматического счетчика клеток.

Наконец, с помощью клеточного счетчика определите концентрацию ядер. Для проведения экспериментов по секвенированию было получено идеальное интактное ядро. На основе исследований экспрессии генов была получена кластеризация клеточных подтипов UMAP в пределах изолированных островков плода, нечеловека, приматов.

С использованием цитозольных фракций было получено обилие островковых метаболитов, таких как дигидроксиацетонфосфат, глицерин-3-фосфат, 2-оксоглутарат, креатин и глутатион.