Этот метод позволяет количественно оценить потребление кислорода с небольшим количеством островков соответствующих видов, таких как не-человеческих приматов и людей, что позволяет оценить митохондриальную функцию. Этот метод может быть выполнен с небольшим количеством первичных островков, увеличивая технические репликации, что позволяет для тестирования нескольких условий, и улучшение строгости и воспроизводимости анализа. Этот метод оценивает митохондриальное здоровье, основной детерминант функции островка и секреции инсулина, которая часто нарушается при диабете и является значительным предиктором успешной трансплантации островка.
Важно убедиться, что островки локализованы в центре скважин после передачи. Невыполнение этого меры приводит к непоследовательным измерениям потребления кислорода. Демонстрация этой процедуры будет, Валери Ricciardi, студент работает в моей лаборатории.
За день до анализа добавьте 200 микролитров клеточного и тканевого клея в 2,8 миллилитров 0,1 молярного бикарбоната и добавьте 20 микролитров полученного раствора на дно каждой колодец 96 хорошо сфероидной микроплеи. Убедитесь, что любые пузырьки воздуха удаляются из наконечника пипетки. Когда все скважины были загружены, поместите пластину в 37 градусов по Цельсию неуглеродного диоксида инкубатора.
Через час, аспирировать клеточный клей раствор из пластины в стерильной среде и мыть каждый хорошо два раза с 400 микролитров 37 градусов по Цельсию стерильной воды. Затем дайте колодцам высохнуть в течение 30-40 минут, прежде чем покрыть пластину для ночного хранения при четырех градусах Цельсия. Чтобы увлажнить сенсорный картридж, в стерильной среде откройте пакет картриджа датчика и удалите содержимое.
Поместите сенсорный картридж вверх дном рядом с коммунальной пластиной и заполните каждый колодец полезной пластины 200 микролитров стерильной воды. Когда все скважины были загружены, опустите картридж датчика в утилиту пластины и поместите собранный картридж датчика и утилиты пластины в 37 градусов по Цельсию неуглеродного диоксида инкубатора на ночь. В день анализа снимите крышку картриджа датчика и вынюхив воду из колодцев коммунальной пластины.
Добавьте 200 миллилитров довоенной калорийны в каждую колодец и замените крышку картриджа датчика. Затем поместите сенсорный картридж обратно в инкубатор в течение примерно одного часа. Чтобы подготовить островки для передачи, вручную соберите островки в блюдо культуры клеток 60 на 15 миллиметров, содержащее собранную среду до почти 100%-ную чистоту.
Когда все островки были собраны, загрузите каждую колодец подготовленной сфероидной микроплины 175 микролитров собранной среды и используйте пипетку P20, установленную до 15 микролитров, чтобы аспирировать 15 островков в 15 микролитров среды из блюда клеточной культуры. Чтобы сеять островки на сфероидной микроплее, опустите кончик пипетки на дно колодец, едва поднимите кончик и медленно разпределите около пяти микролитров среды. Чтобы загрузить островки в колодцы, позвольте островкам поселиться в кончике пипетки, прежде чем аккуратно выпустить их прямо над дном центра скважины в небольшом объеме среды.
Подтвердите, что все островки оставили кончик пипетки, время от времени проверяя сфероидную микроплюсу под микроскопом, чтобы убедиться, что островки посеяны в нижней части пластины и не прилипли к сторонам скважин. Когда все островки были переданы, поместите микропластить в 37 градусов по Цельсию неуглеродного диоксида инкубатора. Перед началом процедуры анализа загрузите порт А сенсорного картриджа 20 микролитров свежеприготовленного 45 микромолярного олигомицина, порт В с 22 микролитров свежеприготовленных 10 микромолейных FCCP и Port C с 25 микролитров свежеприготовленного 25 микромолейного ротенона АА. Далее запрограммируйте экстраклеточный анализатор потока в течение 30-минутного базового периода дыхания, 42-минутного периода измерения олигомицина, 30-минутного периода FCCP и 30-минутного периода ротенон аА.
Затем запустите анализ в соответствии с инструкциями на экране для калибровки датчика и вставки микроплюса. Для доставки островков на анализную пластину, 15 островков должны быть аспирированы в 15 микролитров среднего, как показано на иллюстрации. Этот метод приведет к последовательному размещению островков в нижней части каждого микроплоцита хорошо позволяет точные измерения потребления кислорода.
В ходе этого репрезентативного эксперимента, показывающего потребление кислорода в отдельных скважинах, скважины были плохо загружены, что привело к очень низкому базовому уровню потребления кислорода и практически не ответило на FCCP. В этом эксперименте большинство скважин продемонстрировали значительное базовое дыхание и реакцию на наркотики. Тем не менее, две скважины не проявляли никакой реакции на ротенон, предполагая, что препарат не был должным образом выпущен в колодец.
Эти скважины были исключены из дальнейшего анализа. Здесь можно наблюдать результаты успешного анализа, в котором скважины были должным образом загружены островками и правильно введены с наркотиками. Полезно подготовить реагенты и пластины за день до выполнения анализа, чтобы островки, которые будут использоваться вскоре после того, как они изолированы или получены.
После анализа островки могут быть восстановлены для извлечения белка или ДНК для нормализации данных о потреблении кислорода или количественной оценки содержания митохондриальной ДНК. Способность измерять митохондриальную функцию в небольшом количестве первичных островков приматов позволяет тестировать несколько препаратов и другие манипуляции в одной биологической репликации. Лица, работающие с первичными островками приматов должны быть уверены, чтобы быть обучены надлежащей и безопасной обработки с этими тканями.
В частности, использование соответствующего средства индивидуальной защиты и надлежащее удаление этих образцов.
