Этот метод адаптирует протокол метатарной культуры к более крупным костям, позволяя сочетать прямые манипуляции с костями со сложными генетическими моделями для решения процессов, связанных с развитием костей. Этот метод позволяет манипуляции и анализ роста костей, которые невозможны in vivo, такие как живая визуализация или прямые физические и фармакологические манипуляции. Этот метод культуры ex vivo позволяет конкретно изучить локальные эффекты генетической вставки в кости, отделяя ее от системного воздействия лечения на организм.
Начните с стерилизации брюшной области беременной гестационный день 14,5 до 18,5 мыши с 80%этанола и с помощью небольших ножниц, чтобы открыть кожу и мышцы живота для доступа к рогам матки. Чтобы извлечь матку из брюшной полости, удалить мезометрий и сократить основание рога. Затем перенесите матку в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую ледяную препарацию среды на льду.
В биобезопасности шкаф разрезают между мешками ножницами, чтобы отделить отдельных плодов, и передать индивидуальный мешок в новый 60-миллиметровый блюдо со свежей средой вскрытия под стерео микроскопом вскрытия. Используйте пинцет, чтобы отделить плод от плаценты и очистить плод от мембран. Используйте подстриженную пластиковую пипетку, чтобы перенести тело в новую 60-миллиметровую тарелку и обезглавить эмбрион перед дальнейшим вскрытием.
Затем используйте пинцет, чтобы удалить кожу, начиная со спины и пилинг до ног. Используйте пинцет, чтобы сократить близко к позвоночнику и отделить задние конечности от тела. Перенесите задние конечности в чистую тарелку, содержащую ледяное вскрытие среды, и вставьте пинцет между поверхностным хрящом дистальной бедренной кости и проксимальной голени, чтобы отделить голени от бедренной кости.
Удалите тазобедренные кости из проксимальной бедренной кости и кости кальканея и малоберцовой кости из голени. Тщательно пресечь и вытащить мягкие ткани из бедренной кости и голени и использовать стерильные один миллилитр пипетки для передачи всех четырех костей ног в первый колодец 24-хорошо пластины, содержащей свежие вскрытия среды. Важно показать, что мягкая ткань, соединяющая пульс кости, удаляется.
В противном случае, кость будет согнуть и не достичь надлежащего роста. Когда кости были вскрыты из соответствующего экспериментального числа плодов, изображение костей в каждом хорошо порой ноль под световым микроскопом с хорошим контрастом и заменить вскрытие среды в каждом хорошо с одним миллилитр культуры среды на колодец принимая дополнительную осторожность, чтобы не аспирировать кости. Чтобы наблюдать эффект торможения роста в культурных условиях, лечить левую голени с 500 наномолярной ретинойной кислоты и инкубировать правые голени с эквивалентным объемом транспортного средства в качестве контроля.
Затем поместите пластину в инкубатор клеточной культуры в стандартных условиях клеточной культуры. Через два дня, лечить кости с соответствующим аналогом тимидин в течение одного-двух часов, чтобы оценить пролиферацию костных клеток перед передачей костей в отдельных двухми миллилитровых труб 4%paraformaldehyde в течение 10 минут. Затем перенесите кости в PBS, чтобы издать кости в последний момент времени, прежде чем вернуть образцы в параформальдегид для ночной фиксации при четырех градусах по Цельсию.
Для измерения длины и минерализованной области костей откройте соответствующую программу визуализации и с учетом масштаба изображения, измерьте как общую длину кости, так и минерализованную область. Начало измерений от первых темных клеток на одном конце до последних темных клеток на другом конце. Чтобы рассчитать темпы роста, которые определяются как среднее увеличение длины в день, разделите разницу между конечной длиной кости и начальной длиной на количество дней в культуре.
Здесь показано сравнение между культурной голени и свежевыжатой голени на эквивалентных стадиях. После двух дней культуры достигнутый размер сравним с ростом костей in vivo как для хряща, так и для минерализованной кости. Более длительные периоды культуры приводят к большим различиям между культурными костями и свежевынутых костей.
Обратите внимание, что голени, выращенные с неполным удалением мягких тканей может привести к изгибу культурной голени. Лечение ретинойной кислотой имеет сильное влияние на рост трибия уже после двух дней лечения. Хотя существует последовательное увеличение общей длины голени после двух дней в культуре, этот рост соответствует приблизительному увеличению только от девяти до 29% от первоначальной длины.
Меньше, чем рост костей увеличение, которое будет наблюдаться в vivo. Действительно, аналоговая маркировка тимидин показывает меньше положительных клеток в этом регионе после культуры по сравнению со свежевынутыми костями эквивалентной стадии. Кроме того, в в пробирке культурной голени, общая длина скелетного элемента значительно увеличивается, в то время как почти не наблюдается увеличения минерализованной области.
В дополнение к гистологическому и молекулярному анализу, очистка и 3D-изображение могут быть выполнены после культуры, чтобы охарактеризовать клеточный эффект лечения, применяемого к культурным костям. Методика позволяет решать вопросы, связанные с межорганической коммуникацией. Например, путем совместного культивирования костей из различных генетических моделей в какой-то безболезнезненый эксперимент парабиоза.
