Получение клеток, экспрессирующих рапамицин-регулируемую фосфатазу, к иммунопреципитации для оценки временного контроля тирозинфосфатаз

Для начала получите клетки HEK 293T и наберите 800 000 клеток на лунку в 6-луночном планшете для культивирования тканей в дополненной среде DMEM. Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа, чтобы достичь слюхания от 60 до 80%. Затем смешайте по одному микрограмму каждой плазмидной ДНК с 200 микролитрами бессывороточного DMEM и шестью микролитрами реагента для трансфекции.

После 15 минут инкубации дозируйте 100 микролитров трансфекционной смеси на лунку клеток. Инкубируйте в течение ночи в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом. На третий день добавьте соответствующее количество рапамицина или этанола отдельно в клетки и инкубируйте их в течение одного часа в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом.

Затем поставьте пластину на лед и аккуратно промойте клетки тремя миллилитрами холодного PBS. После удаления PBS добавьте 300 микролитров буфера для лизиса, содержащего рапамицин или этанол, и соскребите клетки скребком. Перенесите образец в пробирку объемом 1,5 миллилитра и микроцентрифугируйте его в течение 10 минут при 1000 г при четырех градусах Цельсия.

Чтобы проверить уровень мимики, введите 20 микролитров надосадочной жидкости в новую 1,5-миллилитровую трубку. Инкубируйте образец с 20 микролитрами 2-кратного буфера Laemmli, содержащего 5% бета-меркаптоэтанола, при температуре от 95 до 100 градусов Цельсия в течение пяти минут.