Мы благодарим Джиллиан Stanfield замечания по рукописи. Таджикистан при поддержке Университета штата Юта генетики Обучение Грант T32-GM007464 от NIGMS NIH.

1. Мозаика поколения <ol><li> Генетические Креста W FRT 19А ванна: GAL80 ФЛП 122 / Y; BTL-GAL4, UAS-GFP (мужчины) X * FRT 19А / Бал (женщины), где * представляет собой мутанта, подлежащих рассмотрению. Примечание: Настройка пересечь по крайней мере за один день до эксперимента, так как это позволяет животным спариваться соответствующим образом. </li><li> До прокладки: Трансфер крест летать питания флаконы с небольшим мазком свежей пасты дрожжей поместить на носитель. Разрешите заложить в течение 1 часа при 25 ° C. </li><li> Lay: Трансфер животных от до прокладки флакон новый флакон с небольшой мазок свежей пасты дрожжей. Разрешите заложить в течение 6 часов при 25 ° C. </li><li> Передача взрослых обратно в предварительно лежал флакон для хранения и использования в последующих экспериментах. Сразу теплового шока, что к чему флакон, содержащий 0-6 часа эмбрионы в течение 45 мин при 38 ° С, в циркуляционной водяной бани. Примечание: поверхность пищевого продукта должна быть ниже уровня воды для проверки всехЭмбрионы соответствующим тепловому шоку. </li><li> Выдержите тепловому шоку флаконах при 25 ° С в течение 4-5 дней, пока третий возраст не начинают бродить. </li></ol> 2. Экран для мозаичных Животные <ol><li> Использование тонких щипцов осторожно выбирать блуждающий личинок третьего возраста от стенок сосуда и поместить их в охлажденный 100% глицерина в небольшую пластиковую пластину. </li><li> Изучить личинки использовании большого увеличения рассекает микроскоп оснащен флуоресцентным оптики. Определить личинки с мозаичными выражение флуоресцентно меченных трахеи клетками. Как правило, это может быть сделано в 10-20-кратным увеличением. </li></ol> 3. Термофиксации <ol><li> Использование тонких щипцов тщательно подобрать мозаику животных из блюда и место в капле свежей 100% глицерина на 75x25x1 мм белый предметное стекло микроскопа. Примечание: несколько животных могут быть помещены в капли (рис. 1А). Животные могут также быть помещены в капле глицерина непосредственно на покровное стекло,но необходимо соблюдать осторожность при фиксации (п. 3.2), а животные будут нагреваться очень быстро и может стать более фиксированной. </li><li> Место стекло на 70 ° C тепла блока до животных не просто остановить движение, не более 20 сек для слайд, и 10 сек для покровного стекла (рис. 1В). Животные извиваться изначально, но остановиться и становятся жесткими и удлиненные раз мертв. Примечание: слишком длинные воздействие тепла может привести к повреждению и конечные ветви люмен, а также сделать сигнал GFP тусклым и диффузным. Для оптимальной эффективности рекомендуется иметь нагревательный блок в одной комнате с микроскопами. </li><li> Использование тонких щипцов тщательно ориентировать все личинки в капле в одном направлении, так что все личинки на слайде ориентированы параллельно друг другу (фиг. 1С). </li><li> Аккуратно 18x18mm микро стеклянной крышкой в верхней части личинки (или инвертировать покровное на предметное стекло) и избежать образования пузырей (рис. 1D). Примечание: покровного не может лежать точноплоская над личинками, это не проблема. </li><li> Изображения личинок в течение 30 мин. Тепло фиксированных клетках терминал будет деградировать и GFP сигнал станет очень диффузным. </li></ol> 4. Прижизненного изображения трахеи Клетки терминал <ol><li> Поместите слайд на стадии соединение стереомикроскопа. Использование 5-кратным цель найти двух параллельных стволов спинного работает спереди назад на спинной поверхности животного (рис. 1F). Найдите два спинных клетки терминала, непосредственно между двумя спинным стволов. Это помогает определить соответствующий сегмент для анализа. </li><li> После ориентированной, вращать изображения животных нужные ячейки терминала. Чтобы сделать это, осторожно толкать покровное на краю пинцетом, перпендикулярных продольной оси личинки, медленно прокатки личинки под покровным (фиг. 1E и 1G). </li><li> Выбор подходящей клетки терминал имеет решающее значение для устойчивых результатови сравнения между мутантами. Филиал жира тела (FB) клетки терминала можно легко найти рядом с спинной ствол, сбоку от средней линии. Боковые группы G терминал клетки (LG) легко найдены и находятся всего в боковом из вентральной срединной линии (рис. 1H). Примечание: в самой передней (Tr1) и задний (Tr10) сегментах расположения терминала клетки расходится от других сегментов. Мы только анализировать терминала клеток в сегментах TR2-TR9. Клетках спинного терминала имеют более стереотипные ветвления, чем другие клетки трахеи терминала. Это может зависеть от дополнительных, не автономные ячейки сигналы, и это следует учитывать при принятии решения о включении их в анализе. </li><li> После выводом элемента интерес был определен, захват изображения с помощью желаемого увеличения; обычно 10X или 20X лучше (рис. 2А). Примечание: в связи с переменной ветвящиеся структуры, пытаются захватить изображения, в которых, как многие отрасли и отраслевых советов, как возможно. </li><li> Не двигая сцену, выключите флуоресценции и включите проходящем свете, чтобы захватить светлое изображение того же клетке и фокальной плоскости (рис. 2В). Просвет будет представить как мрачно контрастные в терминале пространстве клетки. Если планируете количественно выводом элемента филиалов и люмен, собирать несколько изображений в различных фокальных плоскостях каждого терминала клетки. </li></ol> 5. Анализ и количественное определение терминала морфологии клеток с использованием ImageJ <ol><li> Откройте люминесцентные и светлого изображения с помощью ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) плагин NeuronJ ( <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/" target="_blank">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</a> ). </li><li> Используя кнопку &quot;Добавить обводка&quot; инструмент, вручную отслеживать филиалов и просвета всей клетки терминала. </li><li> Использование &quot;Этикетка обводка&quot; инструмент, переименовывать и Recolor назначить каждой линии в след специальное обозначение. </li><li> Использование &quot;Настройка параметров&quot; инструмент, регулировать толщину линии из 6-10 пикселей (512x512 для изображений, полученных с цифровой камеры подключены к сложным микроскопом. Для выше или ниже разрешение камер, то ширина должна быть масштабной должным образом), используя все остальные параметры по умолчанию, и выберите &quot;OK&quot;. Затем с помощью &quot;Сделать снимок&quot; инструмент для получения изображения. Выберите &quot;Нарисуй след&quot;, чтобы получить снимок следов, которые могут быть показаны бок-о-бок с оригиналом. </li><li> Выберите &quot;Мера обводка&quot; и выберите инструмент отслеживания типа (т.е. какие отрасли для измерения на основе конкретных обозначений задавался в шаге 5.3). Далее выберите «Показать отслеживания измерений&quot; и &quot;Очистить предыдущих измерений&quot;, а затем нажмите кнопку &quot;Выполнить&quot;. Это позволит получить таблицу, содержащую имя, этикетки, длина (в пикселях), и другие данные для изображения. Эти данные могут быть сохранены в виде таблиц Microsoft Excel для дальнейшей статистическойанализа. </li></ol>

<ol>
	<li>Manning, G., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+Tracheal+System.">Development of the Drosophila Tracheal System.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).</li><li>Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+regulation+of+airway+branching+in+Drosophila+is+mediated+by+branchless+FGF.">Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF.</a> Cell. 99 (2), 211-220 (1999).</li><li>Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+interactions+among+epithelial+cells+during+tracheal+branching+morphogenesis.">Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis.</a> Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).</li><li>Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Zpr1+(Zinc+Finger+Protein+1)+Is+Required+Downstream+of+Both+EGFR+And+FGFR+Signaling+in+Tracheal+Subcellular+Lumen+Formation.">Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).</li><li>Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+screen+for+tube+morphogenesis+and+branching+genes+in+the+Drosophila+tracheal+system.">A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).</li><li>Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonal+genetic+screen+for+mutants+causing+defects+in+larval+tracheal+morphogenesis+in+Drosophila.">A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila.</a> Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).</li><li>Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whacked+and+Rab35+polarize+dynein-motor-complex-dependent+seamless+tube+growth.">Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth.</a> Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).</li><li>Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+talin+and+integrin+genes+are+required+for+maintenance+of+tracheal+terminal+branches+and+luminal+organization.">Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization.</a> Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).</li><li>Jones, T. A., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+the+PAR+complex+in+subcellular+morphogenesis+of+tracheal+terminal+cells+in+Drosophila+melanogaster.">A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).</li><li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell.">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+GFP/&#223;-galactosidase+fusion+protein+as+a+marker+for+morphogenesis+in+living+Drosophila.">A nuclear GFP/&#223;-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila.</a> Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).</li><li>Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -. C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+autonomy+of+HIF+effects+in+Drosophila:+tracheal+cells+sense+hypoxia+and+induce+terminal+branch+sprouting.">Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting.</a> Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).</li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Методика фиксации тепла описанный здесь быстрый и удобный инструмент для работы с изображениями дрозофилы личиночной трахеи клетки терминала. Здесь мы используем эту технику, чтобы изучить ветвления и просвет структуру клеток дикого типа. Трахеи клеток, экспрессирующих GFP, движи...

Сотовые форма является критической для функции отдельных клеток в организме, а также клетки, которые функционируют как часть ткани или органа. Мы используем Drosophila трахеи клетки терминал, компонент насекомых дыхательной системы, исследовать молекулярные механизмы, которые участвуют в контроле двух консервативных типов клеточной морфологии: ветвления и образование трубки (lumenogenesis). Терминал клетки расположены на концах сети разветвленных труб, который функционирует для доставки кислорода к внутренним тканям 1 и имеют сложную разветвленную морфология которых зависит от пути FGF сигнализации, которая управляется на местном уровне кислорода в тканях-мишенях 2. Конечные ветви ячейки тонких трубок, с газонаполненными субклеточную просвет проходит через каждого филиала. Различных сотовых архитектур терминал клетки, наряду с легкость, с которой генетический анализ может быть выполнен в Drosophila, делает эти клетки отличный е моделиили следственного механизмов клеточных вырост, ветвление и внутриклеточное образование трубки. Терминал клетки доказали полезной моделью для понимания некоторых сигнальных путей, ведущих к разветвленной дифференцировки клеток, заросли, и созревание 2-4. Используя эту систему объективной, вперед генетический скрининг мутантов клетки морфогенеза были выполнены, что дает информацию о механизмах регуляции клеточного формы 5,6. Например, эти экраны показали, что конкретный RabGAP требуется для цитоскелета полярности и везикул в просвете формирования и позиционирование 7; что интегрин-опосредованную адгезию требуется для ветви стабильность 8, и что эпителиальные PAR-полярность белки регулируют поляризованный торговли мембраны требуется для ветвления и формирования просвета 9. Другие исследования в терминале клетках показали, что асимметричный накоплению актина и организации микротрубочек необходима для удлинения клеток и lumenogenesis <sдо&gt; 10. Таким образом, разнообразные, консервативные клетка биологические механизмы способствуют терминала морфогенеза клетки. Здесь мы описываем способ быстро исправить нетронутыми третьего возраста личинок Drosophila для анализа клеммой элемента ветвления и образование просвета. Этот протокол также может быть выполнена на обоих первом и втором животных возрастной стадии. Ключ для этого метода является возможность визуализации терминал клетки, генетически меченных флуоресцентными экспрессии белка непосредственно через личиночной кутикулы интактных животных. Так как эта процедура не требует никакой последующей фиксацией манипуляций, таких как окрашивание антител, наблюдать клетки, он хорошо подходит для высокопроизводительного анализа, в том числе генетические или скрининга лекарственных средств. Флуоресцентные экспрессии белка раскрывает структуру цитоплазматически заполненные ветвей. Образование трубки можно отслеживать в режиме параллельного использования светлого микроскопии для идентификации газонаполненных просвета, который контрастирует с окружающей жидкостью заполненияЭд тканей. В этом протоколе является способ генерации генетической мозаики на основе системы MARCM 11, для производства гомозиготных мутантных клеток терминал меченных флуоресцентными белков в противном случае немеченого животных. Это необходимо, так как терминал клетки только разработать свои сложные структуры относительно поздно в процессе развития; генетической мозаики позволяют обход требований гена в других тканях ранее в развитии. . Для генерации MARCM клонов, трахеи помечены использованием трахеи конкретного драйвера дыхание (бут) 12 Описанный здесь протокол для хромосомы Drosophila X, для других хромосом, аналогичная процедура может быть использована, с генетическими реагентов соответствующей хромосоме быть рассмотрены. Здесь, трахеи помечены путем экспрессии цитоплазматически локализованных GFP, но процедура работает одинаково хорошо с экспрессией другие флуоресцентные белки, такие как DsRed. Кроме того, мы включили метод для количественного ветвящиеся структуры и формирования в просвете терминала элементы на основе методов, разработанных для характеристики моделей нейронных филиал 13. Этот вид количественных данных может иметь решающее значение в плане определения точной роли генов в процессе разветвления или lumenogenesis, а также позволяет прямое сравнение различных мутантов 9.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioImager M1 compound microscope (or equivalent)</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Glycerol</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>M152-4L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stock</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stock</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Genotype: y w FRT19A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of drosophila larval tracheal terminal cells by light microscopy

Сотовые формы имеет решающее значение для функции клеток. Однако, несмотря на важность морфологии клеток, очень мало известно о том, как отдельные клетки производят конкретные формы. Трахеи клетки Drosophila терминала стали мощным генетическая модель для определения и выяснения роли генов, необходимых для создания сотовой морфологии. Терминал клетки являются составной частью разветвленных трубчатых сети, трахеи система, которая функционирует для подачи кислорода к внутренней ткани. Терминал клетки являются прекрасной моделью для исследования вопросов формы клеток, поскольку они обладают двух различных сотовых архитектур. Во-первых, терминал клетки имеют сложную разветвленную морфологии, похож на комплекс нейронов, во-вторых, конечные ветви клетки образуются в тонких трубок и содержат мембраны внутриклеточных просвет. Количественный анализ выводом элемента номер ветви, отраслевой организации и индивидуальные формы филиал, могут быть использованы для предоставления информации о роли специфических генетических мехамов в создании разветвленной клетки. Анализ трубка образование в этих клетках может выявить консервативные механизмы тубулогенез общими для других трубчатых сетей, таких как позвоночные сосудистой сети. Здесь мы опишем методы, которые могут быть использованы для быстро исправить, изображений и проанализировать как ветвящиеся структуры и образование трубки в терминале клеток внутри личинки дрозофилы. Эти методы могут быть использованы для анализа терминал клетки дикого типа и мутантных животных, или генетических мозаик. Из-за высокой эффективности этого протокола, он также хорошо подходит для генетических, на основе РНК-интерференции, или наркотики экранов у дрозофилы трахеи системы.

Результаты показаны на рисунке 2. Одной боковой группы (LG) терминала ячейка показывает обширную субклеточную ветвления (визуализировали GFP;) и газонаполненные субклеточную просвет проходит через каждую из ветвей (изучались под микроскопом светлое, б). Эти изображения были собр...

Watch this Scientific Journal Video about Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy at JoVE.com

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Здесь мы представляем метод для легкого анализа микроскопии клетки трахеи терминала в<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинок. Этот метод позволяет быстро экспертизы отраслевых и просвета в целом морфология животных и было бы полезно для анализа отдельных мутантов или экраны для мутаций, влияющих на развитие терминала клетки.

Экспертиза<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинок трахеи Клетки терминала с помощью световой микроскопии

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

examination-drosophila-larval-tracheal-terminal-cells-light

Research

JoVE Journal

Biology

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

10.2K Views.  University of Utah. Здесь мы представляем метод для легкого анализа микроскопии клетки трахеи терминала в Drosophila Личинок. Этот метод позволяет быстро экспертизы отраслевых и просвета в целом морфология животных и было бы полезно для анализа отдельных мутантов или экран?...

Video: Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Препарирование личинок ЦНС у дрозофилы

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Дрозофилы личинок NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Дрозофилы личинок NMJ Immunohistochemistry

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Подготовка Drosophila S2 клеток для световой микроскопии

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Разбор и Окрашивание Drosophila Личинок Яичники

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

В естественных условиях клоновых Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников оцениваться пятью флуоресцентных белков с помощью конфокальной и многофотонной микроскопии

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Измерение личинок деятельности в<em&gt; Drosophila</em&gt; Монитор активности

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Изучение митотической и меиотической разложения дрожжей ядерной динамики флуоресценции Live-клеток Микроскопии

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model to study animal avoidance behavior. This protocol introduces a light-spot assay to investigate larval phototactic behavior. The experimental set-up includes two main parts: a visual stimulation system that generates the light spot, and an infrared light-based imaging system that records the process of larval light avoidance. This assay allows tracking of the behavior of larva before entering, during encountering, and after leaving the light spot. Details of larval movement including deceleration, pause, head casting, and turning can be captured and analyzed using this method.

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

This protocol introduces a light-spot assay to investigate Drosophila larval phototactic behavior. In this assay, a light spot is generated as light stimulation, and the process of larval light avoidance is recorded by an infrared light-based imaging system.

Свет пятно основе анализа для анализа Drosophila Larval Фототаксис

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...