Research in the author&#8217;s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board&#8217;s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.

1. Croissance de cellules de levure <ol><li> Sélectionner des souches de levure appropriées pour être utilisées pour les mesures de taux d&#39;ARNm de la pourriture. Pour inhiber la transcription en utilisant l&#39;allèle sensible de l&#39;ARN polymérase II de température, utiliser des souches de levure abritant la mutation rpb1-1 1. Obtenir cette souche de levure à partir d&#39;un laboratoire qui a déjà une, ou le générer en laboratoire en utilisant des techniques standard si un contexte génétique spécifique est requise 9. </li><li> Utilisant une technique stérile, préparer des milieux de levure utilisant des procédures standard 10. Si aucune sélection ne est nécessaire, préparer des milieux riches tels que YPD. En variante, la préparation des milieux sélectifs si les cellules de levure sont transformées par des plasmides et la sélection est requise. Autoclave les médias. </li><li> Cultiver les cellules de levure à 28 ° C, qui est la température permissive pour cette souche de levure. Pour ce faire, en deux étapes: <ol><li> Pour la première O / N, croître les cellules de levure dans 5 ml de milieu de croissance à saturation.</li><li> Mettre en place le deuxième O / N à la fin du deuxième jour. Pour la deuxième O / N, inoculer des quantités différentes de cellules de levure à partir de la première O / N dans 100 à 150 ml de milieu de croissance (allant de 100 ul à 1 ml, 2 ml ou plus, selon le moment où les cellules de levure doivent être récolté le jour suivant). Effectuez cette opération pour se assurer que l&#39;une des cultures est à la bonne OD 600 le lendemain. </li></ol></li></ol> 2. récolter les cellules de levure <ol><li> Préparation pour récolter les cellules de levure. Le calendrier de cette étape est critique; étiqueter tous les tubes nécessaires et de rassembler tout l&#39;équipement et les matériaux requis en un seul endroit. Préchauffer un bain d&#39;eau à 39 ° C et préchauffer 15 deux tubes à essai ml de milieu de croissance à 28 ° C et à 60 ° C. REMARQUE: Le volume de support 15 ml de la croissance peut varier en fonction du nombre de points dans le temps les cellules doivent être récoltées. </li><li> Récolter les cellules de levure lorsqu&#39;ils atteignent une DO 600 de 0,4 à 0,7. Transfer les cellules à 4 - 6 ml stériles 50 bouteilles à bouchon à vis. Centrifuger à 7500 xg dans une centrifugeuse à haute vitesse pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension les boulettes dans les médias 15 ml de croissance qui a été équilibrage à 28 ° C. Regrouper les cellules de levure dans une fiole de 250 ml stérile et pour équilibrer les ~ 5 min à la température de croissance de 28 ° C. </li><li> Après que les cellules de levure avoir équilibré à la température de croissance, ajouter immédiatement les 15 ml du milieu de croissance équilibrée à 60 ° C pour élever la température à 39 ° C (la température non permissive) et placer immédiatement la fiole dans le bain d&#39;eau à 39 ° . Assurez-vous que le milieu de culture reste dans le bain-marie de 39 ° tout au long des étapes restantes de récolte des cellules afin de se assurer que la transcription est éteint. </li><li> Récolter les cellules à différents moments après avoir placé le ballon dans le bain d&#39;eau 39 C °. Pour le premier point de temps, récolter les cellules immédiatement après plaçant le ballon à 39 ans &amp; #176; C. Récolter un 3 ml aliquote et distribuer le 3 ml en deux, 1,5 ml microtubes. Pellet les cellules pendant 10 secondes dans une mini centrifugeuse ou picofuge avec une décélération rapide et verser le surnageant. </li><li> Geler immédiatement le culot dans un bain de glace carbonique / éthanol ou dans l&#39;azote liquide. Désignez le premier point, les cellules sont récoltées à comme point de temps zéro de temps. </li><li> Expérimentalement déterminer les points dans le temps, les cellules sont récoltées à la suite d&#39;une expérience pilote, en fonction des ARNm d&#39;intérêt. Normalement, les cellules de levure récolte aux points de temps suivants: 0, 3, 6, 9, 12, 18, ​​25 et 35 min (figure 2B). Si la demi-vie de l&#39;ARNm ne peut pas être déterminée en utilisant les points de temps mentionnées ci-dessus, ajuster ces points dans le temps. Par exemple, pour ARNm avec des demi-vies courtes prévues, utiliser plus courtes fois des points, (ce est à dire, 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 et 18 min) et pour ARNm avec longues demi-vies prévues, prolonger les points de temps. </li><li> Après que les cellules sont harvested, rangez-les dans un congélateur à -80 ° C jusqu&#39;à l&#39;extraction de l&#39;ARN est réalisée. </li></ol> 3. Extraire l&#39;ARN à partir des cellules de levure <ol><li> Pour la partie d&#39;extraction d&#39;ARN du protocole, utilisez RNase techniques gratuits à prévenir la dégradation de l&#39;ARN par RNases. Préparer RNase solutions libres, la verrerie et les articles en plastique à être utilisés dans l&#39;extraction de l&#39;ARN. </li><li> Extraire l&#39;ARN à partir de cellules de levure selon des protocoles standards. Typiquement, utiliser la méthode de phénol chaud 12. En variante, en utilisant des kits qui peuvent être utilisés pour extraire l&#39;ARN à partir de cellules de levure. </li><li> Déterminer la quantité et la pureté de l&#39;ARN, habituellement par mesure de l&#39;absorbance à 260 A et 280 A de 2 ul d&#39;ARN en utilisant une Nanodrop. Déterminer la concentration de l&#39;ARN à partir de l&#39;A 260. Sur la base de la concentration, diluer l&#39;ARN à 1 ug / ul d&#39;eau traitée au DEPC à l&#39;aide. NOTE: Le rapport de la A 260 / A 280 fournit des informations sur les til pureté de l&#39;ARN. Un échantillon d&#39;ARN est pur si le rapport A 260 / A 280 est de 2,0 ± 0,1. </li></ol> 4. Analyse Northern Blot REMARQUE: Utilisez des transferts de Northern pour quantifier les niveaux d&#39;ARNm et obtenir des informations sur la taille des transcriptions. En outre, utiliser des transferts de Northern pour détecter ARNm qui produisent des isoformes multiples de la même ARNm. <ol><li> Préparation d&#39;un gel d&#39;agarose-formaldéhyde à 1,0%. Exécutez des quantités égales de l&#39;ARN de l&#39;échantillon sur le gel de formaldéhyde agarose par électrophorèse selon des protocoles standard 12. Exécuter une échelle d&#39;ARN à côté des échantillons d&#39;ARN et l&#39;utiliser pour déterminer la taille de l&#39;ARN qui sont détectés sur le transfert de Northern. Avant de transférer l&#39;ARN séparé sur gel d&#39;agarose-formaldéhyde à une membrane, couper la voie à l&#39;échelle de l&#39;ARN à partir du gel et de visualiser en utilisant du bromure d&#39;éthidium. NOTE: En variante, l&#39;ensemble du gel peut être coloré avec du bromure d&#39;éthidium avant le transfert de l&#39;ARN. </li><li> Unéchantillons près la ARN ont migré vers une distance appropriée sur le gel, transférer l&#39;ARN à une membrane en utilisant des techniques gratuits RNase. Utilisez l&#39;une des plusieurs protocoles disponibles pour transférer ARN aux membranes 12-13. Pour transférer l&#39;ARN à une membrane, la membrane à couper à peu près la même taille que le gel. Transfert de l&#39;ARN selon des protocoles standards 12. </li><li> UV réticuler les ARN sur la membrane en utilisant un agent de réticulation aux UV suivant les instructions du fabricant. Sinon, faire cuire la membrane dans un four réglé à 80 ° C pendant 1 heure. Stocker la membrane à -20 ° C dans un sac plastique indéfiniment jusqu&#39;à ce qu&#39;elle soit hybridée à des sondes spécifiques. NOTE: La membrane sèche peut aussi être stockée à température ambiante entre papiers filtres. </li></ol> 5. hybrident sondes complémentaires à l&#39;ARN d&#39;intérêt à la membrane REMARQUE: Un moyen de détecter l&#39;ARNm de la membrane est d&#39;hybrider des sondes d&#39;ADN marquées de 32 p. ATTENTION: Researchers travaillant avec 32 P ont besoin d&#39;utiliser des procédures de protection pour éviter la contamination. Suivez les directives institutionnelles sur l&#39;utilisation de matières radioactives. <ol><li> Préparation de la sonde d&#39;ADN par marquage de 25 à 50 ng de l&#39;ADN à hybrider à la membrane selon des protocoles standards 12. Générer le fragment d&#39;ADN par PCR ou digestion du plasmide. Déterminer l&#39;activité spécifique de la sonde d&#39;ADN en comptant 1 ul de la sonde d&#39;ADN radiomarquée après les nucleotides non incorporés sont éliminés 12. </li><li> Préchauffer le tampon de préhybridation / hybridation à 42 ° C. Utilisation ~ 10 ml du tampon de préhybridation / hybridation par 100 cm 2 de la membrane 12. </li><li> Hybrider 1-5 x 10 6 cpm de sonde d&#39;ADN radiomarquée par ml de tampon d&#39;hybridation à la membrane O / N dans un four d&#39;hybridation pour détecter l&#39;ARNm d&#39;intérêt 12. Assurez-vous que lors de l&#39;hybridation de la rotation du four est de l&#39;hybridation dans une direction quiprovoque la totalité de la membrane à être exposée à la solution d&#39;hybridation, pour assurer une hybridation appropriée. </li><li> Laver la membrane deux fois à température ambiante pendant 15 min avec 50 ml de SSPE 2x et une heure à 65 ° C avec 50 ml de SSPE 2x / 2% de SDS pendant 15 minutes 12. Enveloppez la membrane dans une pellicule plastique pour se assurer qu&#39;il ne se dessèche pas ou contaminer l&#39;écran de phosphore. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un compteur Geiger, estimer l&#39;intensité de la radioactivité sur la membrane. NOTE: Cette estimation se assure que la membrane est exposée à l&#39;écran de phosphore pour le laps de temps approprié. Utilisez des temps plus longs d&#39;exposition pour les membranes avec de faibles quantités de radioactivité. </li><li> Pour des transferts de Northern, utiliser un contrôle de chargement pour confirmer que des quantités égales d&#39;ARN sont chargées sur chaque spot. Pour ce faire, enlever la membrane et reprobe avec un ARN qui ne est pas affectée par le processus en cours d&#39;examen. Bande de la membrane en la plaçant dans un plateau en verre contenant 200 ml de solution d&#39;extraction bouillante (0,1% SDS / 0,01 XSSC) pendant 2 min. Verser la solution de décapage et répétez la procédure cinq fois 12. NOTE:. Un exemple d&#39;un ARN utilisé comme témoin de chargement est SCR1 SCR1 est une transcription ARN polymérase III qui est stable et abondante SCR1 ARN abondance ne devrait pas changer de façon significative pendant de courtes périodes de l&#39;ARN polymérase II d&#39;inhibition.. </li></ol> 6. Quantifier l&#39;ARN qui est lié à la membrane NOTE: Pour quantifier la quantité de radioactivité sur la membrane, la membrane exposer à un écran de phosphore. Après le temps d&#39;exposition approprié, balayer l&#39;écran de phosphore en utilisant un phosphorimager. <ol><li> Balayez l&#39;écran phosphore en suivant les instructions fournies par le fabricant de la phosphorimager. </li><li> Quantifier l&#39;ARNm à chaque point de temps. Quantifier les niveaux d&#39;ARNm en utilisant le logiciel ImageQuant ou logiciel associé. Normaliser l&#39;ARNm à chaque point de contrôle de chargement de temps. Si SCR1 a été utilisé comme le chargementle contrôle, à normaliser les northerns demi-vie à SCR1. </li><li> La demi-vie de l&#39;ARNm est calculé en divisant la quantité d&#39;ARNm restant à chaque point de temps par la quantité d&#39;ARNm présente au point de temps 0 (le point de temps initial). Graphiquement la ARNm pour cent restants en fonction du temps sur un terrain semi-logarithmique (figure 2C). Calculer la demi-vie d&#39;ARNm par l&#39;équation suivante: t 1/2 = -0,693 / k (négative 0,693) </li><li> k est la pente de la droite de meilleur ajustement et t 1/2 est la demi-vie de l&#39;ARNm. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interest.

L&#39;inhibition de la synthèse de l&#39;ARNm et de surveillance chiffre d&#39;affaires de l&#39;ARNm en l&#39;absence de nouvelle synthèse est une méthode qui est fréquemment utilisé pour mesurer ARNm taux de décroissance. Dans S. cerevisiae, la mesure du taux de décroissance de l&#39;ARNm en empêchant la transcription de l&#39;allèle sensible à l&#39;aide de l&#39;ARN polymérase II de la température est une des méthodes les plus fréquemment utilisés. Ce procédé inhibe spécifiquement l&#39;AR...

La transcription et la décadence de l&#39;ARNm spécifiques sont déterminants cruciaux de l&#39;expression des gènes. Le taux de la synthèse et la décomposition des ARNm spécifiques détermine le niveau de cette ARNm particulier l&#39;état d&#39;équilibre. Les niveaux de l&#39;état d&#39;équilibre des ARNm régissent l&#39;abondance d&#39;ARNm et de déterminer combien de chaque ARNm est disponible pour la synthèse des protéines. Mesures de ARNm demi-vies sont largement utilisés pour déterminer le taux d&#39;ARNm de décroissance. ARNm spécifique désintégration à des vitesses différentes qui sont liées aux caractéristiques de l&#39;ARNm, la fonction de la protéine codée par l&#39;ARNm et les conditions environnementales. Selon la technique utilisée pour déterminer les taux de NMD, les mesures de taux désintégration peuvent être déterminés soit globalement ou pour transcriptions des entretiens individuels. Dans la levure S. cerevisiae, les techniques les plus couramment utilisés pour mesurer les taux de NMD globale comprennent l&#39;utilisation d&#39;une souche de levure hébergeant l&#39;allèle sensible de l&#39;ARN polymérase II et transc chimique températureinhibiteurs riptional tels que thiolutine et 1,10-phénanthroline 1-5. Ces méthodes peuvent également être utilisés pour mesurer les taux de NMD individuelle 4. D&#39;autres méthodes peuvent également être utilisés pour mesurer les taux d&#39;ARNm de désintégration. Ces méthodes comprennent approche de l&#39;étiquetage de l&#39;état d&#39;équilibre ou de l&#39;utilisation de molécules d&#39;ARNm qui sont exprimés à partir d&#39;un promoteur régulé qui est exprimé uniquement dans certaines conditions. Chacune de ces techniques a des avantages et des limites. La technique décrite ici utilise l&#39;allèle sensible de l&#39;ARN polymérase II de la température. Cette méthode utilise S. cerevisiae comme modèle, mais peut être modifiée et utilisée dans d&#39;autres systèmes utilisant des techniques d&#39;inhibition de la transcription spécifiques 6. ARNm mesures demi-vie en utilisant l&#39;allèle sensible de l&#39;ARN polymérase II de température sont largement utilisés pour les deux mesures de l&#39;ensemble du génome et individuels de la dégradation des ARNm 4-5. Cette technique nécessite l&#39;utilisation d&#39;un spécific souche de levure qui abrite un allèle sensible de l&#39;ARN polymérase II, de rpb1-1 une température. La justification de cette technique est que l&#39;exposition de la souche de levure sensible de la température à la température non permissive inhibe la synthèse de l&#39;ARNm. Par la suite, la décomposition de l&#39;ARNm pré-existante est contrôlée à différents points de temps après la transcription a été inhibée. La disparition de l&#39;ARNm pré-existante est contrôlée par extraction de l&#39;ARN à partir des cellules de levure à différents points dans le temps après la transcription a été coupé. Les points de temps au cours de laquelle les cellules de levure sont récoltées sont prédéterminés par une expérience pilote, et dépendent des transcriptions et le système à l&#39;étude. Points de temps plus rapides sont utilisés pour les transcriptions de courte durée, tandis que les points de temps plus longues sont utilisées pour les transcriptions plus vécu. Par la suite, la décomposition de l&#39;ARNm est contrôlée soit par analyse Northern blot, la PCR quantitative ou RNAseq. Mesure de la demi-vie d&#39;ARNm en utilisant un température allèle sensible de l&#39;ARN polymérase II a ses avantages. Tout d&#39;abord, cette technique est facile et simple. Deuxièmement, une fois la souche de levure est acquis ou généré en laboratoire les ARNm mesures demi-vie peuvent être déterminées dans différentes conditions de croissance; permettant de déterminer l&#39;influence de l&#39;environnement sur la dégradation de l&#39;ARNm. Troisièmement, les taux d&#39;ARNm de désintégration peuvent être surveillés échelle du génome. L&#39;utilisation d&#39;autres techniques d&#39;inhibition de la transcription a aussi des avantages et des inconvénients. Par exemple, l&#39;utilisation d&#39;un promoteur inductible nécessite le sous-clonage pour générer un ARNm qui est sous le contrôle du promoteur régulé. Thiolutine ne est pas facilement disponible et est coûteux lorsqu&#39;ils sont disponibles. En outre, le mode d&#39;action de thiolutine ne est pas complètement comprise et il a été rapporté pour affecter d&#39;autres processus cellulaires, y compris l&#39;inhibition de la dégradation des ARNm 7. Alternativement, la 1,10-phénanthroline, est plus facilement disponible. En outre, toutes les techniques utilisées pour inhiber la transcription peut perturb fonction cellulaire et peut affecter différents ARNm de façons distinctes. Un enquêteur doit déterminer la méthode la plus appropriée à utiliser dans leurs conditions expérimentales pour obtenir des résultats les plus fiables. Pour déterminer quelle méthode est la plus appropriée pour leur application, un chercheur doit identifier les transcriptions et la fonction des protéines codées par les transcriptions objet d&#39;une enquête. Les mesures les plus fiables des taux d&#39;ARNm de décroissance sont ceux qui sont déterminés en utilisant plusieurs techniques et de montrer le même taux de décroissance. Aucune technique ne est toujours la meilleure, et la technique la plus appropriée dépend de la situation spécifique. De nombreuses études dans S. cerevisiae ont mesuré les taux de NMD dans diverses conditions et origines génétiques. Les conditions que les taux d&#39;ARNm de désintégration sont mesurées en dépendent l&#39;expérience spécifique à l&#39;étude. Mesure ARNm taux de décomposition dans des environnements cellulaires différents détermine si les conditions étanta examiné préférentiellement affecter les taux d&#39;ARNm spécifiques de désintégration. Les taux d&#39;ARNm de désintégration peuvent également varier en fonction de la souche de levure utilisée. Par exemple, ARNm taux de décomposition peuvent être déterminées dans les cellules de levure de type sauvage et des cellules de levure avec une voie non fonctionnel dégradation de l&#39;ARNm de nonsense-mediated (NMD). Cette voie de dégradation de l&#39;ARNm se trouve dans tous les organismes eucaryotes qui ont été examinés à ce jour et il déclenche la dégradation des ARNm qui se terminent prématurément traduction 8. NMD a été initialement identifiée comme une voie qui dégrade ARNm avec des codons de terminaison prématurés ou codons non-sens, mais est maintenant reconnue comme une voie qui réglemente également l&#39;expression de non-nonsense contenant ARNm naturelles. ARNm qui sont des cibles de la voie sont rapidement dégradées dans les cellules de levure avec une voie de NMD fonctionnel et stabilisées dans des cellules de levure avec une voie de NMD non fonctionnel. Ainsi, les demi-vies d&#39;ARNm qui sont des cibles directes de cette voie sont plus courts en levure de type sauvage cells rapport aux cellules de levure avec une voie NMD non fonctionnel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1077">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:272px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:479px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Speed Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Genescreen Plus membrane</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>50-905-0169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hybridization Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>95-0030-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphor screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9564-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Typhoon phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29004080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV cross-linker</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>80-6222-31</td>
			<td>Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80&#176; for 1 hour</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:272px;">NorthernMax prehybridization/hybridization buffer&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM8677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation</td>
			<td></td>
			<td>Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mrna decay rates in saccharomyces cerevisiae using rpb1-1 strains

les niveaux de l&#39;état d&#39;équilibre ARNm varient en fonction des conditions environnementales. La régulation des niveaux d&#39;accumulation de l&#39;état d&#39;équilibre de l&#39;ARNm de sorte que la quantité correcte de protéine est synthétisée dans des conditions de croissance spécifiques de la cellule. Une approche pour mesurer ARNm taux de décroissance est l&#39;inhibition de la transcription et de suivi suite à la disparition de l&#39;ARNm déjà présent. Le taux de dégradation de l&#39;ARNm peut alors être quantifiée, et une demi-vie précise peut être déterminée en utilisant plusieurs techniques. Dans S. cerevisiae, des protocoles permettant de mesurer la demi-vie de l&#39;ARNm ont été développés et comprennent l&#39;inhibition de la transcription de l&#39;ARNm en utilisant des souches abritant un allele sensible de l&#39;ARN polymerase II, de rpb1-1 température. D&#39;autres techniques de mesure de demi-vie de l&#39;ARNm comprennent des inhibiteurs de la transcription de la transcription tels que thiolutine ou 1,10-phénanthroline, ou en variante, en utilisant des inhibiteurs de ARNm qui sont sous le contrôle d&#39;un promoteur régulabletel que le promoteur inductible par le galactose et le système TET-off. Ici, nous décrivons la mesure de S. taux de décroissance cerevisiae ARNm en utilisant l&#39;allèle sensible de l&#39;ARN polymérase II de température. Cette technique peut être utilisée pour mesurer les taux d&#39;ARNm des ARNm individuels ou l&#39;ensemble du génome désintégration.

<html> La capacité de ce protocole pour mesurer avec précision ARNm taux de décroissance dépend de l&#39;inhibition de la transcription, la récolte de cellules de levure au niveau des points de temps appropriés, et l&#39;utilisation des techniques sans RNase lors de l&#39;extraction de l&#39;ARN et transfert de Northern. Palpage de deux ARNm de commande connus pour être instables et stables, respectivement, fournit l&#39;assurance que l&#39;expérience a fonctionné. Par exemple, ceci peut être accompli par sonda...

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Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Le niveau de l&#39;état d&#39;équilibre des ARNm spécifiques est déterminée par le taux de synthèse et de la décomposition de l&#39;ARNm. Taux de dégradation de l&#39;ARNm pangénomiques ou les taux d&#39;ARNm spécifiques de désintégration peuvent être mesurés en déterminant ARNm demi-vies. Ce protocole met l&#39;accent sur ​​la mesure du taux d&#39;ARNm de désintégration dans Saccharomyces cerevisiae.

Mesure de la dégradation de l&#39;ARNm Tarifs en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Utilisation<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Les souches

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

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Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Unit 1

Translation: RNA to Protein

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12.4K vues.  Baylor University.  Le niveau de l'état d'équilibre des ARNm spécifiques est déterminée par le taux de synthèse et de la décomposition de l'ARNm. Taux de dégradation de l'ARNm pangénomiques ou les taux d'ARNm spécifiques de désintégration peuvent être mesurés en déterminant ARNm demi-vies. Ce protocole met l'accent sur ​​la mesure du taux d'ARNm de désintégration dans Saccharomyces cerevisiae. 

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissection de Saccharomyces cerevisiae Asques

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

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Biologie

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoprotéomique quantitatives en acide gras Stimulé Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Analyse de Microarray pour Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un test microscopie de fluorescence pour Mitophagy surveillance dans la levure<em&gt; Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Les analyses couplées pour la surveillance protéines repliement<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Purification de la fibrose kystique régulateur de la conductance transmembranaire protéine exprimée dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR surveillé Redox titrage des cofacteurs de<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Identification rapide des interactions chimiques génétiques dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Réalisé Evolution Méthode<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Library Création et dépistage

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...