Research in the author&#8217;s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board&#8217;s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.

1. צמיחה של תאי שמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את זני שמרים המתאימים כדי להיות מנוצלת למדידות קצב דעיכת mRNA. לעכב שעתוק באמצעות אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II, להשתמש זני שמרי מחסה המוטציה rpb1-1 1. להשיג שמרי זן זה ממעבדה שיש אחד כבר, או ליצור אותו במעבדה תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית אם נדרש רקע גנטי ספציפי 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות טכניקה סטרילית, להכין שמרי מדיה באמצעות נהלים סטנדרטיים 10. אם לא נדרשת בחירה, להכין מדיה עשירה כגון YPD. לחלופין, להכין תקשורת סלקטיבית אם תאי השמרים הופכים עם פלסמידים ובחירה נדרש. החיטוי התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תאי שמרים על 28 מעלות צלזיוס, שהיא הטמפרטורה מתירנית לזן שמרים זה. לעשות זאת בשני שלבים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לO הראשון / N, לגדול תאי השמרים ב 5 מיליליטר של תקשורת צמיחה לרוויה.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת O השני / N בסופו של היום השני. לO השני / N, לחסן כמויות שונות של תאי שמרים מO ​​הראשון / N ל100-150 מיליליטר של תקשורת צמיחה (הנעה בין 100 μl למיליליטר 1, 2 מיליליטר או יותר, תלוי מתי תאי השמרים צריכים להיות שנקטפו ביום שלמחרת). לעשות את הצעד הזה כדי להבטיח שאחד מהתרבויות הוא בOD הנכון 600 היום הבא. </li></ol></li></ol> 2. קציר תאי השמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לקצור את תאי שמרים. העיתוי לצעד זה הוא קריטי; תווית כל הצינורות הנדרשים ולאסוף את כל הציוד וחומרים הדרושים במקום אחד. מחממים אמבט מים ל -39 מעלות צלזיוס ומחמם שתי 15 מיליליטר מבחנות של תקשורת הצמיחה על 28 מעלות צלזיוס ועל 60 מעלות צלזיוס. הערה: 15 מיליליטר צמיחת תקשורת הנפח יכול להיות מגוון בהתאם למספר נקודות זמן התאים להיות שנקטפו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את תאי שמרים, כאשר הם מגיעים OD 600 של 0.4 ל -0.7. Transfאה התאים - 4 מיליליטר 6 סטרילי 50 בורג בקבוקי כובע. צנטריפוגה ב 7500 XG בצנטריפוגה במהירות גבוהה במשך 5 דקות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend את כדורים ב -15 מיליליטר תקשורת הצמיחה שequilibrating על 28 מעלות צלזיוס. בריכת תאי שמרים בבקבוק 250 מיליליטר סטרילי אחד ולאזן אותם ל~ 5 דקות בטמפרטורת הגידול של 28 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שמרי התאים equilibrated בטמפרטורת הצמיחה, מייד להוסיף 15 מיליליטר של תקשורת צמיחת equilibrated ב 60 ° C כדי להעלות את הטמפרטורה ל -39 מעלות צלזיוס (טמפרטורת nonpermissive) ומקום באופן מיידי את הבקבוק באמבט המים C ° 39 . ודא שמדיום התרבות נשאר באמבט המים C ° 39 בכל שלבי איסוף תאים שנותרו על מנת להבטיח כי השעתוק כבוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים בזמנים שונים לאחר הצבת הבקבוק באמבט המים C ° 39. לנקודת הזמן הראשונה, לקצור את התאים מייד לאחר הצבת הבקבוק ב 39 &amp; #176; C. קציר aliquot 3 מ&quot;ל ולהפיץ 3 מיליליטר לשני, 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge. גלולה התאים במשך 10 שניות בצנטריפוגה מיני או picofuge עם האטה מהירה ולשפוך את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להקפיא את גלולה באמבט קרח / אתנול יבש או בחנקן נוזלי. לייעד את נקודת הזמן הראשונה התאים נקצרים כבנקודת זמן אפס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסוי לקבוע את נקודות זמן התאים נקצרים בלאחריו על ידי ניסוי פיילוט, בהתאם לmRNAs של עניין. בדרך כלל, תאי שמרי קציר בנקודות הזמן הבאים: 0, 3, 6, 9, 12, 18, ​​25 ו -35 דק &#39;(איור 2). אם זמן מחצית החיים mRNA לא ניתן לקבוע באמצעות נקודות הזמן שצוינו לעיל, להתאים נקודות הזמן הללו. לדוגמא, לmRNAs עם זמן מחצית חיים קצרים צפוי, להשתמש בנקודתי זמנים קצרות יותר, (כלומר, 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 ו -18 דקות) ולmRNAs עם זמן מחצית חיים ארוכים צפוי, להאריך נקודות הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התאים חהrvested, לאחסן אותם במקפיא -80 מעלות צלזיוס עד מיצוי RNA מתבצע. </li></ol> 3. RNA חלץ מתאי השמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור חלק מיצוי RNA של הפרוטוקול, להשתמש RNase טכניקות חופשיות כדי למנוע השפלה של RNA על ידי RNases. הכן RNase פתרונות חופשיים, כלי זכוכית וכלי פלסטיק לשימוש במיצוי של RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את RNA מתאי השמרים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. בדרך כלל, משתמש בשיטת פנול החמה 12. לחלופין, להשתמש בערכות שיכולים לשמש כדי לחלץ RNA מתאי שמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הכמות וטוהר של RNA, בדרך כלל על ידי מדידת הספיגה ב 260 ושל 280 2 μl של RNA באמצעות Nanodrop. קבע את הריכוז של RNA מ260. בהתבסס על הריכוז, לדלל את RNA עד 1 מיקרוגרם / μl שימוש במים שטופלו DEPC. הערה: היחס של 260/280 מספק מידע על tהוא טוהר RNA. מדגם RNA הוא טהור אם היחס 260/280 הוא 2.0 ± 0.1. </li></ol> 4. צפון כתם ניתוח הערה: השתמש בכתמים הצפוניים לכמת רמות ה- mRNA ולקבל מידע על הגודל של התמלילים. בנוסף, שימוש בכתמים צפוני כדי לזהות mRNAs המייצרים isoforms מרובה של אותו mRNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1.0% ג&#39;ל agarose-פורמלדהיד. הפעל כמויות שווה של RNA המדגם על הג&#39;ל פורמלדהיד agarose ידי אלקטרופורזה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 12. הפעל סולם RNA לצד דגימות RNA ולהשתמש בו כדי לקבוע את הגדלים של RNA שאותרו על הכתם הצפוני. לפני העברת RNA מופרד על הג&#39;ל פורמלדהיד agarose לממברנה, לחתוך את הנתיב עם סולם RNA מן הג&#39;ל ולדמיין באמצעות רומיד ethidium. הערה: לחלופין, את כל הג&#39;ל ניתן מוכתם ברומיד ethidium לפני העברת RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">דגימות חרו RNA היגרו למרחק מתאים על הג&#39;ל, להעביר את RNA לממברנה באמצעות RNase טכניקות חופשיות. השתמש באחת מכמה פרוטוקולים זמינים להעברת RNA לממברנות 12-13. כדי להעביר את RNA לממברנה, לחתוך את הקרום לבערך באותו גודל כמו ג&#39;ל. העבר את RNA על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> UV קשר צולב RNA לממברנה באמצעות crosslinker UV הבא הוראות היצרן. לחלופין, לאפות את הקרום בתנור בחום עד 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. אחסן את הקרום ב -20 ° C בשקית ניילון ללא הגבלת זמן עד שהוא הכלאה לבדיקות ספציפיות. הערה: הקרום היבש גם יכול להיות מאוחסן על RT בין ניירות לסנן. </li></ol> 5. בדיקות להכליא משלים לRNA של ריבית לממברנה הערה: דרך אחת לגלות mRNA על הקרום היא להכליא בדיקות DNA שכותרתו 32 P. זהירות: Researchers עבודה עם 32 P צריך להשתמש נהלי הגנה על מנת למנוע זיהום. פעל לפי הנחיות מוסדיות על שימוש בחומר רדיואקטיבי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הבדיקה DNA על ידי תיוג 25-50 ng של DNA להיות הכלאה הקרום על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 12. צור קטע DNA על ידי PCR או עיכול פלסמיד. לקבוע את הפעילות הספציפית של חללית DNA על ידי ספירת 1 μl של חללית DNA radiolabelled לאחר נוקלאוטידים מאוגדים יוסרו 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר prehybridization / הכלאה מחממים על 42 מעלות צלזיוס. השתמש ~ 10 מיליליטר של חיץ prehybridization / הכלאה לכל 100 סנטימטר 2 של הקרום 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכליא 1-5 x 10 6 עותקים לדקה של הבדיקה DNA radiolabeled לכל מיליליטר של חיץ הכלאה לO הקרום / N בתנור הכלאה כדי לזהות את ה- mRNA של עניין 12. ודא כי בהכלאת סיבוב תנור ההכלאה הוא בכיוון זהגורם כל הקרום להיחשף לפתרון ההכלאה, על מנת להבטיח הכלאה נכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה פעמיים ב RT במשך 15 דקות עם 50 מיליליטר של 2x SSPE ופעם אחת על 65 מעלות צלזיוס עם 50 מיליליטר של 2x SSPE / 2% SDS במשך 15 דקות 12. עטוף את הקרום בניילון הנצמד, כדי להבטיח שזה לא יתייבש או לזהם את המסך זרחני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במונה גייגר, להעריך את עוצמת הקרינה רדיואקטיבית על הממברנה. הערה: הערכה זו מבטיחה כי הקרום חשוף למסך זרחני לכמות המתאימה של זמן. השתמש בזמני חשיפה ארוכים יותר לממברנות עם כמויות נמוכות של רדיואקטיביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכתמים הצפוניים, להשתמש שליטת טעינה כדי לוודא שכמויות שווה של RNA מועמסות על כל נקודה. כדי לעשות זאת, להפשיט את הקרום וreprobe זה עם RNA שאינו מושפע מנבחנים התהליך. להפשיט את הקרום על ידי הצבתו במגש זכוכית המכיל 200 מיליליטר של רותח (0.1% הפשטת פתרון SDS / 0.01 XSSC) למשך 2 דקות. יוצקים את פתרון הפשטה ולחזור על התהליך חמש פעמים 12. הערה:. דוגמא של RNA המשמש כביקורת טעינה היא SCR1 SCR1 הוא תעתיקי הרנ&quot;א פולימראז III שהוא יציב ושופע שפע RNA SCR1 לא צריך לשנות באופן משמעותי בתקופות קצרות של RNA פולימראז II עיכוב.. </li></ol> 6. לכמת את RNA, כי הוא חייב ממברנה הערה: כדי לכמת את כמות הרדיואקטיביות על קרום, לחשוף את הקרום למסך זרחני. לאחר זמן החשיפה המתאים, לסרוק את המסך זרחני באמצעות phosphorimager. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את המסך זרחני באמצעות ההוראות הניתנות על ידי היצרן של phosphorimager. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את ה- mRNA בכל נקודת זמן. לכמת רמות ה- mRNA באמצעות תוכנת ImageQuant או תוכנה קשורה. לנרמל את ה- mRNA בכל נקודה לטעינה מלאה זמן. אם SCR1 שימש הטעינהשליטה, לנרמל את northerns מחצית החיים לSCR1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן מחצית החיים של mRNA מחושבים על ידי חלוקת הסך של mRNA שנותר בכל נקודה בסך של mRNA זמן הווה בנקודת זמן 0 (נקודת הזמן הראשונית). גרף mRNA האחוזים הנותר לעומת זמן על מגרש semilogarithmic (איור 2 ג). חישוב זמן מחצית חיים mRNA על ידי המשוואה הבאה: t 1/2 = -.693 / k (שלילי .693) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> k הוא השיפוע של הקו בכושר הטוב ביותר ולא 1/2 הוא זמן מחצית החיים mRNA. </li></ol>

<ol>
	<li>Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+RNA+polymerase+conditional+mutant+that+rapidly+ceases+mRNA+synthesis.">Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis.</a> Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).</li><li>Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+mRNA+stability+and+length+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).</li><li>Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+of+thiolutin,+an+inhibitor+of+macromolecular+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 .</li><li>Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Comparison+of+stable+and+unstable+mRNAs+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 .</li><li>Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Analysis+of+mRNA+Stability+Using+Transcription+Inhibitors+and+Microarrays+Reveals+Postranscriptional+Control+of+Ribosome+Biogenesis+Factors.">Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors.</a> Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).</li><li>Tani, H., Akimitsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+technology+for+determining+RNA+stability+in+mammalian+cells.">Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells.</a> RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).</li><li>Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+inhibitor+thiolutin+blocks+mRNA+degradation+in+yeast.">The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast.</a> Yeast. 25, 85-92 (2008).</li><li>Kervestin, S., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMD:+a+multifaceted+response+to+premature+translational+termination.">NMD: a multifaceted response to premature translational termination.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).</li><li>Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Polymerase+II+subunit+composition,+stoichiometry+and+phosphorylation.">RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation.</a> Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).</li><li>Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (1998).</li><li>Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+affects+relative+nonsense+mRNA+accumulation+in+wild-type+and+upf+mutant+yeast+strains+Current+Genetics).">Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics).</a> 43, 171-177 (2003).</li><li>Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Nonsense-Mediated+mRNA+Decay+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae.</a> Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).</li><li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+measuring+mRNA+Decay+Rate+in+Saccharomycescerevisiae.">Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

עיכוב של סינתזת mRNA וניטור מחזור mRNA בהעדר הסינתזה החדשה הוא שיטה המשמשת לעתים קרובות כדי למדוד שיעורי ריקבון mRNA. בS. cerevisiae, מדידת שיעורי ריקבון mRNA על ידי עיכוב שעתוק באמצעות אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II הוא אחת מהשיטות הנפוצות ביותר בשימוש. שיטה זו במיוחד מע?...

השעתוק והריקבון של mRNA הספציפי הם גורמים מכריעים של ביטוי גנים. שיעור הסינתזה והריקבון של mRNAs הספציפי קובע את הרמה יציבה של mRNA המסוים. רמות המצב היציב של mRNAs לשלוט בשפע של mRNAs ולקבוע כמה כל mRNA זמין עבור סינתזה של חלבונים. מדידות של מחצית חיים mRNA נמצאות בשימוש נרחב על מנת לקבוע את קצב הדעיכה של mRNAs. ריקבון mRNAs ספציפי בשיעורים שונים הקשורות לתכונות של mRNA, הפונקציה של החלבון מקודד על ידי ה- mRNA והתנאים הסביבתיים. בהתאם לטכניקה מנוצלת כדי לקבוע שיעורי ריקבון mRNA, ניתן לקבוע מדידות קצב דעיכה אם באופן גלובלי או לתמלילים בודדים. בשמרים ס cerevisiae, הטכניקות ההנפוצות ביותר המשמשות למדידת שיעורי ריקבון mRNA הגלובלי כולל ניצול זן שמרי מחסה אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II וtransc הכימימעכבי riptional כגון thiolutin ו1,10-phenanthroline 1-5. יכולים גם להיות מנוצלים שיטות אלו למדידת שיעורי ריקבון mRNA פרט 4. יכולים גם להיות מנוצלת שיטות אחרות למדידת שיעורי ריקבון mRNA. שיטות אלה גישה לתיוג מצב יציב או ניצול של מולקולות mRNA שבאות לידי ביטוי מאמרגן בפיקוח המתבטא רק בתנאים בחרו לכלול. לכל אחת מהטכניקות הללו יתרונות ומגבלות מסוימים. הטכניקה המתוארת כאן מנצלת את האלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II. שיטה זו משתמשת S. cerevisiae כמודל, אבל יכול שונו ומנוצל במערכות אחרות תוך שימוש בטכניקות עיכוב תעתיק ספציפי 6. מדידות זמן מחצית החיים mRNA באמצעות אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II נמצאות בשימוש נרחב עבור שני מדידות הגנום ובודדים של mRNA ריקבון 4-5. טכניקה זו דורשת שימוש בspecifזן שמרי ic שמטפח אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II, rpb1-1 1. הרציונל לטכניקה זו הוא שחשיפה של טמפרטורת זן שמרים רגיש לטמפרטורת nonpermissive מעכבת סינתזת mRNA. בהמשך לכך, דעיכה של mRNA preexisting מנוטרת בנקודות זמן שונות לאחר השעתוק כבר עכבות. היעלמותו של mRNA preexisting מנוטרת על ידי חילוץ RNA מתאי השמרים בנקודות זמן שונה לאחר השעתוק בוטל. נקודות הזמן שבו תאי השמרים נקצרים קבועות מראש על ידי ניסוי פיילוט, ותלויות בפרוטוקולים ובמערכת נחקרות. נקודות זמן מהירות יותר משמשות לתמלילים קצרים ימים, ואילו נקודות זמן ארוכות יותר משמשות לתמלילים כבר חיו. לאחר מכן, הריקבון של mRNA מנוטר על ידי שני ניתוח הכתם הצפוני, PCR כמותי או RNAseq. מדידה של זמן מחצית חיים mRNA באמצעות teאלל רגיש mperature של RNA פולימראז II יש את היתרונות שלה. ראשית, טכניקה זו היא קלה וישר קדימה. שנית, ברגע שזן השמרים נרכש או שנוצר במעבדה ניתן לקבוע מדידות זמן מחצית החיים mRNA בתנאי גידול שונים; מאפשר קביעת ההשפעה סביבתית על ריקבון mRNA. שלישית, ניתן לנטר שיעורי ריקבון mRNA הגנום. שימוש בטכניקות עיכוב שעתוק אחרים יש גם יתרונות ומגבלות. לדוגמא, שימוש במקדם מושרה דורש subcloning לייצר mRNA שנמצא תחת השליטה של ​​האמרגן המוסדר. Thiolutin הוא לא זמין ויקר כאשר זמין. בנוסף, המצב של thiolutin פעולה אינו מובן לחלוטין וזה כבר דווח להשפיע תהליכים תאיים אחרים, כולל עיכוב ריקבון mRNA 7. לחלופין, 1,10-phenanthroline, הוא יותר זמין. יתר על כן, כל הטכניקות המשמשים ללעכב שעתוק יכול חצוףUrb פונקציה סלולרית ויכול להשפיע על mRNAs שונה בדרכים שונות. חוקר צריך לקבוע את השיטה המתאימה ביותר לשימוש בתנאי הניסוי שלהם כדי להשיג את התוצאות הכי אמינות. כדי לקבוע איזו שיטה המתאימה ביותר ליישום שלהם, חוקר צריך לזהות את התמלילים ותפקוד של החלבונים המקודדים על ידי התמלילים נחקרים. מדידות קצב דעיכת mRNA אמינות ביותר הן אלה הנקבעים תוך שימוש בטכניקות מרובות ולהראות את אותו שיעור הריקבון. אין טכניקה אחת היא תמיד הטובה ביותר, ואת הטכניקה המתאימה ביותר תלויה במצב הספציפי. מחקרים רבים בS. cerevisiae מדד שיעורי ריקבון mRNA בתנאים שונים ורקע גנטי. התנאים ששיעורי ריקבון mRNA נמדדים בתלויים בניסוי הספציפי הנחקר. מדידת שיעורי ריקבון mRNA בסביבות סלולריות שונות קובעת אם התנאים שבדקתי מעדיף להשפיע על שיעורי הריקבון של mRNAs הספציפי. שיעורי הריקבון של mRNAs יכולים גם משתנים בהתאם לזן השמרים בשימוש. לדוגמא, ניתן לקבוע שיעורי ריקבון mRNA בתאי שמרים wild-type ותאי שמרים עם מסלול nonfunctional השפלה mRNA בתיווך שטויות (NMD). מסלול השפלה mRNA זה נמצא בכל יצורי אוקריוטים שנבדקו עד כה והיא מפעילה את ההשפלה של mRNAs שבטרם עת לסיים תרגום 8. NMD תחילה זוהה כמסלול שמבזה mRNAs עם קודונים סיום מוקדמים או קודונים שטויות, אבל מוכר כיום כמסלול שגם מסדיר את הביטוי של אי-שטויות מכילות mRNAs הטבעי. mRNAs שהם מטרות של המסלול מפורק במהירות בתאי שמרים עם מסלול NMD פונקציונלי והתייצב בתאי שמרים עם מסלול NMD nonfunctional. כך, זמן מחצית החיים של mRNAs שהם מטרות ישירות של מסלול זה הם קצרים יותר בשמרים cel wild-typels בהשוואה לתאי שמרים עם מסלול NMD nonfunctional.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1077">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:272px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:479px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Speed Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Genescreen Plus membrane</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>50-905-0169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hybridization Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>95-0030-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphor screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9564-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Typhoon phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29004080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV cross-linker</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>80-6222-31</td>
			<td>Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80&#176; for 1 hour</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:272px;">NorthernMax prehybridization/hybridization buffer&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM8677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation</td>
			<td></td>
			<td>Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mrna decay rates in saccharomyces cerevisiae using rpb1-1 strains

רמות מצב יציב mRNA משתנות בהתאם לתנאי סביבה. הסדרת רמות הצטברות מצב היציב של mRNA מבטיחה כי הסכום הנכון של חלבון מסונתז עבור תנאי הגידול הספציפיים של התא. גישה אחת למדידת שיעורי ריקבון mRNA היא עיכוב שעתוק ולאחר מכן ניטור היעלמותו של mRNA שכבר קיים. קצב דעיכת mRNA לאחר מכן ניתן לכמת, ומחצית חיים מדויקים ניתן לקבוע תוך שימוש במספר טכניקות. בS. cerevisiae, פרוטוקולים המודדים mRNA מחצית חיים פותחו וכוללים עיכוב שעתוק של mRNA באמצעות זנים כי נמל אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II, rpb1-1. טכניקות אחרות למדידת mRNA מחצית חיים כוללים עיכוב שעתוק עם מעכבי תעתיק כגון thiolutin או 1,10-phenanthroline, או לחלופין, על ידי ניצול mRNAs שנמצאות תחת השליטה של ​​אמרגן ויסותכמו-off TET מערכת אמרגן והעין מתנהלת גלקטוז. כאן אנו מתארים מדידה של ס &#39; שיעורי ריקבון cerevisiae mRNA באמצעות אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II. טכניקה זו יכולה לשמש כדי למדוד את שיעורי ריקבון mRNA של mRNAs או הגנום האישי.

<html> היכולת של פרוטוקול זה כדי למדוד במדויק שיעורי ריקבון mRNA תלוי בעיכוב של שעתוק, הקצירה של תאי שמרים בנקודות הזמן המתאימות, ושימוש בטכניקות חופשיות RNase תוך חילוץ RNA וסופגים צפוני. חיטוט לשני mRNAs השליטה ידוע להיות לא יציב ויציב, בהתאמה, מספק ביטחון כי הניסוי עבד. לדוגמא,...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains at JoVE.com

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

רמת המצב היציב של mRNAs הספציפי נקבעת על ידי קצב הסינתזה והריקבון של mRNA. שיעורי השפלה mRNA הגנום או שיעורי הריקבון של mRNAs הספציפי יכולים להימדד על ידי קביעת זמן מחצית חיים mRNA. פרוטוקול זה מתמקד במדידה של שיעורי ריקבון mRNA בSaccharomyces cerevisiae.

מדידת שיעורי ריקבון mRNA ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; שימוש ב<em&gt; Rpb1-1</em&gt; זנים

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

measurement-mrna-decay-rates-saccharomyces-cerevisiae-using-rpb1-1

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

12.4K Views.  Baylor University.  רמת המצב היציב של mRNAs הספציפי נקבעת על ידי קצב הסינתזה והריקבון של mRNA. שיעורי השפלה mRNA הגנום או שיעורי הריקבון של mRNAs הספציפי יכולים להימדד על ידי קביעת זמן מחצית חיים mRNA. פרוטוקול זה מתמקד במדידה של שיעורי ריקבון mRNA בSaccharomyces cerevisiae. 

Video: Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissection של Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

טיהור של חלבון הטרנסממברני מוליכות רגולטור סיסטיק פיברוזיס שבא לידי ביטוי ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR פיקוח חיזור טיטרציה של הקו-הפקטורים של<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...