Research in the author&#8217;s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board&#8217;s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.

1. Wachstum von Hefezellen <ol><li> Wählen Sie die entsprechenden Hefestämme für die mRNA-Zerfall Leistungsmessungen genutzt werden. Um die Transkription zu hemmen mit dem temperaturempfindlichen Allel der RNA-Polymerase II, verwenden Hefe Stämmen, die das rpb1-1 Mutation 1. Erhalten dieses Hefestammes aus einem Labor, das bereits eine oder erzeugt es im Labor unter Verwendung von Standardverfahren, wenn eine spezifische genetische Hintergrund benötigt 9. </li><li> Unter Einhaltung steriler Techniken vorzubereiten Hefe Medien Verwendung von Standardverfahren 10. Wenn keine Auswahl erforderlich ist, bereiten Sie Rich-Media wie YPD. Alternativ vorzubereiten selektiven Medien, wenn die Hefezellen werden mit Plasmiden und Selektions transformiert erforderlich. Autoklavieren den Medien. </li><li> Wachsen die Hefezellen bei 28 ° C, den der permissiven Temperatur für diesen Hefestamm. Tun Sie dies in zwei Schritten: <ol><li> Zum ersten O / N, wachsen die Hefezellen in 5 ml Wachstumsmedium, um eine Sättigung.</li><li> Richten Sie die zweite O / N am Ende des zweiten Tages. Für den zweiten O / N inokulieren unterschiedliche Mengen von Hefezellen aus dem ersten O / N in 100 bis 150 ml Wachstumsmedium (im Bereich von 100 ul bis 1 ml, 2 ml oder mehr, je nachdem, wann die Hefezellen sein müssen geerntet am nächsten Tag). Diesen Schritt, um sicherzustellen, dass eine der Kulturen in der richtigen OD 600 des folgenden Tages. </li></ol></li></ol> 2. Ernte die Hefezellen <ol><li> Bereiten Sie, um die Hefezellen zu ernten. Das Timing für diesen Schritt ist kritisch; beschriften alle erforderlichen Rohre und sammeln alle notwendigen Geräte und Materialien an einem Ort. Vorzuheizen einem Wasserbad auf 39 ° C vorheizen zwei 15-ml-Teströhrchen aus dem Wachstumsmedium bei 28 ° C und bei 60 ° C. HINWEIS: Die 15 ml Wachstumsmedium Volumen kann je nach der Anzahl von Zeitpunkten die Zellen geerntet werden variiert werden. </li><li> Ernten der Hefezellen, wenn sie eine OD 600 erreicht von 0,4 bis 0,7. Transfer die Zellen 4-6 sterile 50 ml Schraubverschluss-Flaschen. Zentrifuge bei 7.500 x g in einer Ultrazentrifuge für 5 Minuten bei RT. </li><li> Überstand verwerfen und Resuspendieren der Pellets in den 15 ml Wachstumsmedium, das bei 28 ° C äquilibriert wurde. Pool der Hefezellen in einem sterilen 250 ml-Kolben und ins Gleichgewicht kommen sie für ca. 5 min bei 28 ° C Wachstumstemperatur. </li><li> Nachdem die Hefezellen bei der Wachstumstemperatur ins Gleichgewicht gebracht, sofort fügen Sie die 15 ml Wachstumsmedium bei 60 ° C ins Gleichgewicht gebracht, die Temperatur auf 39 ° C (der nicht-permissiven Temperatur) zu erhöhen und die Flasche sofort legen im 39 ° C Wasserbad . Stellen Sie sicher, dass das Kulturmedium verbleibt in der 39 ° C-Wasserbad während der restlichen Zellernte Schritte, um sicherzustellen, dass die Transkription abgeschaltet wird. </li><li> Ernten Sie die Zellen zu verschiedenen Zeiten nach dem Platzieren des Kolbens im 39 ° C Wasserbad. Zum ersten Zeitpunkt, Ernte der Zellen unmittelbar nach dem Einlegen des Kolbens bei 39 &amp; #176; C. Ernten Sie eine 3-ml-Aliquot und verteilen Sie die 3 ml in zwei 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Pellet die Zellen für 10 Sekunden in einem Mini-Zentrifuge oder picofuge mit Schnellbremsung und gießen Sie den Überstand. </li><li> Sofort gefrier des Pellets in einem Trockeneis / Ethanol-Bad oder in flüssigem Stickstoff. Festlegen des ersten Zeitpunkt die Zellen bei als Zeitpunkt Null geerntet. </li><li> Die Zeitpunkte werden die Zellen bei danach geerntet experimentell zu bestimmen, indem ein Pilotversuch abhängig von den mRNAs von Interesse. Normalerweise Ernte Hefezellen zu folgenden Zeitpunkten: 0, 3, 6, 9, 12, 18, ​​25 und 35 min (2B). Wenn die mRNA Halbwertszeit kann nicht mit den oben genannten Zeitpunkten ermittelt werden, passen diese Zeitpunkte. Zum Beispiel kann für mRNAs mit erwarteten kurzen Halbwertszeiten, zu verwenden kürzere Zeiten Punkten (dh 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 und 18 min) und für mRNAs mit erwarteten langen Halbwertszeiten, zu verlängern die Zeitpunkte. </li><li> Nachdem die Zellen harvested, speichern sie in einem -80 ° C Gefrierschrank bis RNA-Extraktion durchgeführt wird. </li></ol> 3. Extrahieren von RNA aus den Hefezellen <ol><li> Für die RNA-Extraktion Teil des Protokolls verwenden RNase freien Techniken, um den Abbau der RNA durch RNasen zu verhindern. Bereiten RNase freien Lösungen, Glas- und Plastikwaren, um die Extraktion der RNA verwendet werden. </li><li> Extrahieren der RNA aus den Hefezellen nach Standardprotokollen. In der Regel verwenden Sie den heißen Phenolverfahren 12. Alternativ verwenden Kits, die verwendet werden können, um RNA aus Hefezellen extrahieren. </li><li> Bestimmen die Menge und Reinheit der RNA, die normalerweise durch die Messung der Absorption bei A 260 und A 280 von 2 &amp; mgr; l von RNA unter Verwendung einer Nanodrop. Bestimmung der Konzentration der RNA aus dem A 260. Auf der Grundlage der Konzentration verdünnen RNA bis 1 ug / ul mit DEPC behandeltem Wasser. HINWEIS: Das Verhältnis von A 260 / A 280 liefert Informationen über ter die Reinheit der RNA. Eine RNA-Probe ist rein, wenn die A 260 / A 280 Verhältnis beträgt 2,0 ± 0,1. </li></ol> 4. Northern-Blot-Analyse HINWEIS: Northern Blots auf mRNA-Spiegel zu quantifizieren und zu erhalten Informationen über die Größe der Transkripte. Darüber hinaus verwenden Northern Blots, um mRNAs, die mehrere Isoformen von derselben mRNA produzieren zu erkennen. <ol><li> Bereiten Sie eine 1,0% Agarose-Formaldehyd-Gel. Führen gleiche Mengen der Proben-RNA an der Agarose-Formaldehyd-Gel durch Elektrophorese nach Standardprotokollen 12. Führen Sie einen RNA-Leiter neben den RNA-Proben und es verwenden, um die Größe der RNA, die auf dem Northern Blot erkannt zu bestimmen. Vor der Übertragung der RNA auf der Agarose-Formaldehyd-Gel auf eine Membran getrennt sind, schneiden Sie die Spur mit der RNA-Leiter aus dem Gel und visualisieren mit Ethidiumbromid. HINWEIS: Alternativ kann das ganze Gel mit Ethidiumbromid vor dem Transfer der RNA gefärbt werden. </li><li> Aach dem RNA-Proben wurden auf einen geeigneten Abstand auf dem Gel migriert, übertragen Sie die RNA auf eine Membran mit RNase freien Techniken. Verwenden Sie eine von mehreren Protokollen zur Verfügung RNA Membranen 12-13 übertragen. Um die RNA auf eine Membran übertragen, schneiden sich die Membran in etwa die gleiche Größe wie das Gel. Übertragen der RNA nach Standardprotokollen 12. </li><li> UV Vernetzung der RNA an die Membran unter Verwendung eines UV-Vernetzers gemäß Herstelleranweisungen. Alternativ backen die Membran in einem Ofen auf 80 ° C für 1 Stunde eingestellt. Speicherung der Membran bei -20 ° C in einem Kunststoffbeutel dauernd wiederholt, bis es an spezifischen Sonden hybridisiert wird. HINWEIS: Die trockene Membran kann auch bei Raumtemperatur zwischen Filterpapieren aufbewahrt werden. </li></ol> 5. hybridisieren Sonden Ergänzend zu der RNA in der Nähe zu der Membran ANMERKUNG: Eine Möglichkeit, mRNA auf der Membran zu erkennen ist die 32 P-markierte DNA-Sonden hybridisieren. ACHTUNG: Researchers Arbeit mit 32 P müssen Schutzverfahren zu verwenden, um eine Kontamination zu verhindern. Folgen Sie den Richtlinien des Instituts über die Verwendung von radioaktivem Material. <ol><li> Bereiten Sie die DNA-Sonde durch Markieren von 25 - 50 ng der DNA an der Membran gemß Standardprotokollen 12 hybridisiert werden. Generieren Sie die DNA-Fragment durch PCR oder Plasmid Verdauung. Bestimmung der spezifischen Aktivität der DNA-Sonde durch das Zählen 1 ul des radioaktiv markierten DNA-Sonde nach der eingebauten Nukleotide werden entfernt, 12. </li><li> Vorheizen Vorhybridisierung / Hybridisierungspuffer bei 42 ° C. Verwenden ~ 10 ml der Vorhybridisierung / Hybridisierungspuffer auf 100 cm 2 der Membran 12. </li><li> Hybridisieren 1-5 x 10 6 cpm der radioaktiv markierten DNA-Sonde pro ml Hybridisierungspuffer zu dem Membran O / N in einem Hybridisierungsofen zur mRNA von Interesse 12 zu detektieren. Sicherstellen, dass während der Hybridisierung die Hybridisierungsofen Drehung in einer Richtung,bewirkt, daß die gesamte Membran mit der Hybridisierungslösung ausgesetzt werden, um eine ordnungsgemäße Hybridisierung zu gewährleisten. </li><li> Zwei Mal Waschen der Membran bei Raumtemperatur für 15 min mit 50 ml 2x SSPE und einmal bei 65 ° C mit 50 ml 2x SSPE / 2% SDS für 15 min 12. Wickeln Sie die Membran in der Plastikverpackung, damit es nicht austrocknet oder verunreinigen das Phosphor-Bildschirm. </li><li> Verwendung eines Geigerzählers, eine Schätzung der Intensität der Radioaktivität auf der Membran. ANMERKUNG: Diese Schätzung stellt sicher, dass die Membran an dem Phosphorbildschirm für die entsprechende Zeitdauer ausgesetzt. Verwenden längere Belichtungszeiten für Membranen mit geringen Mengen an Radioaktivität. </li><li> Für Northern Blots, verwenden Sie eine Ladekontrolle, um zu bestätigen, dass gleiche Mengen von RNA werden an jedem Ort geladen. Um dies zu tun, Streifen der Membran und Reprobe es mit einer RNA, die nicht betroffen ist durch den Prozess untersucht. Entfernen Sie die Membran, indem sie in einer Glasschale, die 200 ml kochendes Entfernungslösung (0,1% SDS / 0,01 XSSC) für 2 min. Gießen Sie das Ablöselösung und wiederholen Sie den Vorgang fünfmal 12. HINWEIS:. Ein Beispiel für ein RNA als Ladekontrolle verwendet wird SCR1 SCR1 ist ein RNA-Polymerase III-Transkripts, die stabil und reichlich ist SCR1 RNA Fluss sollte bei kurzen RNA-Polymerase II-Inhibierung nicht signifikant verändert.. </li></ol> 6. Quantifizierung der RNA, die an die Membran gebunden ist, HINWEIS: Um die Menge an Radioaktivität zu quantifizieren auf Membran, setzen die Membran auf eine Phosphor-Bildschirm. Nach der entsprechenden Belichtungszeit, scannen den Leuchtstoffschirm mit einem Phosphor. <ol><li> Scannen Sie den Phosphor-Bildschirm mit den Anweisungen des Herstellers des Phosphor vorgesehen. </li><li> Quantifizierung der mRNA zu jedem Zeitpunkt. Quantifizieren mRNA-Spiegel mit Imagequant Software oder der zugehörigen Software. Normalisieren der mRNA zu jedem Zeitpunkt an die Ladesteuerung. Wenn SCR1 als das BeladenKontrolle, normalisiert die Halbwertszeit northerns zu SCR1. </li><li> Die Halbwertszeit der mRNA wird durch Division der Menge an mRNA verbleibenden zu jedem Zeitpunkt durch die Menge der mRNA vorhanden zum Zeitpunkt 0 (der Anfangszeitpunkt) berechnet. Zeichnen Sie die verbleibenden über die Zeit auf einer halblogarithmischen Grundstück (2C) Prozent mRNA. Berechnen mRNA-Halbwertszeiten nach der folgenden Gleichung: t 1/2 = -0,693 / k (negative 0,693) </li><li> k die Steigung der Ausgleichsgeraden und T 1/2 die mRNA-Halbwertszeit. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Nonsense-Mediated+mRNA+Decay+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae.</a> Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).</li><li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+measuring+mRNA+Decay+Rate+in+Saccharomycescerevisiae.">Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

Hemmung der mRNA-Synthese und mRNA Überwachung Umsatz in der Abwesenheit von neuen Synthese ist ein Verfahren, das häufig verwendet wird, um die mRNA-Abbauraten zu messen. In S. cerevisiae, ist die Messung der mRNA Zerfallsraten durch Hemmung der Transkription unter Verwendung der temperaturempfindliche Allel von RNA-Polymerase II eine der am häufigsten verwendeten Methoden. Dieses Verfahren hemmt spezifisch die RNA-Polymerase II. Die wichtigsten Schritte zur Bestimmung von mRNA-Abbauraten mit dieser Technik...

Die Transkription und Zerfall von spezifischen mRNA sind entscheidende Parameter der Genexpression. Die Rate der Synthese und Zerfall von spezifischen mRNAs bestimmt die Steady-State-Ebene des jeweiligen mRNA. Die stationären Mengen an mRNAs regeln die Fülle von mRNAs und bestimmen, wie viel von jeder mRNA zur Proteinsynthese zur Verfügung steht. Messungen der mRNA Halbwertszeiten werden in großem Umfang verwendet, um die Zerfallsrate von mRNAs zu bestimmen. Spezifische mRNAs Zerfall mit unterschiedlichen Raten, die sich auf Merkmale der mRNA, die die Funktion des Proteins von der mRNA und den Umgebungsbedingungen codiert verwandt sind. Abhängig vom verwendeten mRNA Zerfallsraten bestimmen Technik kann Abklingrate Messungen bestimmt werden entweder global oder für einzelne Transkripte. In der Hefe S. cerevisiae, die Techniken, die am häufigsten verwendet werden, um globale mRNA Zerfallsraten zu messen, umfassen die Verwendung eines Hefe-Stamm, der die temperaturempfindliche Allel von RNA-Polymerase II und chemische Funkgeräteriptional Inhibitoren wie thiolutin und 1,10-Phenanthrolin-1-5. Diese Methoden können auch verwendet werden, um einzelne mRNA Abklingraten 4 messen. Andere Verfahren können auch verwendet werden, um mRNA Zerfallsraten zu messen. Diese Methoden umfassen Ansatz zur stationären Kennzeichnung oder Verwendung von mRNA-Molekülen, die von einem regulierten Promotor, die für ausgewählte Bedingungen exprimiert wird, exprimiert werden. Jede dieser Techniken hat bestimmte Vor- und Nachteile. Die hier beschriebene Technik verwendet die temperaturempfindliche Allel von RNA-Polymerase II. Dieses Verfahren verwendet S. cerevisiae als Modell, kann aber unter Verwendung spezifischer Transkriptionshemmung Techniken 6 geändert und in anderen Systemen genutzt werden. mRNA-Halbwertszeit-Messungen unter Verwendung des temperaturempfindlichen Allel von RNA-Polymerase II werden ausgiebig sowohl für genomweiten und individuellen Messungen der mRNA-Zerfall 4-5 verwendet. Diese Technik erfordert die Verwendung einer spezific Hefestamm, der ein temperaturempfindliches Allel von RNA-Polymerase II, rpb1-1 1 beherbergt. Der Grund für dieses Verfahren ist, dass die Exposition der temperaturempfindlichen Hefestamm auf die nicht-permissive Temperatur hemmt mRNA-Synthese. Anschließend wird Verfall der bereits vorhandenen mRNA zu verschiedenen Zeitpunkten überwacht nach der Transkription wurde inhibiert. Das Verschwinden von dem vorher existierenden mRNA wird durch Extrahieren von RNA aus den Hefezellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transkription abgeschaltet wurde überwacht. Die Zeitpunkte, an denen die Hefezellen geerntet werden von einem Pilotversuch vorbestimmten, und hängen von der Transkripte und untersuchten System. Schnellere Zeitpunkte werden für kurzlebige Transkripte verwendet, während längere Zeit Punkte werden für länger gelebt Transkripte verwendet. Danach wird der Zerfall der mRNA entweder durch Northern Blot-Analyse, quantitative PCR oder RNAseq überwacht. Die Messung der mRNA Halbwertszeiten mit einem temperature empfindliche Allel von RNA-Polymerase II hat seine Vorteile. Erstens ist dieses Verfahren einfach und geradlinig. Zweitens, wenn der Hefestamm erfasst oder im Labor die mRNA-Halbwertszeit-Messungen in unterschiedlichen Wachstumsbedingungen bestimmt werden, erzeugt werden; ermöglicht die Bestimmung von Umwelt Einfluss auf mRNA-Zerfall. Drittens kann mRNA Zerfallsraten überwacht werden genomweite. Die Verwendung anderer Transkriptionshemmung Techniken hat auch Vorteile und Grenzen. Zum Beispiel kann die Verwendung eines induzierbaren Promotors erfordert Subklonierung zu einer mRNA, die unter der Kontrolle der regulierten Promotor zu erzeugen. Thiolutin ist nicht leicht erhältlich und teuer ist, wenn verfügbar. Zusätzlich wird Wirkungs thiolutin die nicht vollständig verstanden, und es wurde berichtet, dass andere zelluläre Prozesse, einschließlich Hemmung der mRNA-Zerfall 7 beeinflussen. Alternativ, 1,10-Phenanthrolin, ist leicht verfügbar. Ferner sind alle der Techniken verwendet werden, um Transkription zu hemmen, kann perturb Zellfunktion und kann verschiedene mRNAs in unterschiedlichen Weisen beeinflussen. Ein Ermittler muss die am besten geeignete Methode, um in ihren experimentellen Bedingungen nutzen, um die zuverlässigsten Ergebnisse erreichen zu bestimmen. Zu bestimmen, welche am besten geeignete Verfahren für ihre Anwendung ist, muss ein Forscher, die Transkripte und die Funktion der Proteine, die von den Transkripten kodiert suchten identifizieren. Die zuverlässigsten mRNA-Zerfall Leistungsmessungen sind diejenigen, die verwenden, bestimmt mehrere Techniken und zeigen dieselbe Abbaurate. Keine dieser Techniken ist immer die beste, und die am besten geeignete Technik, hängt von der speziellen Situation. Zahlreiche Studien in S. cerevisiae haben mRNA Zerfallsraten in verschiedenen Bedingungen und genetischen Hintergründen gemessen. Die Bedingungen, die mRNA-Zerfall Preise sind in Mess hängen von der spezifischen Experiment untersucht. Mess mRNA Zerfallsraten in verschiedenen zellulären Umgebungen bestimmt, ob die Bedingungen, dasssuchten bevorzugt Einfluss auf die Zerfallsraten spezifischer mRNAs. Die Dämpfungsraten von mRNAs kann auch in Abhängigkeit von den Hefestamm je benutzt. Beispielsweise kann mRNA Zerfallsraten in Wildtyp-Hefezellen und Hefezellen mit einer nicht funktionsfähig Nonsense-vermittelten mRNA-Abbau (NMD) Weg bestimmt werden. Diese mRNA Abbauweg in allen eukaryontischen Organismen, die bisher untersucht wurden, gefunden, und es den Abbau von mRNAs, die vorzeitig zu beenden Übersetzung 8 auslöst. NMD wurde ursprünglich als ein Weg, der mRNAs mit vorzeitigen Stoppcodons oder Nonsense-Codons abbaut identifiziert, aber wird jetzt als ein Weg, der auch die Expression von nicht-Unsinn mit natürlichen mRNAs anerkannt. mRNAs, die als Ziele der Bahn sind, werden rasch in Hefezellen, die mit einem funktionellen NMD Weg abgebaut und in Hefezellen, die mit einem nicht-funktionellen NMD Wegs stabilisiert. So sind die Halbwertszeiten der mRNAs, die direkte Ziele dieses Weges sind in Wildtyp-Hefe cel kürzerls gegenüber Hefezellen mit einer nicht funktionsfähig NMD Weg.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1077">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:272px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:479px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Speed Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Genescreen Plus membrane</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>50-905-0169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hybridization Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>95-0030-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphor screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9564-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Typhoon phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29004080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV cross-linker</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>80-6222-31</td>
			<td>Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80&#176; for 1 hour</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:272px;">NorthernMax prehybridization/hybridization buffer&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM8677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation</td>
			<td></td>
			<td>Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mrna decay rates in saccharomyces cerevisiae using rpb1-1 strains

mRNA stationären Ebenen je nach Umgebungsbedingungen abhängig. Regulierung der stationären Aufstau einer mRNA stellt sicher, dass die korrekte Menge an Protein für die Zelle spezifische Wachstumsbedingungen synthetisiert. Ein Ansatz zum Messen der mRNA Zerfallsraten ist die Hemmung der Transkription und in der Folge der Überwachung des Verschwindens des bereits vorhandenen mRNA. Die Rate der mRNA-Zerfall kann dann quantifiziert werden, und eine genaue Halbwertszeit bestimmt werden kann unter Verwendung verschiedener Techniken. In S. cerevisiae, Protokolle, die mRNA Halbwertszeiten wurden entwickelt, messen und zählen Hemmung der Transkription der mRNA unter Verwendung von Stämmen, die ein temperaturempfindliches Allel von RNA-Polymerase II, rpb1-1 Hafen. Andere Techniken zum Messen mRNA-Halbwertszeiten umfassen Hemmung der Transkription mit Transkriptionsinhibitoren wie thiolutin oder 1,10-Phenanthrolin, oder alternativ durch Verwendung von mRNAs, die unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotorswie die Galactose induzierbaren Promotor und dem TET-off-System. Hier haben wir Messung S. beschreiben cerevisiae mRNA Zerfallsraten mit Hilfe der temperaturempfindliche Allel von RNA-Polymerase II. Diese Technik kann verwendet werden, um mRNA-Zerfallsraten einzelner mRNAs oder genomweiten messen.

<html> Die Fähigkeit dieses Protokoll, um mRNA Zerfallsraten exakt zu messen, hängt von Hemmung der Transkription, die Ernte von Hefezellen zu den entsprechenden Zeitpunkten, und die Nutzung von RNase freien Techniken beim Extrahieren von RNA und Northern-Blotting. Probing für zwei Steuer mRNAs bekannt instabil und stabil zu sein, bzw. bietet Sicherheit, dass das Experiment funktioniert. Beispielsweise kann dies durch Sondieren mit einer Sonde, die sowohl das CYH2-prä-mRNA und mRNA erkennt erfolgen. ...

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Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Die Steady-State-Level spezifischer mRNAs wird durch die Geschwindigkeit der Synthese und der Zerfall der mRNA bestimmt. Genomweite mRNA Abbauraten oder die Zerfallsraten spezifischer mRNAs kann durch Bestimmung mRNA Halbwertszeiten gemessen werden. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Messung der mRNA-Zerfallsraten in Saccharomyces cerevisiae.

Die Messung der mRNA-Abbau Preise in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Verwenden<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Die Stämme

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

measurement-mrna-decay-rates-saccharomyces-cerevisiae-using-rpb1-1

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Biology

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

12.5K Aufrufe.  Baylor University.  Die Steady-State-Level spezifischer mRNAs wird durch die Geschwindigkeit der Synthese und der Zerfall der mRNA bestimmt. Genomweite mRNA Abbauraten oder die Zerfallsraten spezifischer mRNAs kann durch Bestimmung mRNA Halbwertszeiten gemessen werden. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Messung der mRNA-Zerfallsraten in Saccharomyces cerevisiae. 

Serie: Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Präparation Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Forschung

Biologie

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expression und Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatorprotein in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Schnelle Identifikation von chemischen Genetische Interaktionen in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Entwicklung Methode Regie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliothek Schöpfung und Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Die Messung der mRNA-Abbau Preise in

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Präparation Saccharomyces cerevisiae Asci

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Expression und Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatorprotein in Saccharomyces cerevisiae

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz

Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in

Schnelle Identifikation von chemischen Genetische Interaktionen in

Entwicklung Methode Regie in

Cycloheximid Chase-Analyse von Proteinabbau in