Research in the author&#8217;s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board&#8217;s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.

1. نمو خلايا الخميرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد سلالات الخميرة المناسبة لاستخدامها للقياسات معدل التحلل مرنا. لمنع النسخ باستخدام أليل حساس درجة حرارة RNA البلمرة II، واستخدام سلالات الخميرة إيواء طفرة rpb1-1 1. الحصول على هذه السلالة الخميرة من المختبرات التي لديها بالفعل واحدة، أو توليد في المختبر باستخدام تقنيات القياسية إذا كنت بحاجة لخلفية وراثية محددة 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام تقنية معقمة، وإعداد وسائل الاعلام الخميرة باستخدام إجراءات القياسية 10. إذا كان المطلوب عدم التحديد، وإعداد وسائل الاعلام الغنية مثل YPD. بدلا من ذلك، وإعداد وسائل الإعلام الانتقائي إذا كان مطلوبا تتحول مع البلازميدات واختيار خلايا الخميرة. الأوتوكلاف وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو خلايا الخميرة في 28 ° C، الذي هو درجة الحرارة المسموح بها لهذه السلالة الخميرة. هل هذا في خطوتين: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لO الأول / N، وتنمو خلايا الخميرة في 5 مل من وسائط النمو إلى التشبع.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد O الثاني / N في نهاية اليوم الثاني. لO الثاني / N، تطعيم كميات مختلفة من خلايا الخميرة من O الأول / N إلى 100 إلى 150 مل من وسائط النمو (التي تتراوح بين 100 ميكرولتر إلى 1 مل، 2 مل أو أكثر، اعتمادا على عندما تحتاج خلايا الخميرة لتكون حصاد اليوم التالي). القيام بهذه الخطوة لضمان أن واحدا من الثقافات هو في OD الصحيح 600 في اليوم التالي. </li></ol></li></ol> 2. حصاد خلايا الخميرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستعداد لحصاد الخلايا الخميرة. توقيت هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية. تسمية كل الأنابيب المطلوبة وجمع جميع المعدات والمواد المطلوبة في مكان واحد. سخن حمام مائي إلى 39 درجة مئوية، وسخن اثنين من 15 مل أنابيب اختبار من وسائط النمو عند 28 ° C وعند 60 ° C. ملاحظة: يمكن أن تختلف حجم 15 مل وسائل الاعلام النمو اعتمادا على عدد من النقاط الزمنية كانت الخلايا ليتم حصادها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا الخميرة عندما توصل إلى OD 600 من 0،4-0،7. Transfإيه الخلايا إلى 4 - 6 مل العقيمة 50 المسمار زجاجات الغطاء. أجهزة الطرد المركزي في 7،500 x ج في سرعة الطرد المركزي عالية لمدة 5 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف و resuspend الكريات في وسائل الإعلام نمو 15 مل الذي توازنه عند 28 درجة مئوية. تجميع خلايا الخميرة في واحدة معقمة 250 مل قارورة وتتوازن لهم ل~ 5 دقائق في درجة حرارة النمو 28 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن معايرتها خلايا الخميرة في درجة حرارة النمو، إضافة على الفور 15 مل من وسائط النمو معايرتها في 60 ° C لرفع درجة الحرارة إلى 39 درجة مئوية (درجة حرارة nonpermissive) ووضع على الفور القارورة في 39 ° C حمام الماء . تأكد من أن مستنبت يبقى في 39 ° C حمام الماء طوال ما تبقى من خطوات حصاد الخلايا لضمان تشغيل تلك النسخ قبالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا في أوقات مختلفة بعد وضع القارورة في 39 ° C حمام الماء. لنقطة لأول مرة، حصاد الخلايا مباشرة بعد وضع القارورة في 39 &amp; #176، C. حصاد قسامة 3 مل وتوزيع مل 3 إلى قسمين، 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. بيليه الخلايا لمدة 10 ثانية في جهاز للطرد المركزي مصغرة أو picofuge مع التباطؤ السريع واسكب طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد فورا بيليه في منطقة جافة حمام الثلج / الايثانول أو في النيتروجين السائل. تعيين نقطة لأول مرة يتم حصاد الخلايا في كنقطة الوقت الصفر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجريبيا تحديد نقاط زمنية يتم حصاد الخلايا في بعد ذلك عن طريق تجربة رائدة، وهذا يتوقف على من mRNAs من الفائدة. عادة، وخلايا الخميرة في حصاد النقاط الزمنية التالية: 0، 3، 6، 9، 12، 18، 25 و 35 دقيقة (الشكل 2B). إذا كان مرنا نصف الحياة لا يمكن تحديدها باستخدام النقاط الزمنية المذكورة أعلاه، وضبط هذه النقاط الوقت. على سبيل المثال، من mRNAs مع المتوقع حياة نصف قصيرة، استخدم أقصر الأوقات نقطة (أي، 0، 1، 2، 3، 4، 6، 9، 12 و 18 دقيقة) وللمن mRNAs مع المتوقعة نصف حياة طويلة، تمديد نقاط الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الخلايا هي هكتارrvested، وتخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية حتى يتم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي بها. </li></ol> 3. استخراج الحمض النووي الريبي من خلايا الخميرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لRNA استخراج جزء من البروتوكول، واستخدام تقنيات ريبونوكلياز الحرة لمنع تدهور الحمض النووي الريبي التي كتبها RNases. إعداد ريبونوكلياز الحلول المجانية، والأواني الزجاجية والأدوات البلاستيكية لاستخدامها في استخراج الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج الحمض النووي الريبي من خلايا الخميرة وفقا لبروتوكولات القياسية. عادة، استخدام الأسلوب الفينول الساخن 12. بدلا من ذلك، استخدام مجموعات التي يمكن استخدامها لاستخراج الحمض النووي الريبي من خلايا الخميرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد كمية ونقاء من الحمض النووي الريبي، وعادة عن طريق قياس الامتصاصية في A 260 و A 280 من 2 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي باستخدام معمل NanoDrop. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي من A 260. وبناء على التركيز، وتمييع RNA إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر DEPC باستخدام المياه المعالجة. ملاحظة: نسبة A 260 / A 280 يقدم معلومات عن رهو نقاء من الحمض النووي الريبي. على عينة الحمض النووي الريبي هو محض إذا كانت نسبة A 260 / A 280 هي 2.0 ± 0.1. </li></ol> 4. الشمالية تحليل لطخة ملاحظة: استخدم البقع شمال لقياس مستويات مرنا والحصول على معلومات عن حجم النصوص. وبالإضافة إلى ذلك، استخدم البقع الشمالية للكشف عن من mRNAs التي تنتج الأشكال الإسوية متعددة من نفس مرنا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1.0٪ هلام الاغاروز-الفورمالديهايد. تشغيل كميات متساوية من عينة الحمض النووي الريبي على هلام الفورمالديهايد الاغاروز من قبل الكهربائي وفقا لبروتوكولات القياسية 12. تشغيل سلم RNA جنبا إلى جنب مع عينات الحمض النووي الريبي واستخدامها لتحديد أحجام RNA التي يتم الكشف عنها على لطخة الشمالية. قبل نقل RNA فصل على هلام الفورمالديهايد الاغاروز إلى الغشاء، وقطع الممر مع سلم RNA من هلام وتصور باستخدام بروميد إيثيديوم. ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن أن تكون ملطخة هلام كله مع بروميد إيثيديوم قبل نقل الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aهاجروا عينات fter الحمض النووي الريبي لمسافة مناسبة على هلام، ونقل الحمض النووي الريبي لغشاء باستخدام تقنيات ريبونوكلياز الحرة. استخدام واحدة من عدة بروتوكولات المتاحة لنقل RNA إلى الأغشية 12-13. لنقل الحمض النووي الريبي لغشاء، وقطع الغشاء إلى ما يقرب من نفس حجم هلام. نقل RNA وفقا لبروتوكولات القياسية 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأشعة فوق البنفسجية عبر ربط RNA إلى غشاء باستخدام الأشعة فوق البنفسجية crosslinker باتباع إرشادات الشركة المصنعة. بدلا من ذلك، خبز الغشاء في فرن المنصوص إلى 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تخزين الغشاء في -20 ° C في كيس من البلاستيك لأجل غير مسمى حتى يتم تهجين لتحقيقات محددة. ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم تخزين غشاء الجافة في RT بين أوراق الترشيح. </li></ol> 5. هجن تحقيقات التكميلي إلى RNA الاهتمام إلى غشاء ملاحظة: طريقة واحدة للكشف مرنا على الغشاء هو هجن 32 P تحقيقات الحمض النووي المسمى. تنبيه: Researchers العمل مع 32 P تحتاج إلى استخدام إجراءات وقائية لمنع التلوث. اتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية على استخدام المواد المشعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التحقيق DNA التي وصفها 25 - 50 نانوغرام من الحمض النووي ليتم تهجين لغشاء وفقا لبروتوكولات القياسية 12. توليد جزء DNA بواسطة PCR أو بلازميد الهضم. تحديد نشاط معين لجنة التحقيق DNA عن طريق عد 1 ميكرولتر من التحقيق DNA radiolabelled بعد أن يتم إزالة النيوكليوتيدات الفردية 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سخن عازلة prehybridization / التهجين في 42 درجة مئوية. استخدام ~ 10 مل من المخزن المؤقت prehybridization / التهجين لكل 100 سم 2 للغشاء 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هجن 1-5 × 10 6 الاجتماع التحضيري للمؤتمر من التحقيق DNA رديولبلد لكل مل من العازلة التهجين إلى O غشاء / N في فرن التهجين للكشف عن مرنا من الفائدة 12. تأكد من أنه خلال التهجين دوران الفرن التهجين هو في الاتجاه الذييسبب الغشاء بأكمله إلى أن يتعرض إلى حل التهجين، لضمان التهجين السليم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الغشاء مرتين في RT لمدة 15 دقيقة مع 50 مل من 2X SSPE ومرة واحدة على 65 درجة مئوية مع 50 مل من 2X SSPE / 2٪ SDS لمدة 15 دقيقة 12. التفاف الغشاء في غلاف بلاستيكي للتأكد من أنه لا تجف أو تلوث الشاشة الفوسفور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام عداد جيجر، وتقدير كثافة النشاط الإشعاعي على الغشاء. ملاحظة: يضمن هذا التقدير أن يتعرض الغشاء إلى الشاشة الفوسفور لكمية مناسبة من الوقت. استخدام التعرض مرات أطول لأغشية مع كميات منخفضة من النشاط الإشعاعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالبقع الشمالية، استخدم تحكم التحميل للتأكد من أن كميات متساوية من RNA يتم تحميلها على كل بقعة. للقيام بذلك، تجريد الغشاء وreprobe ذلك مع RNA التي لا تتأثر عملية يجري بحثها. تجريد الغشاء عن طريق وضعها في علبة زجاجية تحتوي على 200 مل من الغليان تجريد الحل (0.1٪ SDS / 0.01 XSSC) لمدة 2 دقيقة. من اجل الخروج من حل تجريد وكرر الإجراء خمس مرات (12). ملاحظة: مثال RNA تستخدم كعنصر تحكم التحميل هو SCR1 SCR1 هو نسخة RNA البلمرة III التي هي مستقرة وفرة يجب SCR1 فرة RNA لم تتغير بشكل ملحوظ خلال فترات قصيرة من RNA البلمرة II تثبيط. </li></ol> 6. قياس RNA المنضم إلى غشاء ملاحظة: لقياس كمية النشاط الإشعاعي على الغشاء، وفضح الغشاء إلى شاشة الفوسفور. بعد وقت التعرض المناسب، مسح الشاشة باستخدام الفوسفور phosphorimager. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح الشاشة الفوسفور باستخدام الإرشادات المقدمة من قبل الشركة المصنعة للphosphorimager. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس مرنا في كل نقطة زمنية. تحديد مستويات مرنا باستخدام برنامج ImageQuant أو البرامج ذات الصلة. تطبيع مرنا في كل نقطة زمنية لرقابة التحميل. إذا تم استخدام SCR1 كما تحميلالسيطرة، وتطبيع northerns عمر النصف لSCR1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم حساب عمر النصف للمرنا بقسمة كمية مرنا المتبقية في كل نقطة زمنية بمقدار مرنا الحاضر في وقت ونقطة 0 (نقطة زمنية الأولية). رسم بياني لمرنا في المئة المتبقية مقابل الوقت على قطعة semilogarithmic (الشكل 2C). حساب مرنا نصف العمر عن طريق المعادلة التالية: ر 1/2 = -0.693 / ك (سلبي 0،693) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ك هو المنحدر من أفضل خط مناسبا ور 1/2 هو مرنا نصف الحياة. </li></ol>

<ol>
	<li>Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+RNA+polymerase+conditional+mutant+that+rapidly+ceases+mRNA+synthesis.">Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis.</a> Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).</li><li>Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+mRNA+stability+and+length+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).</li><li>Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+of+thiolutin,+an+inhibitor+of+macromolecular+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 .</li><li>Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Comparison+of+stable+and+unstable+mRNAs+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 .</li><li>Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Analysis+of+mRNA+Stability+Using+Transcription+Inhibitors+and+Microarrays+Reveals+Postranscriptional+Control+of+Ribosome+Biogenesis+Factors.">Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors.</a> Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).</li><li>Tani, H., Akimitsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+technology+for+determining+RNA+stability+in+mammalian+cells.">Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells.</a> RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).</li><li>Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+inhibitor+thiolutin+blocks+mRNA+degradation+in+yeast.">The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast.</a> Yeast. 25, 85-92 (2008).</li><li>Kervestin, S., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMD:+a+multifaceted+response+to+premature+translational+termination.">NMD: a multifaceted response to premature translational termination.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).</li><li>Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Polymerase+II+subunit+composition,+stoichiometry+and+phosphorylation.">RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation.</a> Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).</li><li>Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (1998).</li><li>Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+affects+relative+nonsense+mRNA+accumulation+in+wild-type+and+upf+mutant+yeast+strains+Current+Genetics).">Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics).</a> 43, 171-177 (2003).</li><li>Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Nonsense-Mediated+mRNA+Decay+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae.</a> Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).</li><li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+measuring+mRNA+Decay+Rate+in+Saccharomycescerevisiae.">Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

تثبيط تخليق مرنا ومراقبة دوران مرنا في غياب توليفة جديدة هو الأسلوب الذي كثيرا ما يستخدم لقياس معدلات تسوس مرنا. في S. الخباز، وقياس معدلات تسوس مرنا عن طريق تثبيط النسخ باستخدام أليل حساس درجة حرارة RNA بوليميريز الثاني هو واحد من أكثر الوسائل استخداما. هذه الطري?...

النسخ واضمحلال مرنا محددة من المحددات الحاسمة في التعبير الجيني. معدل التوليف واضمحلال من mRNAs محددة يحدد مستوى ثابت للدولة من أن مرنا معين. مستويات الحالة المستقرة للمن mRNAs تحكم وفرة من mRNAs وتحديد مقدار كل مرنا هو متاح لتخليق البروتين. وتستخدم قياسات مرنا نصف العمر على نطاق واسع لتحديد معدل اضمحلال من mRNAs. من mRNAs تسوس محددة بمعدلات مختلفة التي ترتبط ملامح مرنا، وظيفة البروتين المشفرة بواسطة مرنا والظروف البيئية. اعتمادا على تقنية تستخدم لتحديد معدلات تسوس مرنا، ويمكن تحديد قياسات معدل التحلل إما على الصعيد العالمي أو النصوص الفردية. في خميرة S. الخباز، والتقنيات التي تستخدم عادة لقياس معدلات تسوس مرنا العالمي وتشمل الاستفادة من سلالة الخميرة إيواء أليل حساس درجة حرارة RNA بوليميريز الثاني وtransc الكيميائيمثبطات riptional مثل thiolutin و-1،10 phenanthroline 1-5. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الأساليب لقياس معدلات تسوس مرنا الفردية 4. يمكن أيضا أن تستخدم طرق أخرى لقياس معدلات تسوس مرنا. وتشمل هذه الأساليب نهج لوضع العلامات الدولة ثابت أو استخدام جزيئات الرنا التي يتم التعبير عنها من المروج المنظم الذي يتم التعبير فقط في ظروف محددة. كل من هذه التقنيات لديها مزايا وقيود معينة. تقنية الموضحة هنا تستخدم أليل حساس درجة حرارة RNA البلمرة II. وتستخدم هذه الطريقة S. الخباز كنموذج، ولكن يمكن أن يتم تعديلها واستخدامها في أنظمة أخرى باستخدام تقنيات تثبيط النسخي محددة 6. مرنا القياسات نصف الحياة باستخدام أليل حساس درجة حرارة RNA البلمرة II وتستخدم على نطاق واسع لكلا القياسات الجينوم على نطاق والفردية من مرنا تسوس 4-5. تتطلب هذه التقنية استخدام specifجيم سلالة الخميرة التي تؤوي أليل حساس درجة حرارة RNA البلمرة II، rpb1-1 1. الأساس المنطقي لهذه التقنية هو أن التعرض لدرجة الحرارة حساسة سلالة الخميرة لدرجة حرارة nonpermissive يثبط تخليق مرنا. وفي وقت لاحق، ويتم رصد اضمحلال مرنا قبل الإيجاد في نقاط زمنية مختلفة بعد أن تم مستعمل النسخ. ويتم رصد اختفاء مرنا قبل الإيجاد عن طريق استخراج الحمض النووي الريبي من خلايا الخميرة في نقاط زمنية مختلفة بعد أن تحولت النسخ قبالة. ومحددة سلفا النقاط الوقت الذي يتم حصاد الخلايا الخميرة التي كتبها تجربة رائدة، وتعتمد على النصوص ونظام يجري التحقيق فيها. وتستخدم نقاط زمنية أسرع للنصوص قصيرة الأجل، في حين يتم استخدام نقاط زمنية أطول لالنصوص تعد عاش. بعد ذلك، يتم رصد اضمحلال مرنا إما عن طريق تحليل لطخة الشمالي، PCR الكمي أو RNAseq. قياس مرنا نصف العمر باستخدام الشركة المصرية للاتصالاتmperature أليل حساسة من RNA البلمرة II مزاياه. أولا، هذه التقنية سهلة ومباشرة إلى الأمام. ثانيا، بمجرد الحصول على سلالة الخميرة أو إنشاء في المختبر يمكن تحديد مرنا القياسات نصف الحياة في ظروف النمو المختلفة. تمكين تحديد التأثير البيئي على تسوس مرنا. ثالثا، يمكن رصد معدلات تسوس مرنا على نطاق الجينوم. استخدام تقنيات النسخ تثبيط الأخرى لديها أيضا مزايا وقيود. على سبيل المثال، استخدام المروج محرض يتطلب استنساخ فرعي لتوليد مرنا التي هي تحت سيطرة المروج المنظم. Thiolutin غير متوفرة بسهولة وغير مكلفة عندما تكون متاحة. وبالإضافة إلى ذلك، ليست مفهومة وضع thiolutin للعمل تماما وتم الإبلاغ عن أن تؤثر على العمليات الخلوية الأخرى بما في ذلك منع تسوس مرنا 7. بدلا من ذلك، 1،10-phenanthroline، هو أكثر متاحة بسهولة. وعلاوة على ذلك، فإن جميع التقنيات المستخدمة لمنع النسخ يمكن بيرتURB ظيفة الخلوية ويمكن أن تؤثر على المختلف في mRNA في طرق مختلفة. يحتاج محقق لتحديد أنسب طريقة لاستخدام في ظروف تجريبية لتحقيق النتائج الأكثر موثوقية. لتحديد الطريقة التي هي الأكثر ملاءمة لتطبيقها، يحتاج الباحث إلى التعرف على النصوص وظيفة من البروتينات المشفرة بواسطة النصوص التي يجري التحقيق فيها. القياسات معدل تسوس مرنا الأكثر موثوقية هي تلك التي يتم تحديدها باستخدام تقنيات متعددة وتظهر معدل تسوس نفسه. لا تقنية واحدة هي دائما أفضل، والأسلوب الأكثر ملائمة يعتمد على حالة معينة. العديد من الدراسات في S. الخباز وقياس معدلات تسوس مرنا في مختلف الظروف والخلفيات الوراثية. الظروف أن معدلات تسوس مرنا تقاس في تعتمد على التجربة المحددة التي يجري التحقيق فيها. قياس معدلات تسوس مرنا في بيئات الخلوية المختلفة يحدد ما إذا كان يجري الشروطدرست تؤثر بشكل تفضيلي معدلات اضمحلال من mRNAs محددة. معدلات اضمحلال من mRNAs يمكن أيضا أن تختلف تبعا لسلالة الخميرة المستخدمة. على سبيل المثال، يمكن تحديد معدلات تسوس مرنا في البرية من نوع خلايا الخميرة وخلايا الخميرة مع ظيفي بوساطة هراء تدهور مرنا (NMD) المسار. تم العثور على هذا التدهور مسار مرنا في جميع الكائنات الحية حقيقية النواة التي تم فحصها حتى الآن وأنه يتسبب في تدهور من mRNAs أن إنهاء قبل الأوان الترجمة 8. وقد تم تحديد NMD البداية كمسار التي تحط من mRNAs مع كودونات إنهاء المبكرة أو كودونات هراء، ولكن ومن المسلم به الآن كمسار الذي ينظم أيضا التعبير عن عدم هراء التي تحتوي على أنواع من mRNAs الطبيعية. وتدهورت من mRNAs التي هي أهداف للمسار السريع في خلايا الخميرة مع مسار وظيفي NMD واستقرت في خلايا الخميرة مع مسار NMD غير وظيفي. وهكذا، فإن حياة نصف من من mRNAs التي أهدافا مباشرة من هذا المسار هي أقصر في البرية من نوع الخميرة سلليرة سورية مقارنة مع خلايا الخميرة مع مسار NMD غير وظيفي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1077">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:272px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:479px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Speed Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Genescreen Plus membrane</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>50-905-0169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hybridization Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>95-0030-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphor screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9564-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Typhoon phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29004080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV cross-linker</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>80-6222-31</td>
			<td>Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80&#176; for 1 hour</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:272px;">NorthernMax prehybridization/hybridization buffer&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM8677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation</td>
			<td></td>
			<td>Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mrna decay rates in saccharomyces cerevisiae using rpb1-1 strains

مرنا مستويات حالة مستقرة تختلف باختلاف الظروف البيئية. تنظيم مستويات تراكم حالة مستقرة من مرنا يضمن أن المبلغ الصحيح للبروتين يتم تصنيعه لظروف النمو المحددة للخلية. نهج واحد لقياس معدلات تسوس مرنا هو منع النسخ والرصد لاحقا اختفاء مرنا موجودة بالفعل. ويمكن بعد ذلك كميا معدل تسوس مرنا، ودقيقة نصف الحياة ويمكن تحديد ذلك باستخدام عدة تقنيات. في S. الخباز والبروتوكولات التي تقيس مرنا وقد وضعت نصف العمر وتشمل تثبيط النسخ من مرنا باستخدام سلالات التي تؤوي أليل حساس درجة حرارة RNA البلمرة II، rpb1-1. تقنيات أخرى لقياس مرنا نصف حياة تشمل عرقلة النسخ مع مثبطات النسخي مثل thiolutin أو 1،10-phenanthroline، أو بدلا من ذلك، من خلال الاستفادة من mRNAs التي هي تحت سيطرة أحد المروجين regulatableمثل الجلاكتوز المروج محرض وخارج TET النظام. هنا، نحن تصف قياس S. معدلات تسوس الخباز مرنا باستخدام أليل حساس درجة حرارة RNA البلمرة II. هذه التقنية يمكن استخدامها لقياس مرنا معدلات اضمحلال من mRNAs الفردية أو على مستوى الجينوم.

<html> قدرة هذا البروتوكول لقياس بدقة معدلات تسوس مرنا يعتمد على تثبيط النسخ، حصاد خلايا الخميرة في نقاط زمنية مناسبة، واستخدام تقنيات المجانية ريبونوكلياز أثناء استخراج RNA والنشاف الشمالي. التحقيق لمدة من mRNAs السيطرة المعروف أن تكون غير مستقرة ومستقرة، على التوالي، و?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains at JoVE.com

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

ويتحدد مستوى الدولة المطرد للمن mRNAs محددة من معدل توليف واضمحلال مرنا. معدلات تدهور مرنا على نطاق الجينوم أو معدلات اضمحلال من mRNAs محددة يمكن قياسها من خلال تحديد مرنا نصف العمر. يركز هذا البروتوكول على قياس معدلات تسوس مرنا في خميرة الخباز.

قياس مرنا تسوس الأسعار<em&gt; خميرة الخباز</em&gt; استخدام<em&gt; rpb1-1</em&gt; سلالات

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

measurement-mrna-decay-rates-saccharomyces-cerevisiae-using-rpb1-1

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

12.4K Views.  Baylor University.  ويتحدد مستوى الدولة المطرد للمن mRNAs محددة من معدل توليف واضمحلال مرنا. معدلات تدهور مرنا على نطاق الجينوم أو معدلات اضمحلال من mRNAs محددة يمكن قياسها من خلال تحديد مرنا نصف العمر. يركز هذا البروتوكول على قياس معدلات تسوس مرنا في خميرة الخب?...

Video: Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

تشريح السكيراء الجعوية زقاق

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

حفز Phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية السكيراء الجعوية</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

والفحص المجهري لالإسفار Mitophagy الرصد في الخميرة السكيراء الجعوية

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

تنقية التليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم البروتين المعبر عنه في<em&gt; خميرة الخباز</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR رصدت الأكسدة والاختزال المعايرة من العوامل المساعدة لل<em&gt; خميرة الخباز</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

تحديد سرعة التفاعلات الكيميائية الوراثية في<em&gt; خميرة الخباز</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

توجه طريقة تطور في<em&gt; خميرة الخباز</em&gt;: المسخ مكتبة الخلق والفرز

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...