Research in the author&#8217;s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board&#8217;s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.

酵母細胞の1成長<ol><li> mRNAの減衰率測定のために利用される適切な酵母株を選択する。 RNAポリメラーゼIIの温度感受性対立遺伝子を使用して転写を阻害するために、rpb1-1突然変異1を保有する酵母株を使用しています。すでに1を持って研究室から、この酵母株を取得し、または特定の遺伝的背景が9必要な場合は、標準的な技術を用いて実験室でそれを生成する。 </li><li>無菌技術を使用して、標準的な手順10を用いて酵母培地を準備。何も選択が必要とされない場合には、そのようなYPDなどのリッチメディアを準備します。酵母細胞をプラスミドで形質転換され、選択が必要な場合あるいは、選択培地を調製する。メディアオートクレーブ。 </li><li>この酵母株を許容温度である28℃、で酵母細胞を成長させる。 2段階でこれを実行します。 <ol><li>最初のO / Nのために、飽和まで増殖培地5ml中の酵母細胞を成長させる。</li><li>二日目の終わりに第二のO / Nを設定します。第二のO / Nのために、第1のOから/ N（酵母細胞がする必要がある場合に応じて、100μlの1 mlの2ミリリットル以上までの範囲の増殖培地100〜150ミリリットル中に酵母細胞を異なる量の接種）次の日に収穫。文化の一つが正しいOD 600で、次の日であることを保証するために、この手順を行います。 </li></ol></li></ol> 2.収穫酵母細胞<ol><li>酵母細胞を採取するために準備します。このステップのタイミングは非常に重要です。必要なすべてのチューブにラベルを付け、一箇所ですべての必要な機器や材料を集める。 39℃に水浴を予熱し、28℃、60℃、成長培地二つの15ミリリットル試験管を予熱する。 NOTE：15ミリリットルの増殖培地の容積は、細胞が収穫される時点の数に応じて変化させることができる。 </li><li>彼らは0.7 OD 0.4の600に達したときに、酵母細胞を収穫。 TRANSFER 4個の細胞 - 6無菌の50ミリリットルは、キャップボトルをねじ込みます。 RTで5分間の高速遠心機において7500×gで遠心する。 </li><li>上清を捨て、28℃で平衡化した15ミリリットルの増殖培地中のペレットを再懸濁します。 1滅菌250mlのフラスコに酵母細胞をプールし、28℃の成長温度で約5分間インキュベートして平衡化。 </li><li>酵母細胞は、成長温度で平衡化した後、直ちに39℃（非許容温度）の温度を上昇させるために60℃で平衡化した成長培地15mlのを追加し、直ちに39℃の水浴でフラスコを置き。培養培地は、その転写がオフになっていることを確認するために残りの細胞を収穫する段階を通じて39℃の水浴中で残っていることを確認します。 </li><li> 39℃の水浴中にフラスコを置いた後、異なる時点で細胞を採取する。最初の時点では、39＆＃でフラスコを置いた直後に細胞を回収する176; C。 3ミリリットルアリコートを収穫し、2、1.5ミリリットルのマイクロチューブに3ミリリットルを配布。ミニ遠心機で10秒間細胞をペレットや急減速でpicofuge、上清を注ぐ。 </li><li>直ちにドライアイス/エタノール浴中で、または液体窒素中でペレットを凍結する。細胞を、ゼロ時点としてで収穫された最初の時点を指定する。 </li><li>実験的に関心のあるmRNAのに応じて、パイロット実験により細胞がその後に収穫された時点を決定する。通常は、以下の時点で収穫酵母細胞：0、3、6、9、12、18、25及び35分（ 図2B）。 mRNAの半減期は、上述した時点を用いて決定することができない場合は、これらの時点を調整する。例えば、予想される半減期の短いmRNAのために、短い時間のポイントを使用し、（ すなわち、0、1、2、3、4、6、9、12、18分）、および予想される長い半減期を有するmRNAのために、延長時間点。 </li><li>細胞の後ヘクタールであるRNA抽出が行われるまでrvestedは、-80℃の冷凍庫に保存する。 </li></ol>酵母細胞から3.抽出RNA <ol><li>プロトコルのRNA抽出部は、RNaseによるRNAの分解を防ぐために、RNaseを含まない技術を使用する。 RNAの抽出に使用するRNaseを含まないソリューション、ガラス製品、プラスチックウェアを準備します。 </li><li>標準的なプロトコルに従って酵母細胞からRNAを抽出します。一般的に、ホットフェノール法12を使用します。代替的に、酵母細胞からRNAを抽出するために使用することができるキットを使用。 </li><li>通常はナノドロップを用いたRNAの260と280 2μlので吸光度を測定することにより、RNAの量および純度を決定します。濃度に基づいてA 260からのRNAの濃度を測定、DEPC処理水を使用してを1μg/μlにRNAを希釈。 NOTE：A 280分の260の比をtについての情報を提供RNAの彼は純度。 A 260 / A 280比は2.0±0.1である場合にRNAサンプルは純粋である。 </li></ol> 4.ノーザンブロット分析注：mRNAレベルを定量化し、転写産物のサイズに関する情報を取得するために、ノーザンブロットを使用してください。また、同じmRNAの複数のアイソフォームを生成するmRNAを検出するためのノーザンブロットを使用しています。 <ol><li> 1.0％アガロース - ホルムアルデヒドゲルを準備します。標準プロトコル12に従って電気泳動によりアガロースホルムアルデヒドゲル上のサンプルRNAの等量を実行します。 RNAサンプルと一緒にRNAラダーを実行し、ノーザンブロット上で検出されたRNAのサイズを決定するためにそれを使用。膜へのアガロースホルムアルデヒドゲル上で分離したRNAを転写する前に、ゲルからのRNAラダーとレーンを切断し、臭化エチジウムを用いて可視化する。 注：また、全体のゲルはRNAの転写前、臭化エチジウムで染色することができる。 </li><li> A押え上げRNA試料をRNaseを含まない技術を用いてメンブレンにトランスファーRNA、ゲル上の適切な距離まで移動する。メンブレン12-13へのRNAを転送するために利用可能ないくつかのプロトコルのいずれかを使用してください。メンブレンにRNAを転写するために、ゲルとほぼ同じ大きさの膜を切断する。標準プロトコル12に従ってRNAを転送します。 </li><li> UVを製造業者の説明書に従ってUVクロスリンカーを用いて膜にRNAをクロスリンクする。代替的に、1時間80℃でオーブン設定で膜を焼く。それは特定のプローブにハイブリダイズされるまで無期限にビニール袋に入れて-20℃で膜に保管してください。 注：乾燥膜は、濾紙の間にRTで保存することができる。 </li></ol> 5.ハイブリダイズするプローブメンブレンに興味のRNAに相補的な注：膜上mRNAを検出する1つの方法は、32 P標識DNAプローブをハイブリダイズすることである。注意：Resea32 Pでの作業rchersは汚染を防ぐために保護手順を使用する必要がある。放射性物質の使用に関する制度的なガイドラインに従ってください。 <ol><li> 25標識したDNAプローブを調製- DNA 50ngの標準的なプロトコル12に従って膜にハイブリダイズされる。 PCRまたはプラスミドの消化によりDNAフラグメントを生成する。取り込まれなかったヌクレオチドは、12を除去した後に放射性標識したDNAプローブの1μLをカウントすることにより、DNAプローブの比活性を決定します。 </li><li> 42℃で予熱プレハイブリダイゼーション/ハイブリダイゼーション緩衝液。膜12を100 1cm 2当たりプレハイブリダイゼーション/ハイブリダイゼーション緩衝液の〜10ミリリットルを使用してください。 </li><li>関心12のmRNAを検出するためのハイブリダイゼーションオーブン内膜O / Nへのハイブリダイゼーション緩衝液1ml当たり放射性標識DNAプローブの5×10 6 cpmの1 -ハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの間に、ハイブリダイゼーションオーブン回転がその方向にあることを確認してください膜全体が適切なハイブリダイゼーションを確実にするために、ハイブリダイゼーション溶液に曝露させる。 </li><li> 2×SSPE 50mlを15分間で12倍SSPE / 2％SDS、50 mlの65℃で1時間と室温で15分間、膜を2回洗浄する。それが完全に乾くまたは蛍光ス​​クリーンを汚染しないことを確実にするためにラップで膜を包みます。 </li><li>ガイガーカウンターを用いて、膜上の放射能の強さを推定する。 注：この推定値は、膜が適切な時間蛍光体スクリーンに曝露されることを保証する。放射能の低い量を有する膜のためのより長い露光時間を使用してください。 </li><li>ノーザンブロットのために、等量のRNAが各スポットにロードされていることを確認するためにローディングコントロールを使用しています。これを行うには、膜を除去し、検査されているプロセスによって影響されないRNAでそれを再プローブ。 XS剥離液（0.1％SDS / 0.01を200mlの沸騰を含むガラストレイ内に配置することによって膜ストリップ2分間SC）。剥離液を注ぎ、手順5回12を繰り返します。 注：ローディングコントロールとして使用されるRNAの例は、SCR1 SCR1は安定しており、豊富なRNAポリメラーゼIII転写物ですSCR1 RNAの存在量は、RNAポリメラーゼII阻害の短い期間の間に大きく変化してはならない。。 </li></ol> 6.膜に結合されたRNAを定量化 NOTE：蛍光スクリーンに膜をさらす、膜上の放射能の量を定量するために。適切な露光時間の後、ホスホイメージャを使用して蛍光面をスキャンします。 <ol><li>ホスホイメージャのメーカーが提供する指示を使用して蛍光面をスキャンします。 </li><li>各時点でmRNAを定量化する。をImageQuantソフトウェアまたは関連するソフトウェアを使用してmRNAレベルを定量化する。ローディングコントロールに各時点でmRNAを正規化する。 SCR1、ロードとして使用された場合コントロールは、SCR1に半減期のノーザンを正常化。 </li><li> mRNAの半減期は、時刻0（初期時点）でのmRNAの存在量によって、各時点で残っているmRNAの量を割ることによって計算される。片対数プロット（ 図2C）に対時間残り％のmRNAをグラフ化。次の式でのmRNAの半減期を計算します。 T 1/2 = -0.693 / K（負0.693） </li><li> kは、ベストフィット線の傾きであり、t 1/2は、mRNAの半減期である。 </li></ol>

<ol>
	<li>Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+RNA+polymerase+conditional+mutant+that+rapidly+ceases+mRNA+synthesis.">Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis.</a> Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).</li><li>Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+mRNA+stability+and+length+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).</li><li>Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+of+thiolutin,+an+inhibitor+of+macromolecular+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 .</li><li>Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Comparison+of+stable+and+unstable+mRNAs+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 .</li><li>Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+affects+relative+nonsense+mRNA+accumulation+in+wild-type+and+upf+mutant+yeast+strains+Current+Genetics).">Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics).</a> 43, 171-177 (2003).</li><li>Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Nonsense-Mediated+mRNA+Decay+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae.</a> Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).</li><li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+measuring+mRNA+Decay+Rate+in+Saccharomycescerevisiae.">Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

mRNA合成の阻害は、新しい合成の非存在下でのmRNAの代謝回転を監視するには、しばしばmRNA崩壊速度を測定するために使用される方法である。 S.でセレビシエは、RNAポリメラーゼIIの温度感受性対立遺伝子を使用して転写を阻害することによってmRNA崩壊率の測定は、最も頻繁に使用される方法の一つである。この方法は、具体的にはRNAポリメラーゼIIを阻害する。この技術を用い?...

特定のmRNAの転写および減衰は、遺伝子発現の重要な決定因子である。特定のmRNAの合成及び減衰率​​は、その特定のmRNAの定常状態レベルを決定する。 mRNAの定常状態レベルは、mRNAの豊かさを支配し、タンパク質合成のために提供されてどのくらいの各mRNAの決定する。 mRNAの半減期の測定は、mRNAの減衰率を決定するために広く使用されている。 mRNAは、mRNAおよび環境条件によってコードされるタンパク質の機能の特徴に関連して異なる速度で特定のmRNAの崩壊。 mRNA崩壊速度を決定するために利用された技術に応じて、減衰率の測定は、グローバルに、または個々の転写物について決定することができる。酵母S.でセレビシエ 、最も一般的にグローバルなmRNA崩壊速度を測定するために使用される技法は、RNAポリメラーゼII及び化学transcの温度感受性対立遺伝子を保有する酵母菌株を利用含まそのようなthiolutin 1,10-フェナントロリン1-5としてriptional阻害。これらの方法は、個々のmRNA崩壊率4を測定するために利用することができる。他の方法もまた、mRNA崩壊速度を測定するために利用することができる。これらの方法は、定常状態の標識のみを選択条件において発現される調節されたプロモーターから発現されるmRNA分子の利用へのアプローチを含む。これらの技術は、それぞれ特定の利点と制限があります。ここに記載の技術は、RNAポリメラーゼIIの温度感受性対立遺伝子を利用する。この方法では、Sを使用してcerevisiaeのモデルとして、特定の転写阻害技法6を用いて、他のシステムに変更され、利用されことができるが。 RNAポリメラーゼIIの温度感受性対立遺伝子を用いたmRNAの半減期の測定は、広範囲のmRNA崩壊4-5の両方のゲノム全体および個々の測定のために使用される。この技術は、specifの使用を必要とするRNAポリメラーゼII、rpb1-1 1の温度感受性対立遺伝子を保有するでIC酵母株。この技術の原理は、非許容温度に温度感受性酵母株の曝露は、mRNA合成を阻害することである。転写が阻害された後に続いて、既存のmRNAの崩壊は、様々な時点で監視される。既存のmRNAの消失は、転写がオフにされた後の異なる時点での酵母細胞からRNAを抽出することによって監視される。酵母細胞が収穫される時点は、パイロット実験により所定の、および研究されて転写物およびシステムに依存している。より長い時点長く生き転写物のために使用されている間より速い時点は、短命の転写物のために使用される。その後、mRNAの崩壊は、ノーザンブロット分析、定量的PCRまたはRNAseqいずれかによって監視される。 TEを使用して、mRNAの半減期の測定RNAポリメラーゼIIのmperature敏感な対立遺伝子は、その利点を持っています。第一に、この技術は、簡単で単純である。酵母株は、実験室で取得又は生成されると、第二の、mRNAの半減期の測定は、異なる成長条件で測定することができる。 mRNA分解の環境影響の決定を可能にする。第三に、mRNA崩壊速度は、ゲノム全体を監視することができる。他の転写抑制技術の使用は、利点および限界を有する。例えば、誘導性プロモーターの使用は、調節されたプロモーターの制御下にあるmRNAを生成するためにサブクローニングを必要とする。 Thiolutinは容易に入手できないと利用可能な場合に高価である。また、アクションのthiolutinのモードは完全には理解されず、mRNA崩壊7の阻害を含む他の細胞プロセスに影響を与えることが報告されている。また、1,10-フェナントロリンは、より容易に利用可能である。さらに、転写を阻害するために使用される技術の全ては、PERTでき細胞機能をURBと異なる方法で異なるmRNAに影響を与えることができる。研究者は、最も信頼性の高い結果を得るために彼らの実験条件で使用する最も適切な方法を決定する必要がある。彼らのアプリケーションに最も適している方法を決定するために、研究者が研究されている転写産物によりコードされるタンパク質の転写物および機能を特定する必要があります。最も信頼性の高いmRNA崩壊速度測定は、複数の技術を使用して決定し、同一の減衰速度を示しているものである。単一の技術は常に最善ではない、と最も適切な手法は、特定の状況に依存します。 S.で多数の研究セレビシエは、様々な条件や遺伝的背景においてmRNA崩壊速度を測定した。 mRNA崩壊速度がで測定されている条件が検討され、特定の実験に依存しています。異なる細胞環境におけるmRNA崩壊速度を測定する条件があるか否かを判断する優先的に特定のmRNAの崩壊率に影響を調べた。 mRNAの減衰率も使用されている酵母株に依存して変化し得る。例えば、mRNA崩壊速度は、非機能的ナンセンス変異依存mRNA分解（NMD）経路と、野生型酵母細胞、酵母細胞で測定することができる。このmRNA分解経路は、これまでに検討されている全ての真核生物に見られ、それは早期翻訳8を終了し、mRNAの分解を誘発する。 NMDは当初早期終結コドンまたはナンセンスコドンとmRNAを分解する経路として同定されたが、今も自然なmRNAを含む非ナンセンスの発現を調節する経路として認識されている。経路の標的であるmRNAは急速に機能的なNMD経路を酵母細胞内で分解し、非機能的なNMD経路を酵母細胞中で安定化されている。したがって、この経路の直接の標的であるmRNAの半減期は、野生型酵母のセルが短い非機能的なNMD経路を有する酵母細胞と比較してのl​​s。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1077">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:272px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:479px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Speed Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Genescreen Plus membrane</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>50-905-0169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hybridization Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>95-0030-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphor screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9564-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Typhoon phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29004080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV cross-linker</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>80-6222-31</td>
			<td>Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80&#176; for 1 hour</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:272px;">NorthernMax prehybridization/hybridization buffer&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM8677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation</td>
			<td></td>
			<td>Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mrna decay rates in saccharomyces cerevisiae using rpb1-1 strains

mRNAの定常状態レベルは、環境条件に応じて変化する。 mRNAの定常状態の蓄積レベルの調節は、タンパク質の正確な量は、細胞の特定の増殖条件のために合成されることを保証する。 mRNA崩壊速度を測定するための一つのアプローチは、転写を阻害し、続いて、既に存在するmRNAの消失を監視している。 mRNA分解の速度を定量することができ、正確な半減期は、いくつかの技術を利用して決定することができる。 S.でセレビシエは 、mRNAの半減期を測定するためのプロトコルが開発され、RNAポリメラーゼII、rpb1-1の温度感受性対立遺伝子を保有する菌株を用いて、mRNAの転写を阻害することが含まれている。 mRNAの測定のための他の技術の半減期は、調節可能なプロモーターの制御下にあるmRNAを利用することにより、あるいはそのようなthiolutin又は1,10-フェナントロリンなどの転写阻害剤で転写を阻害する、または含むガラクトース誘導性プロモーター及びTETオフシステムとして。ここでは、Sの測定を説明RNAポリメラーゼIIの温度感受性対立遺伝子を使用した出芽酵母のmRNA減衰率。この技術は、個々のmRNAまたはゲノムワイドのmRNA崩壊速度を測定するために使用することができる。

<html> RNAおよびノー​​ザンブロット法を抽出しながら、正確なmRNA減衰率を測定するために、このプロトコルの能力は、転写の阻害、適切な時点での酵母細胞の収穫、およびRNaseフリーの技術の利用に依存します。それぞれ、不安定で安定していることが知られている2つのコントロールのmRNAのためにプロービング、実験が働いていることを確信しています。例えば、これは、CYH2 mRNA前?...

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Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

特定のmRNAの定常状態レベルは、mRNAの合成および減衰の速度によって決定される。ゲノムワイドなmRNAの分解速度または特定のmRNAの崩壊速度は、mRNAの半減期を決定することによって測定することができる。このプロトコルは、Saccharomyces cerevisiae中のmRNA減衰率の測定に焦点を当てています。

mRNAの崩壊料金の測定で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em&gt;使い方<em&gt; rpb1-1</em&gt;株

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

measurement-mrna-decay-rates-saccharomyces-cerevisiae-using-rpb1-1

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Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

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12.5K ビュー.  Baylor University. 特定のmRNAの定常状態レベルは、mRNAの合成および減衰の速度によって決定される。ゲノムワイドなmRNAの分解速度または特定のmRNAの崩壊速度は、mRNAの半減期を決定することによって測定することができる。このプロトコルは、Saccharomyces cerevisiae中のmRNA減衰率の測定に焦点を当てています。 

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

の解剖サッカロマイセスセレビシエ ASCI

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

生物学

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

脂肪酸の定量的なPhosphoproteomicsは刺激を受けてサッカロマイセスセレビシエ</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

マイクロアレイ解析のためのサッカロマイセスセレビシエ</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

酵母でMitophagyを監視するための蛍光顕微鏡アッセイサッカロマイセスセレビシエ

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

で表現する嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の精製<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPRは、補因子の酸化還元滴定を監視対象<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

における化学遺伝の相互作用の迅速な同定<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

指向進化方法で<em&gt;サッカロマイセス・セレビシエ</em&gt;：変異体ライブラリーの作成およびスクリーニング

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...