Research in the author&#8217;s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board&#8217;s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.

효모 세포의 1. 성장 <ol><li> mRNA의 붕괴 속도 측정을 위해 활용 될 수있는 적절한 효모 균주를 선택합니다. RNA 중합 효소 II의 온도에 민감한 대립 유전자를 사용하여 전사를 억제하기 위해, rpb1-1 돌연변이 일을 품고 효모를 사용합니다. 이미 하나를 가지고이 실험실에서 효모 균주를 얻거나 특정 유전 적 배경이 9 필요한 경우 표준 기술을 사용하여 실험실에서 생성. </li><li> 표준 절차 (10)를 사용하여 효모 미디어를 준비, 멸균 기술을 사용. 어떤 선택이 필요하지 않은 경우, 이러한 YPD으로 리치 미디어를 준비합니다. 및 선택 플라스미드로 형질 전환 된 효모 세포가 필요할 경우 선택적으로, 선택 배지를 준비한다. 미디어를 압력솥. </li><li> 이 효모의 허용 온도 28 ° C에서 효모 세포를 성장. 두 단계로이 작업을 수행합니다 : <ol><li> 제 들면 O / N은 ​​포화 성장 배지 5ml에 효모 세포 성장.</li><li> 둘째 날의 끝에서 두 번째 O / N을 설정한다. 제 O / N의 경우, 제 O 발 / N 100 μL 1 ㎖, 2 ㎖의 이상 범위의 성장 배지 (100~150 ㎖ 중에 효모 세포 상이한 양의 접종에 따라 효모 세포가 될 필요가있을 때 ) 다음날 수확. 문화 중 하나가 올바른 OD (600) 다음 날에 있는지 확인하기 위해이 단계를 수행합니다. </li></ol></li></ol> 2. 수확 효모 세포 <ol><li> 효모 세포를 수확 준비합니다. 이 단계를위한 타이밍이 중요하다; 필요한 모든 튜브에 라벨을 한 곳에서 필요한 모든 장비와 자료를 수집합니다. 39 ° C의 물 목욕을 데우고 C 28 ° C에서 60 °에서 성장 미디어의 두 15 ml의 테스트 튜브를 예열. 참고 : 15 ml의 성장 배지 볼륨 세포 수확하는 시점의 수에 따라 변할 수있다. </li><li> 그들은 0.7 0.4 OD 600에 도달 할 때 효모 세포 수확. TRANSF어 4 셀 - 50 6 멸균 ml의 캡 병 나사. RT에서 5 분 동안 고속 원심 분리기에서 7,500 XG 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 취소하고 28 ° C에서 평형화 된 15 ml의 성장 배지에서 펠렛을 재현 탁. 하나 멸균 250 ml의 플라스크에 효모 세포를 수영장과 28 ° C의 성장 온도에서 ~ 5 분 동안 그들을 평형. </li><li> 효모 세포가 성장 온도로 평형화 한 후, 즉시 39 ° C (nonpermissive 온도)까지 승온 후, 60 ° C로 평형화 된 성장 배지의 15 ㎖에 추가하고 즉시 39 ° C의 물을 용기에 플라스크를 배치 . 문화 매체가 전사의 전원이 켜져 있는지 확인하기 위해 나머지 세포 수확 단계에 걸쳐 39 ° C의 물을 욕조에 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 39 ° C의 물을 용기에 플라스크를 배치 한 후 다른 시간에 세포를 수확. 제 시점의 경우, # 39에 플라스크를 배치 직후에 세포를 수확176; C. 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브를 3 mL를 수확하고 두에 3 ㎖를 배포 할 수 있습니다. 미니 원심 분리기에 10 초 동안 펠렛은 세포 또는 빠른 감속 picofuge 상층 액을 붓는다. </li><li> 즉시 드라이 아이스 / 에탄올 욕에서 또는 액체 질소 중에서 동결 펠릿. 세포가 제로 시점에서 수확 같은 제 시점을 지정한다. </li><li> 실험적으로 관심의 mRNA에 따라 파일럿 테스트하여 세포에 수확 후 시점을 결정한다. 일반적으로, 다음과 같은 시점에서 수확 효모 세포 : 0, 3, 6, 9, 12, 18, ​​25 및 35 분 (도 2B). mRNA의 반감기가 상술 한 시점을 이용하여 판별 할 수없는 경우,이 시점을 조절한다. 예를 들어, 예상 짧은 반감기 mRNA에 대해, 짧은 시간 포인트를 사용하는 (즉, 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12, 18 분) 및 예상 긴 반감기 mRNA에 대해, 확장 시점. </li><li> 전지 후, 하이다RNA 추출이 수행 될 때까지 rvested는 -80 ° C의 냉동고에 저장합니다. </li></ol> 효모 세포 3. 추출 RNA <ol><li> 프로토콜의 RNA 추출 부용, RNases 의해 RNA의 분해를 방지하기의 RNase에게 무료 기법을 사용한다. 의 RNase에게 무료 솔루션, 유리 및 플라스틱 도자기는 RNA의 추출에 사용되는을 준비합니다. </li><li> 표준 프로토콜에 따라 효모 세포에서 RNA를 추출합니다. 일반적으로, 핫 페놀을 사용하는 방법 (12). 대안 적으로, 효모 세포로부터 RNA를 추출하기 위해 사용될 수있는 키트를 사용한다. </li><li> 일반적으로 260에서의 흡광도와 Nanodrop를 사용하여 RNA의 280 2 μl를 측정하여, RNA의 양과 순도를 결정합니다. 농도를 기준 (260)로부터의 RNA의 농도를 측정, 1 μg의 RNA로 희석 / DEPC 처리 된 물을 사용 μL. 참고 : 260의 비율 / t에 대한 정보를 제공합니다 (280)RNA의 고 순도. 260 / 280 비율이 2.0 ± 0.1 인 경우 RNA 샘플은 순수하다. </li></ol> 4. 노던 블롯 분석 참고 : mRNA 수준을 정량화 및 성적 증명서의 크기에 대한 정보를 얻기 위해 북부도 말을 사용합니다. 또한, 같은 mRNA를 여러 이성체의 mRNA를 생산을 검출하는 노던 블롯을 사용한다. <ol><li> 1.0 % 아가로 오스 - 포름 알데히드 젤을 준비합니다. 표준 프로토콜 (12)에 따라 전기 영동으로 아가 로스 포름 알데히드 겔에 샘플 RNA 같은 양을 실행합니다. RNA 샘플과 함께 RNA 사다리를 실행하고 북부 오점에서 감지 된 RNA의 크기를 결정하는 데 사용합니다. 막에 아가로 오스 포름 알데히드 겔에서 분리 된 RNA를 전송하기 전에, 젤에서 RNA 사다리 차선을 절감하고 에티 디움 브로마이드를 사용하여 시각화. 주 : 대안 적으로, 전체 겔 RNA의 전사 전에 티듐 브로마이드로 염색 할 수있다. </li><li>따고 RNA 시료를 겔상의 적절한 간격으로 이주,의 RNase에게 무료 기술을 이용하여 막에 RNA를 옮긴다. 막 12 ~ 13에 RNA를 전송하는 데 사용할 수있는 여러 가지 프로토콜 중 하나를 사용합니다. 막에 RNA를 전송하려면, 겔과 거의 동일한 크기로 잘라 막. 표준 프로토콜 (12)에 따라 RNA를 전송합니다. </li><li> 자외선 제조업체의 지침에 따라 UV 가교 결합제를 사용하여 막에 RNA를 크로스 - 연결합니다. 대안 적으로, 1 시간 동안 80 ° C로 설정된 오븐에 구워 막. 이 특정 프로브에 혼성화 될 때까지 무기한 비닐 봉투에 -20 ° C에서 막을 저장합니다. 주 : 건조 막은 또한 여과지 사이 RT에서 저장 될 수있다. </li></ol> 5. 혼성화 프로브 막에 대한 관심의 RNA에 대한 보완 주 : 멤브레인에 mRNA를 검출하는 방법 중 하나는 P (32) 표지 된 DNA 프로브를 혼성화하는 것이다. 주의 : resea의32 P 작업 rchers는 오염을 방지하기 위해 보호 절차를 사용해야합니다. 방사성 물질의 사용에 대한 제도적 가이드 라인을 따르십시오. <ol><li> 25 라벨에 의해 DNA 프로브를 준비 - DNA의 50 NG는 표준 프로토콜 (12)에 따라 막에 하이브리드합니다. PCR 또는 절단에 의해 플라스미드 DNA 단편을 생성한다. 비법 뉴클레오티드 12 제거한 후 방사성 표지 된 DNA 프로브의 1 μl를 카운트하여 DNA 프로브의 특이 적 활성을 결정한다. </li><li> 42 ° C에서 예열 예비 혼성화 / 하이브리드 버퍼입니다. 막 (12)의 100cm 2 당 예비 혼성화 / 하이브리드 버퍼의 ~ 10ml를 사용합니다. </li><li> 1 혼성화 - 멤브레인 O 혼성화 완충액 1 ㎖ 당 방사성 표지 된 DNA 프로브의 5 × 106 CPM을 / 혼성화 오븐에서 N은 관심 (12)의 mRNA를 검출한다. 하이브리드 동안 하이브리드 오븐 회전 방향에 있는지 확인하는전체 막은 적절한 혼성화를 보장하기 위해, 혼성화 용액에 노출되도록한다. </li><li> 2 × SSPE 50 ㎖, 15 분간 12 배속 SSPE / 2 % SDS 50 ㎖와 65 ℃에서 한 시간 15 분 동안 RT에서 막 두 번 씻는다. 그것을 건조 또는 형광면을 오염시키지 않도록하기 위해 플라스틱 랩 막 감싸. </li><li> 가이거 계수기를 사용하여, 막에 방사능의 강도를 추정한다. 주 :이 추정 멤브레인 시간 적절한 양 형광면에 노출되는 것을 보장한다. 방사능의 낮은 양의 세포막이 더 오래 노출 시간을 사용합니다. </li><li> 북부도 말 들어, RNA 같은 양의 각 지점에로드하는 것을 확인하기 위해 로딩 컨트롤을 사용합니다. 이를 위해 막을 제거하고 프로세스가 검사되는 영향을받지 않는 RNA로 reprobe. XS 박리 액 (0.1 % SDS / 0.01 끓는 200 ㎖을 함유하는 유리 트레이에 배치하여 멤브레인을 벗기고2 분 동안 SC). 제거 솔루션을 붓고 절차를 다섯 번 12를 반복합니다. 참고 :. 로딩 대조군으로 사용 RNA의 예는 SCR1입니다 SCR1 안정적이고 풍부한 RNA 중합 효소 III 성적 증명서입니다 SCR1 RNA 풍부는 RNA 중합 효소 II 억제의 짧은 기간 동안 크게 변경하지 않아야합니다.. </li></ol> 6. 막에 바인딩 된 RNA를 정량화 참고 : 멤브레인 방사능의 양을 정량화 형광면에 막을 노출하기. 적절한 노출 시간 후,은 phosphorimager을 사용하여 형광면을 스캔. <ol><li> 은 phosphorimager의 제조업체가 제공하는 지침을 사용하여 형광체 화면을 검색합니다. </li><li> 각 시점에서 mRNA의 정량화. ImageQuant 소프트웨어 또는 관련 소프트웨어를 사용하여 mRNA 수준을 정량화. 로딩 컨트롤 각 시점에서의 mRNA 정규화. SCR1는로드로 사용 되었다면제어는 SCR1으로 반감기 northerns 정상화. </li><li> mRNA의 반감기는 시각 0에서 mRNA의 존재의 양에 의해 각 시점에서 남아있는 mRNA의 양 (초기 시점)을 나누어 계산한다. semilogarithmic 플롯 (그림 2C)에 대 시간 남은 퍼센트의 mRNA를 그래프입니다. 다음 식에 의해 mRNA의 반감기를 계산한다 : t 1/2 = -0.693 / K (음 0.693) </li><li> k는 추세선의 기울기이고, t 1/2 mRNA의 반감기이다. </li></ol>

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interest.

mRNA의 합성과 새로운 합성의 부재 하에서 mRNA의 회전율을 모니터링 억제 자주 mRNA의 붕괴 속도를 측정하는데 사용되는 방법이다. S.에서 cerevisiae를는 RNA 중합 효소 II의 온도 민감성 대립 유전자를 사용하여 전사를 억제함으로써 mRNA의 붕괴 속도의 측정은 가장 자주 사용되는 방법 중 하나이다. 이 방법은 구체적으로는 RNA 중합 효소 II를 억제한다. 이 기술을 사용하여 mRNA의 붕괴 속도의 결정을위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 1) 효모 세포를 수확하기 전에, 그 전사가 39 ° C에서 문화를 유지하여 차단 된 보장; 2) 프로토콜의 RNA 추출 및 RNA 젤 전기 영동 단계 동안의 RNase없는 기술을 보장하기; 정규화 실험 치료가 예상대로 작동하는지로드 된 RNA의 같은 양을 확인하고 3) 제어 RNA를 사용; 4)의 재현성을 위해 3 회 이상 mRNA의 감쇠율 측정을 반복반감기 측정의 정확도 D. rpb1-1 효모는 일반적으로 전사를 억제하기 위해 37 ° C로 전송됩니다. 그러나, 우리는 전사 37 ° C 억제의 온도 변화 후 2 ~ 3 분을 발생하는 것을 발견했다. 39 ° C의 전사 억제가 즉각적에서 4, 11. 그러나, mRNA의 붕괴 속도를 결정하는이 기술의 사용은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 기본 제한은 특별한 효모가 필요하다는 것이다. 전술 한 바와 같이,이 효모 균주 중 다른 연구실로부터 수득 될 수 있거나 특정 효모 유전 적 배경이 필요한 경우 실험실에서 생성. 효모 균주가 획득되면,이 기술은 단순하고 정직하다. 두번째 제한 방법은 전사를 억제하는 충격을 가열 효모 세포를 노출시키는 것을 수반한다. 열 스트레스는 특정의 mRNA 감쇠율 포함한 세포 과정에 영향을 미칠 수있다. 이들의 mRNA의 감쇠율 그쪽 예컨대스트레스 반응에 관여하는 단백질을 t 인코딩에 영향을 미칠 수 있습니다. 마지막으로, RNA 중합 효소 II에서 돌연변이 효모 균주의 이용은 정상적인 성적 차이점도 대체 전 사체의 생산을 초래할 수있다. 도입부에서 논의 된 바와 같이, 다른 기술 S.에서 mRNA의 붕괴 속도를 측정하기 위해 이용된다 cerevisiae의. 이는 thiolutin 및 1-10 페난 트롤 린 등의 화학 약품을 사용하는 전사의 억제를 포함한다. 그들이 어떤 효모 균주를 사용하여 수행 할 수 있고, mRNA의 붕괴 속도는 또한 게놈 전체 또는 개별 내생 사체에 대해 결정될 수 있다는 점에서 이러한 기술은 유리하다. 또한, mRNA의 감소율 측정은 다양한 생리 학적 조건에서 수행 될 수있다. 이러한 약물의 유틸리티들이 또한 세포 과정에 영향을 차등 적 mRNA를 붕괴 속도에 영향을 줄 수 있다는 사실에 의해 제한된다. 또한, thiolutin 쉽게 구할 때 사용할 수 없습니다비싸다. 이 기술을 습득 한 후, 개별의 mRNA 또는 게놈의 전체 mRNA의 붕괴 속도를 결정할 수있을 것이다. 또한, mRNA의 분해율은 상이한 조건 차분 mRNA의 붕괴 속도에 영향을 줄 것인지를 조사하기 위해 서로 다른 생리 학적 조건에서 측정 할 수있다.

전사 및 특정 mRNA를 붕괴는 유전자 발현의 중요한 결정 요인이다. 합성 및 특정의 mRNA의 붕괴 속도는 특정 mRNA를 정상 상태 수준을 결정합니다. 의 mRNA의 정상 상태 수준의 mRNA의 풍요 로움을 지배하고 단백질 합성에 사용할 수 있습니다 얼마나 많은 각각의 mRNA를 결정합니다. mRNA의 반감기의 측정의 mRNA 붕괴 속도를 결정하기 위해 광범위하게 사용된다. mRNA의, mRNA와 환경 조건에 의해 암호화 된 단백질의 기능의 기능에 관련된 다른 속도 특정 mRNA를 붕괴. mRNA의 붕괴 속도를 판단하기 위해 이용 된 기술에 따라서, 감소율 측정은 전역 적 또는 개별 사체에 대해 결정될 수있다. 효모 S.에서 cerevisiae에 가장 일반적으로 전체 mRNA의 붕괴 속도를 측정하는데 사용되는 기술은 RNA 중합 효소 II 화학 transc의 온도 민감성 대립 유전자를 보유하는 효모 균주를 이용하는 것을 포함이러한 thiolutin 1,10- 페난 트롤 린 1-5 riptional 억제제. 이러한 방법은 또한 개개의 mRNA 붕괴 속도 4를 측정하는데 이용 될 수있다. 다른 방법은 mRNA의 붕괴 속도를 측정하는데 이용 될 수있다. 이러한 방법은 정상 상태 표시 또는 유일한 선택 조건에서 발현되는 규제 프로모터로부터 발현되는 mRNA의 분자의 활용에 대한 접근 방법을 포함한다. 이러한 기술의 각 특정 장점과 제한 사항이 있습니다. 여기에 기재된 기술은 RNA 중합 효소 II의 온도 민감성 대립 유전자를 이용한다. 이 방법을 사용하여 S. cerevisiae의 모델로서, 특정 전사 억제 기술 (6)을 사용하는 다른 시스템들에서 이용되어 변형과 수 있지만. RNA 중합 효소 II의 온도에 민감한 대립 유전자를 사용하여 mRNA의 반감기 측정은 광범위하게 mRNA의 붕괴 4-5의 두 게놈 전체 및 개별 측정에 사용됩니다. 이 기술과 특이의 사용을 필요RNA 중합 효소 II, rpb1-1 1의 온도에 민감한 대립 유전자를 품고 IC 효모 균주. 이 기술에 대한 이론적 근거는 nonpermissive 온도로 온도에 민감한 효모의 노출이 mRNA의 합성을 억제한다는 것입니다. 전사가 억제 된 후에 계속해서, 기존의 mRNA 붕괴가 상이한 시점에서 모니터링된다. 기존의 mRNA 전사 소멸이 해제 된 후에 서로 다른 시간 지점에서 효모 세포로부터 RNA를 추출하여 모니터링된다. 효모 세포를 수확하는 시점은 파일럿 실험에 의해 미리 결정된 및 성적 및 시스템이 연구되고에 달려있다. 긴 시간 점 이상 거주 증명서에 사용하는 동안 더 빨리 시점은, 단명 한 성적 증명서에 사용됩니다. 그 후, mRNA를 붕괴 중 하나 북부 얼룩 분석, 정량적 PCR 또는 RNAseq 모니터링합니다. 테를 사용하여 mRNA의 반감기의 측정RNA 중합 효소 II의 mperature 민감한 대립 유전자는 장점이있다. 첫째,이 기술은 곧장 앞으로 쉽고입니다. 둘째, 효모 균주는 mRNA의 반감기의 측정은 다른 성장 조건을 결정할 수있다 실험실에서 획득되거나 생성되면; mRNA의 붕괴에 대한 환경 영향의 결정을 가능하게한다. 셋째, mRNA의 붕괴 속도는 전체 게놈 모니터링 할 수있다. 다른 전사 억제 기술의 사용은 또한 장점과 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, 유도 성 프로모터의 사용은 조절 된 프로모터의 제어하에 mRNA를 생성하기 위해 서브 클로닝이 필요하다. Thiolutin는 준비되지 않은 때 비싼 사용할 수 있습니다. 또한, 동작 모드의 thiolutin의 완전히 이해되지 않고,이 mRNA를 감쇠 7 억제를 포함하는 다른 세포 과정에 영향을 미치는 것으로보고되었다. 또한, 1,10- 페난 트롤 린은, 더 쉽게 사용할 수 있습니다. 또한, 모든 기술은 PERT 수 전사를 억제하기 위해 사용세포 기능을 URB 별개의 방식으로 서로 다른 mRNA에 영향을 미칠 수 있습니다. 조사원은 가장 신뢰할 수있는 결과를 달성하기 위해 자신의 실험 조건에서 사용하기에 가장 적절한 방법을 결정할 필요가있다. 자신의 애플리케이션에 가장 적합한 방법을 결정하기 위해, 연구원 조사되는 성적 증명서에 의해 코딩되는 단백질의 성적 증명서 및 함수를 식별 할 필요가있다. 가장 신뢰할 수있는 mRNA의 감쇠율 측정은 여러 기술들을 사용하여 동일한 감쇠율을 표시해서 결정들이다. 어떤 하나의 기술은 항상 가장없고, 가장 적당한 방법은 특정 상황에 따라 달라진다. S.에서 많은 연구 cerevisiae의 다양한 조건과 유전 적 배경에서 mRNA의 붕괴 속도를 측정했다. mRNA의 붕괴 속도가 측정되는 조건은 특정 실험 조사를 받고에 따라 달라집니다. 조건이 존재하는지 여부 다른 셀룰러 환경에서의 mRNA 붕괴 속도를 측정하는 것은 결정우선적으로 특정의 mRNA 붕괴 속도에 영향을 조사 하였다. 의 mRNA의 붕괴 속도는 사용되는 효모에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들면, mRNA의 붕괴 속도는 비 기능성 넌센스 매개 mRNA의 분해 (NMD) 통로와 야생형 효모 세포 및 효모 세포에서 결정될 수있다. 이 mRNA의 분해 경로는 지금까지 조사 된 모든 진핵 생물에서 발견되며, 이는 번역 8 조기 종료의 mRNA의 분해를 트리거한다. NMD는 초기에 조기 종료 코돈 또는 넌센스 코돈과의 mRNA를 분해 경로로 확인되었다,하지만 지금은 천연의 mRNA를 포함하는 비 넌센스의 발현을 조절하는 통로로 인식되고 있습니다. 경로의 대상이되는 mRNA를 빠르게 기능 NMD 경로와 효모 세포에서 분해 및 비 기능 NMD 경로와 효모 세포에서 안정화된다. 따라서,이 경로의 직접적인 대상인의 mRNA의 반감기는 야생형 효모에서 CEL 짧다비 기능 NMD 통로와 효모 세포에 비해 LS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1077">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:272px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:479px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Speed Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Genescreen Plus membrane</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>50-905-0169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hybridization Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>95-0030-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphor screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9564-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Typhoon phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29004080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV cross-linker</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>80-6222-31</td>
			<td>Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80&#176; for 1 hour</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:272px;">NorthernMax prehybridization/hybridization buffer&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM8677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation</td>
			<td></td>
			<td>Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mrna decay rates in saccharomyces cerevisiae using rpb1-1 strains

mRNA의 정상 상태 수준은 환경 조건에 따라 달라집니다. mRNA를 정상 상태 축적 레벨의 규정은 단백질의 정확한 양이 특정 셀의 성장 조건에 대해 합성되는 것을 보장한다. mRNA의 붕괴 속도를 측정하기위한 한 가지 방법은 전사를 억제이어서 이미 존재하는 mRNA를 소실을 모니터링. mRNA의 붕괴 속도는 정량화 될 수 있으며, 정확한 반감기는 여러 기술을 이용하여 결정될 수있다. S.에서 cerevisiae의, 반감기가 개발 된 mRNA의 측정 및 RNA 중합 효소 II, rpb1-1의 온도에 민감한 대립 유전자 항구 균주를 사용하여 mRNA의 전사를 억제 포함 프로토콜을 지원합니다. 조절 성 프로모터의 제어하에 mRNA를을 이용하여 반감기는 대안 thiolutin 또는 1,10- 페난 트롤 린, 또는 전사와 전사 억제제를 포함 mRNA의 억제를 측정하기위한 다른 기술,이러한 갈락토스 유도 성 프로모터와 TET 오프 시스템으로. 여기서 우리는 S.의 측정을 설명 RNA 중합 효소 II의 온도에 민감한 대립 유전자를 사용하여 cerevisiae의 mRNA의 붕괴 속도. 이 기술은 개인의 mRNA 또는 게놈의 전체 mRNA의 붕괴 속도를 측정하는데 사용될 수있다.

<html> RNA와 노던 블로 팅을 추출하면서 정확하게 mRNA의 붕괴 속도를 측정하는이 프로토콜의 능력은 기술 된 RNase 자유로운 전사의 억제, 적절한 시점에서 효모 세포 수확, 및 이용에 따라 달라진다. 각각 불안정하고 안정적​​인 것으로 알려진 두 개의 제어의 mRNA에 대한 프로빙 실험을했다 확신을 제공합니다. 예를 들어, 이는 앤 mRNA를 미리 CYH2 모두를 검출 프로브로 프로빙함으로써 달성 될 수의 mRNA.도 2B는 전사 억제 후 상이한 시점에서 야생형과 NMD 돌연변이 효모 균주 CYH2 프리 mRNA를 소실을 보여준다 . CYH2 사전의 mRNA는 작동하지 NMD 통로 (upf1)와 효모 세포에 기능 NMD 통로 (UPF1) 상대적으로 빠른 효모 세포에서 분해된다. 40fig1highres.jpg &quot;/&gt; 1. 방법 흐름도를 그림. mRNA의 붕괴 속도 흐름도 측정 <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52240/52240fig2highres.jpg" /> 도 2 CYH2 mRNA의 반감기가 -pre-mRNA와의 mRNA. (A) CYH2 프리 mRNA와 mRNA의 CYH2. CYH2 프리 mRNA를 개략도 비효율적으로 접합되고 상기 NMD 의해 분해되어 세포질에 이송 될 통로입니다. 가 조기 종결 코돈 (PTC)를 포함 인트론이 없기 때문에 CYH2의 mRNA가 NMD 경로에 의해 분해되지 않습니다. (B) 야생형 (UPF1) 및 NMD 돌연변이 균주 (upf1)에서 추출한 RNA의 반감기 북부 오. TRA 후의 시점nscription 억제는 북부 말 위에 나열되어 있습니다. 말은으로 프로빙 된 방사성 표지 CYH2 DNA. (C) %의 CYH2 사전 mRNA를 야생형 (UPF1) 및 NMD 돌연변이 균주 (upf1) 시간 대 남아의 그래프. 이 그래프는 CYH2 사전 mRNA를 NMD 돌연변이 효모 균주 (upf1)보다 야생형 (UPF1)에 빠른 속도로 분해되는 것을 도시한다.

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Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

특정의 mRNA의 정상 수준은 mRNA의 합성과 부패의 속도에 의해 결정된다. 전체 게놈 mRNA의 분해율 또는 특정의 mRNA 붕괴 속도는 mRNA의 반감기를 측정함으로써 측정 할 수있다. 이 프로토콜은 사카로 미세스 세 레비 시아에서 mRNA의 붕괴 속도의 측정에 초점을 맞추고있다.

mRNA의 붕괴 요금의 측정에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em사용&gt;<em&gt; rpb1-1</em&gt; 균주

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

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Universidad San Sebastian

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Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Unit 1

Translation: RNA to Protein

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12.5K 조회수.  Baylor University.  특정의 mRNA의 정상 수준은 mRNA의 합성과 부패의 속도에 의해 결정된다. 전체 게놈 mRNA의 분해율 또는 특정의 mRNA 붕괴 속도는 mRNA의 반감기를 측정함으로써 측정 할 수있다. 이 프로토콜은 사카로 미세스 세 레비 시아에서 mRNA의 붕괴 속도의 측정에 초점을 맞추고있다. 

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

의 해부 Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

연구

생물학

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

지방산의 정량 Phosphoproteomics은 자극 Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

의 낭성 섬유증의 Transmembrane의 전도성 조절 단백질의 표현과 정제 Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

로 표현 낭포 성 섬유증 막 횡단 전도력 규칙 단백질의 정제<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR은의 보조 인자 (cofactor)의 산화 환원 적정​​을 모니터링<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

화학 유전자 상호 작용의 신속한 식별<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

진화 방법에 감독<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).