Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области ВИЧ, такие как выявление детерминантов передачи вируса и патогенеза в двух наиболее эффективных органах инфекции. В самом деле, ключевые передовые вождения прогрессирования болезни происходят в тканях. Особенности и сложность инфекции плохо отражаются клетками в циркуляции или изолированы и инфицированы в пробирке.
Основным преимуществом культуры тканей ex vivo для изучения патогенеза ВИЧ является то, что он сохраняет свои оригинальные спациальные и функциональные отношения между клетками, хотя и в течение двух-трех недель. Для начала заполните 100-миллиметровую чашку Петри 20-миллиметровыми 20-30 миллилитров CMT. Перенесите желатиновые губки в чашку Петри с помощью стерильных типсов.
Влажные губки с обеих сторон и позволяют губки, чтобы впитать средний в течение одной минуты. Прижимайте губки к нижней части чашки Петри около двух минут с помощью стерильного шпателя. Используйте стерильные ножницы, чтобы разрезать регидратированные губки желатина на кусочки одинакового размера около одного квадратного сантиметра.
Затем используйте типсы, чтобы передать один кусок губки в каждый колодец культурной пластины. Добавьте от трех до четырех миллилитров CMT в каждый колодец 6-хорошо пластины для миндалин и один миллилитр на колодец в 12-хорошо пластины для шейки матки. Поместите пластины в инкубатор, установленный на 37 градусов по Цельсию, 5%CO2, и больше, чем или равна 90% влажности, пока ткани explants готовы быть загружены на губки.
Перенесите миндали из транспортного контейнера в 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую от 10 до 20 миллилитров CMT с помощью стерильных типсов. Используйте крышку чашки Петри в качестве режущей поверхности для вскрытия ткани. Держа ткань нежно с тисью, разрезать каждый миндалин на разные, большие куски с помощью стерильного скальпеля и лезвия.
Используйте типсы и скальпель для удаления прижигаемой, кровавой и миомной ткани, а также любых частей, содержащих тонзилолиты или зеленовато-коричневого цвета. Разрежьте каждый кусок ткани на кусочки толщиной около двух миллиметров. Удалите любую нежелательную часть, как на предыдущем шаге.
Затем разрежьте ломтики ткани на полоски толщиной в два миллиметра. Наконец, разрежьте полоски ткани на блоки толщиной в два миллиметра. Перенесите экспланты в новую 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую от 10 до 20 миллилитров CMT, чтобы избежать высыхания тканей при переходе к вскрытию.
В конце вскрытия закружить пластину, чтобы рандомизировать распределение explant. Поместите девять тканей explants на верхней части каждого желатина губки в 6-хорошо пластины с использованием типсов, что позволяет пространство между ними. Верните тарелки в инкубатор.
Как правило, экспланты культури на ночь. Прививка от ВИЧ проводится на следующий день. Это делается для того, чтобы убедиться, что ни одно бактериальное или грибковое загрязнение не развивается в культуре.
Кроме того, клетки, как правило, регресс ткани explants сразу после вскрытия. Аспирировать среду в 6-хорошо пластины с пипеткой, и выбросить его в контейнер с дезинфицирующим раствором. Наклоните пластину и осторожно нажмите желатин губки в верхней части хорошо, чтобы среда собраться в нижней части.
Аспирировать и отбрасывать среду. Затем добавьте три-четыре миллилитров CMT к каждому хорошо. Сейчас оттаивает препарат от вируса ВИЧ-1 в водяной бане при 37 градусах Цельсия.
Pipette вирус inoculum непосредственно на вершине каждого из девяти explants на желатин губки. Верните тарелку в инкубатор. Используйте крышку чашки Петри в качестве режущей поверхности для вскрытия ткани.
Держа ткань мягко с типсами, отделить слизистую оболочку эктоцервикса и / или эндоцервикса от нижней стромальной и субмукосы скальпелем и лезвием, чтобы получить полоски слизистой оболочки. Вырежьте слизистую оболочку на полоски шириной в два миллиметра. Удалите и отбросьте как можно больше субмукосы, оставив только двухмиллиметровый слой ткани.
Затем разрежьте полоски на блоки толщиной в два миллиметра. Передача ткани explants в новый 100 миллиметров Петри блюдо, содержащее от 10 до 20 миллилитров CMT, чтобы избежать высыхания тканей при переходе с вскрытием. В конце вскрытия закружить пластину, чтобы рандомизировать распределение explant.
С помощью стерильных типсов перенесите экспланты в стерильные 1,5 миллилитровые конические трубки. Удалите любую среду в трубке с помощью пипетки. Для достижения оптимальных результатов, экспланты шейки матки должны быть обработаны и инфицированы как можно скорее после операции, в идеале в день операции.
Кроме того, ткани могут храниться погруженными в CMT при 4 градусах ночью и инфицированными сразу после вскрытия. Оттепель препарат ВИЧ-1 в водяной бане при 37 градусах по Цельсию. После размораживания перенесите вирус в трубки, содержащие экспланты.
Перенесите трубки в термошакер и инкубировать в течение двух часов при 37 градусах по Цельсию при 300 об/мин. Аккуратно инвертировать трубки несколько раз каждые 30 до 60 минут. Между тем, заполнить 6-хорошо пластины с трех до четырех миллилитров на колодец стерильных фосфатов буферного солевого раствора.
В конце инкубации с ВИЧ-1, используйте пипетку, чтобы отказаться от всех вирусных препаратов в трубках, содержащих explants в контейнер с дезинфицирующим раствором. Затем используйте типсы и пипетки для передачи explants в 6-ну пластины, содержащей PBS. После позволяя explants отдохнуть в PBS в течение одной минуты при комнатной температуре, мыть их, мягко трубопроводов PBS вверх и вниз в колодец два-три раза.
Затем выбросьте PBS в контейнер с дезинфицирующим раствором с помощью пипетки. Добавьте три-четыре миллилитров нового PBS к каждому хорошо. Повторите еще два раза в общей сложности три моет.
Отбросьте PBS как раз перед передачей explants к губкам для того чтобы во избежание высыхание ткани. Теперь используйте типсы для передачи от пяти до восьми эксплантов поверх каждой желатиновой губки в пластину из 12 колодец. Верните тарелку в инкубатор.
Соберите образец культуры среды с пипеткой, и передать его в стерильные 1,5 или два миллилитров винт крышка трубки для хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Урожай ткани explants с стерильными типсами, и передать explants в стерильные 1,5 или два миллилитров винт крышка труб. Обработать или хранить образцы тканей, как того требует эксперимент.
Аспирировать остаточную культурную среду в колодец пипеткой и выбросить в контейнер с дезинфицирующим раствором. Наклоните пластину и осторожно нажмите желатин губки в верхней части хорошо, чтобы среда собраться в нижней части, а затем аспирировать и отказаться от него. Теперь добавьте от трех до четырех миллилитров культуры среднего к каждому хорошо.
Используя стерильные типсы, верните любые ткани explants, которые упали в среду желатин губки, прежде чем вернуть пластину в инкубатор. По окончании культуры утилизировать все биологические отходы в уместных контейнерах в соответствии с правилами института по обработке опасных биологических веществ, а также конкретной оценкой риска. Вариабельность межкора доноров может повлиять на репликацию ВИЧ-1, измеряемую концентрацией белка p24- вируса ВИЧ в супернатанте культуры эксплантирования тканей ткани матки, как это было продемонстрировано для тканей шейки матки от трех различных доноров, инфицированных одним и тем же вирусом инокулума.
Для первого донора, накопление р24 кляп в культуре среды explants инфицированных ВИЧ-1 BaL только четко указывает на продукт инфекции. Антиретровирусный препарат 3TC, который полностью отмахився от репликации ВИЧ, был использован в качестве отрицательного контроля. Количество р24 кляп измеряется в культуре среды 3TC-обработанных эксплантов показывает, доля вируса inoculum асспецифически поглощается и высвобождается ткани explants во время культуры.
В ткани explants от второго донора, ВИЧ-1 кишечная инфекция приводит к устойчивому снижению концентрации р24 кляп с течением времени, что свидетельствует о прерывание инфекции или обнаружить p24 кляп количественно. Это подтверждается 3TC-обработанными контрольными эксплантами, которые показывают аналогичную кинетическую репликацию ВИЧ. Инфекция тканевых эксплантов от третьего донора дает малое количество вируса.
В этом случае включение лечения 3TC в качестве отрицательного контроля необходимо для установления наличия инфекции с производством вируса de novo. Следуя этой процедуре, аналитические методы, такие как цитометрия потока или иммуностепенирование, могут быть выполнены в разные моменты времени, чтобы ответить на вопросы о фенотипе, пропорции или расположении тканей группы клеток, представляющих интерес. При разработке эксперимента важно оценить влияние вариативности между донорами на экспериментальное считывание выбора.
Вариабельность между донорами может быть частично контролируемо путем установления строгих клинических и, возможно, экспериментальных критериев включения и исключения. Культуры ex vivo тканей человека могут быть использованы для изучения патогенеза микробов, помимо ВИЧ, таких как вирус вакцины или вирусы герпеса. Они также используются в качестве доклинтической платформы для исследований токсичности и этики противомикробных препаратов.
Пожалуйста, имейте в виду, что все человеческие образцы, даже от здоровых людей, может гавани инфекционных агентов. Соответствующее образование, обучение и защита необходимы для обработки человеческих тканей для обеспечения безопасности вас и ваших коллег.
