Для этого метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области воспаления и иммунологии. Например, что такое молекулярный механизм адгезии лейкоцитов и транс-эндотелиальной миграции. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет неограниченное использование дискриминации между трансмиграции и сильное добавление моноцитов к эндотелиальной монослой.
Хотя этот метод предоставляет информацию о наборе моноцитов на поток, он также может быть адаптирован к другим клеткам гематопоэтических систем, таких как Т-клетки, В-клетки, или производные субпопуляции из них. После мытья, этикетка пупочной вены эндотелиальных клеток или HUVEC с 30 микролитров 37 градусов по Цельсию M199 среды дополняется одним микромолярной CMFDA в течение 10 минут при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. В конце инкубации, мыть клетки с 150 микролитров полного M199 среды и инкубировать культуру в 150 микролитров свежей полной M199 среды в течение еще 30 минут.
Затем замените супернатант 150 микролитров полного носителя M199, содержащего соответствующие экспериментальные добавки, и верните культуру слайд-камеры в инкубатор на шесть часов. Для изоляции моноцитов PAN человека разбавляйте свежесобранный образец крови в PBS, дополненный одним миллимоляном ЭДТА при соотношении один к одному, и тщательно слой 20 мл раствора крови на 20 мл градиентной среды плотности для разделения градиента плотности центрифугации. Соберите средний слой моноядерных клеток периферической крови в новую трубку объемом 50 мл, содержащую 40 мл PBS, дополненную 1 миллимолярем EDTA, и довнесите окончательный объем до 50 мл с дополнительным PBS-EDTA После подсчета, изолируйте моноциты с комплектом изоляции моноцитов PAN в соответствии с инструкцией производителя.
И мыть клетки три раза в M199 среды дополняется 0,5%Bovine сыворотки Альбумин, или BSA, чтобы устранить любые следы EDTA. Качество изоляции моноцитов имеет решающее значение для обеспечения надежного трансмиграции и результатов адгезии. Таким образом, важно строго следовать рекомендации производителя для изоляции.
Повторное увеличение гранул в 6 раз от 10 до 6 моноцитов на мл концентрации в свежем M199 среды дополняется 0,5%BSA и разделить клетки на один 200 микролитер aliquot на микроцентрифуг трубки на набор анализа. Затем поместите клетки на 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут до их инъекции в камеру потока. Чтобы подготовить жидкостную систему к анализу, сначала вставьте мужской сочные разъемы в один конец 8 см длиной 3 мм толщиной кусок силиконовой трубки и подключить другой конец к рядному набору впрыска люэра.
Затем подключите разъем люера к одному концу 40 см в длину 3 мм толщиной кусок силиконовой трубки. Далее, 20 мм шприц на один конец 1 м в длину 3 мм толщиной кусок силиконовой трубки и вставить мужской люер разъем на другой конец. Затем вставьте оба мужских люер разъемы в женский люер блокировки парой и место свободный конец силиконовой трубки в резервуар 37 градусов по Цельсию M199 среды дополнен 0,5%BSA.
Увяните поршень, чтобы заполнить трубы с буфером потока и обеспечить шприц на шприц насоса. Затем установите насос в режим вывода и укажите скорость потока. Чтобы соединить слайд-камеру, зажим силиконовой трубки вокруг самки люер блокировки парой и отключить два люер разъем мужчин от парой, чтобы позволить им быть подключены к резервуару слайда.
Воздушные пузырьки не только нарушают качество изображения, но и вызывают капиллярный стресс для клеток, что приводит к гибели клеток. Чтобы избежать пузырьков воздуха, подтвердите правильное зажим трубки перед вставкой люера в резервуар. Затем удалите зажимы, чтобы подтвердить, что соединение не протекает, и поместите слайд под микроскопом.
Для визуализации набора моноцитов под потоком добавьте 5 микролитров конъюгированных антител против CD16 и соответствующий ядерный краситель для каждого алицита моноцитов в течение 10 минут инкубации при комнатной температуре и соберите клетки с краткой центрифугации. Перезаполнить гранулы в 250 микролитров буфера потока и начать шприц насоса. Добавьте 30 микролитров одной моноцитной подвески в одну камеру слайда и выберите цель 40X на конфокальцаторе.
Активируйте соответствующие флуоресцентные лазеры и используйте камеру с помеченным моноцитом, чтобы установить параметры приобретения конфокального микроскопа Next, выберите три поля зрения в радиусе полуметра для многопозентной конфоканной визуализации, а также установите стек в диапазоне от 10 до 12 микрометров и приобретение промежутка времени для запуска каждую минуту. После трех минут визуализации ввимите 200 микролитров моноцитов через порт инъекций inline luer и начните визуализацию клеточного взаимодействия. После по крайней мере 30 минут, остановить изображение и поток и зажим трубки, чтобы позволить ему быть отключен от слайда.
Чтобы определить скорость трансмиграции клеток через стимулируемые HUVECs, открытое изображение J и подсчитать общее количество адептов моноцитов в каждом поле, чтобы определить количество клеток на квадратный миллиметр. Затем подсчитайте количество трансмигратных моноцитов, которые присутствуют в базальной плоскости под эндотелиальными клетками, как это определено наличием зоны черной дыры вокруг ядра. Простой способ проверить состояние активации HUVECs после стимуляции является визуализация их удлинение при воспалительном стрессе.
Конфокальные изображения замедленного действия позволяют визуализировать моноциты на апической плоскости, где можно оценить их фенотип. Мигрирующие клетки, проходящие трансмиграционный процесс, перемещаются на межклеточный стык, прежде чем исчезают из апической плоскости и вновь появляются в базальной плоскости. Количественная оценка набора моноцитов с течением времени подтверждает, что за адгезией моноцитов следует трансмиграция.
Скорость трансмиграции CD16 положительные моноциты является низким, когда эндотелиальные клетки стимулируются с TNF альфа только, но увеличивается, когда эндотелиальные клетки стимулируются как СНФ альфа и сосудистого эндотелиального фактора роста или VEGFA. СТИМУЛЯЦИя HUVEC с помощью альфа-TNF и альфа-TNF плюс VEGFA вызывает увеличение присоединения к CD14 отрицательных Т, В и НК-клеток, по сравнению с CD14 положительные моноциты. Кроме того, стимуляция HUVEC вызывает трансмиграцию популяции моноцитов только, так как Т, В и НК клетки не трансмиграции ни в TNF альфа или TNF альфа плюс VEGFA стимулирующих условиях.
Для выполнения оптимального анализа набора моноцитов, важно, что вы планируете свой эксперимент заранее и сделать это в тот же день. И когда вы очищаете клетки, убедитесь, что ваш микроскоп находится на 37 градусов, так что вы не перенести клетки к разной температуре во время эксперимента. Чтобы узнать эту процедуру, все методы, такие как профилирование цитокинов HUVEC и экспрессии хемокинов, а также исследования хемотаксиса могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительный вопрос о молекулярном механизме, который поддерживает трансмиграцию и адгезию специфической популяции моноцитов.
