Этот метод может помочь ответить на несколько вопросов в методе злокачественности поле о характеристике клетки, которые инициируют злокачественные новообразования. Основным преимуществом этого метода является то, что он обеспечивает основу для функционального анализа этих раковых стволовых клеток. Последствия этого метода распространяются на то, где терапия миелодиспластических синдромов или MDS, так как она может помочь в выявлении болезни инициируя клетки.
Чтобы подготовить реципиентов к приему, за неделю до пересадки предоставьте стерильную воду, дополненную 100 миллиграммами на литр ципрофлоксацина, чтобы конгенный реципиент ANIMALS в течение семи дней в конкретном, патогенном свободном животном объекте. На седьмой день, есть обученный, сертифицированный оператор цезия 17 установить цезий исходный инструмент для доставки 70 centigrayS общего тела гамма-излучения в минуту. Поместите 10 мышей в специально разработанный держатель.
Вставьте держатель в камеру облучения, доставить 9 серых общего облучения тела в 13 минут. Затем верните животных в свои клетки. На следующее утро, спрей 70 процентов этанола в течение всего двух-шести моли старый C57 черный шесть мышей и использовать ножницы, чтобы удалить кожу из таза в лодыжки.
Используйте типсы с ножницами, чтобы удалить бедренную кость и голени. Чисто обрезать мышцы от костей. Вырезать проксимальные и дистальные концы для голени и забрать одну голени с типсами.
Вставьте трехми миллилитровый шприц, оснащенный иглой из 27 гейгов, в полость костного мозга и смойте костный мозг в 14 миллилитровую круглую нижнюю трубку, содержащую 2,5 миллилитров буферного солевого раствора Hanks, дополненного сывороткой из 2%fetal bovine или HF2. Когда весь мозг был собран, аспирировать ткани несколько раз через 20 гаге иглы кончик разогнать массу костного мозга в одну суспензию для подсчета. Для обозначения нуклеатических клеток костного мозга, или BMNC, для сортировки потока, соберите клетки центробежной и повторно приостановить гранулы в один раз десять-седьмой BMNC на 90 микролитров концентрации HF2.
Затем добавьте десять микролитров биотинилированного антилинико-антитела к клеточной суспензии в течение 20 минут инкубации при 4 градусах Цельсия. Затем центрифуга мыть в трех миллилитров PBS. Повторно приостанавливайте гранулы в 100 микролитров HF2 в один раз десять до седьмой клетки.
Во-вторых, этикетки клеток с двумя микролитерами APC спрягают анти биотин антитела. После 20 менуэтов при четырех градусах Цельсия, защищенных от света, мыть клетки в три миллилитров свежего PBS. Повторно приостанавливайте гранулы в HF2, дополненные 0,2 микрограмма на миллилитр йодида пропидия на льду.
Теперь откалибровать сортатор клеток цитометрии потока с помощью неокрасленных клеток для оптимизации всех фотомультипьерных труб, рассеяния и параметров флуоресценции в линейном диапазоне каждого детектора. Приобрети три образца из 10 000 ячеек для неоцеличных, PI помеченных и анти-линии APC помеченных клеток. В конце сортировки проанализируйте 1000 ячеек из каждого образца, чтобы подтвердить чистоту и жизнеспособность отсортированных клеток.
Спин вниз образцы в центрифуге. Затем повторно приостановить гранулы в 0,5 миллилитров HF2 для подсчета. Для принятия передачи отсортированных клеток, смешать 100 микролитров в два раза в пятый дикий тип BMNC от con genic получателя животных в стерильных HF2.
С 100 микролитров от двух до пяти раз десять к четвертому отсортированный донор BMNC интерес в стерильных HF2 в микро центрифуге трубки на животное-реципиент. Загрузите один миллилитровый шприц, оснащенный 28 gage на получателя с 200 микролитров клеток. Затем поместите мышей-реципиентов под тепловую лампу, чтобы вызвать расширение хвостовой вены.
Доставка клеточных смесей каждому смертельно облученного животного-реципиента через хвостовую вену. По мере того как самообувечивание стволовой клетки ограничено к линии отрицательному одичалому типу BMNC, линия отрицательная, низкая линия положительная, и положительные клетки высокой линии сортированы и пересажены в одичал-типа реципиенты для того чтобы обусловить емкость возобновления собственной стороны каждой населенности клетки. Приемно пересаженные донора транс генетической BMNC от MDS модели животных можно отличить ex vivo по их CD45.2 выражение поверхности поверхности клетки маркера.
Через 16 недель после трансплантации линии отрицательных BNMC, или несортированных BMNC от трансгенных животных-доноров MDS, трансгенные клетки из конкурировать диких клеток типа, о чем свидетельствует увеличение доли CD45.2 положительных донорских клеток, наблюдается в периферической крови смертельно облученных животных-реципиентов. Здесь показаны клетки из лейкемической трансформации из мыши, пересаженной с трансгенными клетками MDS. Обратите внимание на наличие многочисленных взрывов и незрелых форм.
При попытке процедуры, важно помнить, чтобы ограничить время ex vivo манипуляции, так как это может поместить неоправданную нагрузку на клетки, что приводит к гибели клеток или функциональной потери. После его развития этот метод прокладывает путь для исследователей в полевой программе, для внося в злокачественные новообразования для изучения источника заболевания у генетически модифицированных мышей.
