Научно-исследовательская область Шигелла в настоящее время не имеет четко определенных анализов для изучения функциональной роли антител, генерируемых иммунизацией или инфекцией. Этот анализ представляет собой четко определенный метод, чтобы квалифицировать эти иммунные реакции и измерения бактерицидной активности Shigella конкретных антител. Основным преимуществом этого анализа является то, что он позволяет провести высокий пропускной анализ нескольких образцов.
Методы, используемые в этом протоколе значительно сократить практическое время и общее время анализа для измерения прямого бактериального убийства антител и образцов сыворотки. Для начала инкубируйте образцы в теплой водяной бане при температуре 56 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы нагреть и активировать тестовые образцы. Получить анализ пластины и 20 микролитров анализа буфера для столбцов от одного до двенадцати строк через G.Add 20 микролитров анализа буфера для столбцов один и два строки H.Load 30 микролитров каждого образца теста и дублировать строку H анализа пластины.
Для начала трехкратного последовательного разбавления тестовых образцов используйте многоканарную пипетку для удаления 10 микролитров из скважин 3H до 12H. Передача образцов в соответствующие скважины подряд G и пипетки вверх и вниз от 8 до 10 раз, чтобы смешать образец хорошо. Затем удалите из этих скважин 10 микролитров.
Передача в соответствующие скважины подряд F и пипетки вверх и вниз от 8 до 10 раз, чтобы смешать. Продолжить этот серийный процесс разбавления через ряд A.After смешивания скважин подряд, удалить и отбросить 10 микролитров из скважин 3A через 12A, так что окончательный объем во всех скважинах составляет 20 микролитров. Получить один флакон замороженных целевых бактериальных запасов и разморозить его при комнатной температуре.
Затем разбавьте бактерии в 20 миллилитров буфера анализа. в соответствии с предопределенным оптимальным фактором разбавления. Используя многоканарный пипетку, добавьте 10 микролитров разбавленных бактерий к каждому колодец анализной пластины.
Получить один флакон замороженных Baby Кролик Комплимент и один флакон замороженного тепла активирован BRC. Используйте холодную проточной водой, чтобы разморозить флаконы до комнатной температуры. Затем смешайте 100 микролитров активированного тепла BRC с 400 микролитров буфера анализа.
Добавьте 50 микролитров этого 20-процентного теплового активированного раствора BRC ко всем скважинам в столбце один. Смешайте один миллилитр родного BRC с четырьмя миллилитров анализа буфера. Добавьте 50 микролитров этой 20-процентной смеси ко всем скважинам в столбцах от двух до двенадцати.
Поместите тарелку один шейкер пластины в течение 10 до 15 секунд, чтобы аккуратно смешать анализ пластины. Инкубировать анализ пластины в микробиологическом инкубаторе в течение двух часов. Между тем, удалить крышки из двух пластин LB Агар и поместите пластины лицом вверх в шкаф биологической безопасности в течение 40 до 60 минут, чтобы высохнуть.
Когда инкубация завершена, перенесите анализную пластину на мокрый лед и инкубировать в течение 10-20 минут, чтобы остановить реакцию. Используя 12 каналов пипетки, смешать скважины в ряд H и пятно пластины 10 микролитров реакционной смеси на дно пластины LBA. Немедленно наклоните пластину и дайте пятнам пробежать от 1,5 до 2 сантиметров.
Повторите эту процедуру для строк G, F и E, заметив их выше предыдущего ряда. Инкубировать пластины LBA при комнатной температуре до тех пор, пока раствор не впитается в пластины LBA. Затем положите крышки на пластины и перенесите их вверх дном в микробиологический инкубатор, чтобы инкубировать на ночь.
На следующий день добавьте 25 миллилитров наложения Агара при 55 градусах по Цельсию, содержащих 100 микрограмм на миллилитр ТТК и 0,1 процента азида натрия к каждой пластине LBA. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов, чтобы позволить выживших бактерий развивать красный цвет. Затем используйте цифровую камеру для фотографирования пластин.
Перенесите изображения на компьютер и используйте программное обеспечение NIST integrated Colony Enumerating для анализа изображений, изложенных в текстовом протоколе. Представитель пластин LBA демонстрирует, что развитие цвета произошло после ночного инкубации и добавления наложения, при этом все оставшиеся в живых колонии были видны красным цветом. Бактериальное убийство хорошо видно для всех образцов, протестированных в первых трех разбавлениях.
Снижение бактериального убийства рассматривается как образцы разбавляются дальше вверх по пластине и сыворотка менее концентрированной. Микроколонии затем выполняются с помощью программного обеспечения NIST. Затем рассчитывается среднее количество CFU для каждого разбавления каждой выборки, а также 50-процентное значение убийства.
Это 50-процентное значение убийства затем применяется к средним CFUs для каждого разбавления сыворотки, чтобы определить значения, необходимые для расчета SBA KI. Этот протокол опирается на последовательное и равномерное бактериальное покрытие на LB Auger. Хорошее точечное покрытие и техника наклона позволят обеспечить рост дискретных микроколоний и точного подсчета колоний. Этот метод использует живую вирулентную шигеллу и требует соответствующей асептической техники и СИЗ, чтобы обеспечить безопасное обработание бактерий в соответствии с процедурами BSL 2.
