Во всем мире диагностика внелегокого туберкулеза часто задерживается, так как требует хирургического вмешательства для подтверждения из-за неспецифической клинической презентации и низкой производительности диагностических тестов. Для улучшения серологических диагностических тестов на антигены микобактерий туберкулеза мы разработали супер-парамагнитные нанопробы оксида железа для выявления внелегочного туберкулеза. Нанопробы TB-SPIO могут обеспечить точные магнитно-резонансные изображения в низких концентрациях из-за их парамагнитных свойств, не вызывая аутоиммунных реакций.
Нанопробы ТБ-СПИО позволяют нацеливать и выявлять инфекцию микобактерий туберкулеза. Они также могут быть применены в качестве контрастного агента МРТ для выявления других заболеваний. Перед попыткой протокола обязательно изучите протокол, так как в каждой части эксперимента используется определенная основная технология.
Визуальная проявить метод может помочь ученикам понять, как реализовать процесс, особенно для некоторых из более сложных экспериментов. Для подготовки декстран покрытием оксида железа магнитных наночастиц, энергично объединить пять миллилитров декстрана T40 с 45 миллиграммов аквеозного феррного хлорида гексагидрата и 32 миллиграммов ферросхлорид тетрагидрата решений при комнатной температуре. Быстро добавьте 10 миллилитров гидроксида аммония и используйте батончик для перемешивания полученной черной подвески в течение одного часа при комнатной температуре.
В конце перемешивания инкубации, центрифуга раствора и удалить агрегаты. Чтобы отделить конечные продукты SPIO от несъединого декстрана T40, загрузите всю пятимильную реакционную смесь на 2,5 на 33-сантиметровый гель фильтрации хроматографического столба и улейте декстран 0,1-моляром ацетата натрия и 0,15-м моляром хлоридного раствора хлорида натрия. Затем соберите очищенные оксид железа с декстрановым покрытием магнитные наночастицы в объеме пустоты и проанализуй колонку eluates для железа и декстрана на 330 и 490 нанометров в соответствии со стандартными протоколами.
Для создания СПИО-конъюгированных антител к поверхности микобактерий туберкулеза сначала синтезирует ангидрид СПИО-EDBE-succinic путем смешивания 10 миллилитров щелочного раствора СПИО-ЭБДЭ с одним граммами сучинового ангидрида в течение 24 часов при комнатной температуре. На следующий день используйте от 12 000 до 4 000 молекулярных разреженных молекулярных пористых мембранных труб для дилизирования раствора с 26-часовой сменой двух литров дистиллированной воды на изменение. После последнего изменения добавьте 100 микролитров полученного раствора в 400 микролитров 4,5 миллиграмма на миллилитр антитела поверхности туберкулеза, а затем добавление 1-гидроксибензотриазола и бензотриазола-1-илокси трипиролидинофосфона гексафторофосфата в качестве катализаторов при комнатной температуре в течение 24 часов с перемешиванием.
Отделяйте растворы от несвоеблимого антитела с помощью хроматографии фильтрации геля, используя PBS в качестве буфера. Чтобы определить средний размер частиц, морфологию и распределение размеров, бросьте композитную дисперсию на 200-сетчатую медную сетку и высушите образец при комнатной температуре перед загрузкой на электронный микроскоп передачи для визуализации на 100 киловольт. Для измерения значений времени релаксации нанопроб, используйте ядерный магнитный резонанс релаксометра на 20 мегагерц и 37 градусов по Цельсию плюс-минус один градус.
Для нанопробой импульсной клеточной визуализации, сначала культивировать человека THP-1 моноцитов в соответствии со стандартными протоколами культуры клеток. Когда клетки достигли соответствующей стадии активации, preincubate один раз от 10 до семи моноцитов с 1 раз 10 до шестой колонии формирования единиц Mycobacterium bovis BCG в течение одного часа. В конце инкубации перенесите клетки в одноми миллилитровые микроцентрифуговые трубки и добавьте два миллимолара поверхности туберкулеза SPIO Mycobacterium, конъюгированные антителами нанопробы в каждую трубку в течение одного часа инкубации при 37 градусах цельсия и 5%углекислом газе.
В конце инкубации, собирать клетки центрифугации и повторно гранулы в 200 микролитров свежей среды. Затем сканируйте образцы с помощью быстрой градиентной последовательности импульса эхо через магнитно-резонансную томографию 3.0-T, чтобы определить специфичность и чувствительность нанопроб. Чтобы привить экспериментальных животных с M.bovis BCG, сначала восстановить лиофилизированную вакцину или бактериальный запас в среде Саутона и разбавить восстановленный раствор запасов солевым раствором.
Затем загрузите 100 микролитров раствора в один одномиллилитровый шприц на животное и ввелите весь объем бактерий внутрикорсно в левую или правую спинную лопатку каждой мыши. Для виво магнитно-резонансной томографии живых нанопроб-инъекционных животных, приобрести базовые T2-взвешенные быстрые спин-эхо изображения каждого обезболивающего экспериментального животного, прежде чем вводить два наномолярных зондов антител SPIO-TB приостановлено в 200 микролитров солевого раствора в хвостовой вены каждой мыши. Затем, изображение животных снова сразу после инъекции и каждые пять минут в течение следующих 30 минут.
В конце сеанса визуализации количественно проанализируйте все магнитно-резонансные изображения, используя интенсивность сигнала в качестве измерения определенных областей, представляющих интерес в сопоставимых местах центра грануломы М.Туберкулеза и задней мышцы, прилегающей к области грануломатиса. Затем используйте формулу для расчета относительных улучшений сигнала с помощью измерения интенсивности сигнала до и от нуля до трех часов после инъекции контрастных агентов. Через месяц после прививки, собирать ткани из интрадермальной прививки сайта каждого животного и пятно формалин фиксированной парафин-встроенных от пяти до 10-микрометра толщиной образцов тканей с гематоксилин и эозин, йель-Neelsen пятна для кислотно-быстрых бактерий, и Берлин синий для железа.
Передача электронной микроскопии spiO-TB поверхности антител нанопроб показывает, что нанопробы демонстрируют хорошо рассеянный вид со средним размером 3,8 плюс-минус 0,4 нанометров на ядро. M.bovis BCG и кислотно-быстрый бактериальный штамм могут быть обнаружены через окрашивание Кель-Нилсен. После изоляции и культуры с зондами, содержащими железа, бактерии могут быть определены через Берлин синий окрашивания.
Степень таргетирования ТБ поверхностных антител SPIO-TB может быть определена с помощью T2-взвешенной магнитно-резонансной томографии, о чем свидетельствует снижение интенсивности сигнала в присутствии нанопроб, которое происходит в зависимости от концентрации. У животных, вводимых в нанопробе, T2-взвешенное повышение снижения сигнала в областях M.tuberculosis granulomatis примерно в 14 раз выше, чем у контрольных участков. Через месяц после заражения, организованная подкожная гранулома может наблюдаться в нанопробе вводили C57 черный 6 мышей с новой васкуляризации крови и лимфоцитов и эпителиоидных макрофагов агрегатов отметил в этих поражений.
Положительное выражение M.tuberculosis также наблюдается в гранулематозных областях с кислотно-быстрыми бакильными окрашиваниями в месте поражения. Берлин синий, железа феррик положительное пятно, также может быть использован для определения чувствительности зондов к туберкулезу. Для виво магнитно-резонансного изображения жизни, нанопроб-инъекционные животные приобретают базовый T2-взвешенный быстрый спин-эхо изображение каждого обезболивающего экспериментального животного, прежде чем вводить зонды антител SPIO-TB. Теперь, когда мы создали метод SOP для выявления внелегкого туберкулеза, эти антитела могут быть использованы специально для диагностики внелегного туберкулеза.
